王琦 劉旭靜 胡玉娟 宋德剛 田桂珍 劉玉林

糖尿病腎?。―KD）是慢性腎臟疾病的主要原因，是糖尿病患者最嚴重的微血管病變之一。DKD以蛋白尿、腎小球基底膜增厚、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化為特征，最終導致終末期腎病[1]。近年來，研究表明腎臟纖維化可發(fā)生在DKD 的早期階段，是DKD 的重要病理變化，其涉及的分子學機制尚未明確，而Apelin-13 作為一種脂肪因子，在DKD纖維化的進展中可能發(fā)揮重要作用[2]。α-平滑肌肌動蛋白（SMA）是常用于標記腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的分子之一，本實驗通過單側(cè)腎切除聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導構(gòu)建DKD 大鼠模型，探索該模型的制備過程及成模形態(tài)，并分析Apelin-13 對α-SMA 表達的影響以及在DKD 纖維化中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料選取6～7 周齡SPF 級SD 雄性大鼠28只，體200～260g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。STZ（北京索萊寶科技有限公司）；水合氯醛粉末、組織固定液（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；大鼠Apelin-13 蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；Apelin-13 試劑（美國Sigma 公司）；尿微量白蛋白試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；肌酐測定試劑盒（四川新健康成生物股份有限公司）；血糖儀和血糖試紙（長沙三諾生物傳感股份有限公司）；兔源α-SMA 多克隆抗體（美國Cell Signaling 公司）；鼠源GAPDH單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；引物（青島蔚來生物科技有限公司）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB green 熒光染料（日本TAKARA 公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 28 只大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分成4 組：假手術(shù)組、單側(cè)腎切組、DKD 組（單側(cè)腎臟切除+STZ 45mg/kg 腹腔注射）和Apelin-13 組（在DKD 組基礎上腹腔注射Apelin-13），每組7 只。腎臟切除術(shù)：采用2%利多卡因（10mL/kg）腹腔注射麻醉，逐層切開入腹，切除右腎。假手術(shù)組小鼠逐層分離皮膚、黏膜、肌肉3 層，不切除腎臟，直接逐層縫合。等待1 周，腹部傷口愈合后，DKD 組和Apelin-13 組大鼠在禁食不禁水12h 后，腹腔一次性注射濃度為1%的STZ 45mg/kg，另兩組腹腔注射同體積的檸檬酸鹽緩沖溶液。72h 后，大鼠尾尖采血，用血糖儀測定兩次隨機血糖，結(jié)果≥16.7mmol/L 可認定為糖尿病模型成功。Apelin-13 組在糖尿病模型成功的基礎上，腹腔注射Apelin-13（20μg/kg）8周，留取腎組織。

1.2.2 大鼠體重和血糖的測定 大鼠注射STZ 3d，成模4、6、8 周后，用電子秤測定大鼠體重；剪取大鼠尾尖，用血糖儀測定大鼠隨機血糖，并用碘伏消毒，抗生素預防感染。

1.2.3 尿微量白蛋白/肌酐比值測定 留取成模8周后大鼠尿液，3 000rpm 離心5min 后，取上清液，使用尿微量白蛋白測定試劑盒和肌酐測定試劑盒分別檢測尿微量白蛋白和肌酐的數(shù)值，然后計算兩者的比值。

1.2.4 Apelin-13 水平的測定 8 周后采集大鼠血液，用大鼠Apelin-13 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定血清Apelin-13 水平。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度，計算樣品濃度。

1.2.5 組織病理變化 固定、修剪組織，不同濃度的酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，用蘇木精-伊紅（HE）或Weigent 蘇木素-麗春紅-品紅（MASSON）染色，封片，正置白光拍照顯微鏡下觀察組織的病理改變。

1.2.6 α-SMA DNA 水平的測定 小剪刀剪取20μg腎組織，采用TRIzol 試劑提取總RNA，測定RNA 的濃度，將RNA 樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時熒光定量PCR 法定量α-SMA 的表達水平，計算CT 值。

1.2.7 α-SMA 蛋白水平測定 取腎組織30μg，用組織裂解液提取總蛋白，BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。采用蛋白免疫印跡法（Western blot）配膠、上樣、電泳分離，將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜。1×TBST洗膜3 次，每次10min。二抗常溫孵育1h，再洗膜3次，然后用ECL 發(fā)光液顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法運用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，兩兩比較采用單因素方差分析或重復測量方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 單側(cè)腎切除聯(lián)合STZ 誘導DKD 對大鼠體重和血糖的影響注射STZ 3d 后，各組大鼠體重無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；DKD 建模成功后4、6、8 周DKD 組大鼠體重增長緩慢，甚至出現(xiàn)負增長趨勢，與假手術(shù)組和單側(cè)腎切組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。假手術(shù)組和單側(cè)腎切組的血糖維持在正常水平，平均值約5.8mmol/L，而DKD 組大鼠血糖升高，平均值約26.6mmol/L，明顯高于假手術(shù)組和單側(cè)腎切組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 單側(cè)腎切除聯(lián)合STZ 誘導DKD 對大鼠微量白蛋白/肌酐比值和血清Apelin-13 水平的影響與假手術(shù)組和單側(cè)腎切組相比，DKD 組第8 周的尿微量白蛋白/肌酐比值明顯升高（P<0.05）。與假手術(shù)組相比，單側(cè)腎切組和DKD 組血清Apelin-13 水平下降，且DKD 組下降趨勢最明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表1 單側(cè)腎切除聯(lián)合STZ 誘導DKD 大鼠的體重和血糖變化（）

表1 單側(cè)腎切除聯(lián)合STZ 誘導DKD 大鼠的體重和血糖變化（）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與單側(cè)腎切組比較，bP<0.05

表2 單側(cè)腎切除聯(lián)合STZ誘導DKD大鼠的尿微量白蛋白/肌酐比值和血清Apelin-13水平變化（）

表2 單側(cè)腎切除聯(lián)合STZ誘導DKD大鼠的尿微量白蛋白/肌酐比值和血清Apelin-13水平變化（）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與單側(cè)腎切組比較，bP<0.05

2.3 各組病理結(jié)果比較HE 染色顯示：假手術(shù)組大鼠腎小球中細胞數(shù)量、基質(zhì)均勻，腎小管上皮細胞圓潤、飽滿，刷狀緣排列整齊規(guī)則，間質(zhì)無明顯增生，未見明顯的炎性改變；單側(cè)腎切組可見多處腎小管擴張；DKD 組大鼠腎組織中可見大量腎小管擴張、腎小管上皮細胞變性，胞質(zhì)透明化、腎小管萎縮，伴有結(jié)締組織增生和淋巴細胞浸潤；Apelin-13 組個別毛細血管腔內(nèi)充血藍色細小顆粒物質(zhì)，其余未見明顯異常。MASSON 染色顯示：假手術(shù)組和單側(cè)腎切組未見明顯膠原纖維增生；DKD 組可見多處膠原纖維增生；Apelin-13 組膠原纖維減少。見圖1。

2.4 各組α-SMA mRNA 水平比較實時熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組和單側(cè)腎切組相比，DKD 組α-SMA mRNA 水平升高；與DKD 組相比Apelin-13 組α-SMA mRNA 水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.5 各組α-SMA 蛋白水平比較Western blot 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組和單側(cè)腎切組相比，DKD 組α-SMA蛋白水平表達最高；與DKD 組相比，Apelin-13 組α-SMA 蛋白表達減少。見圖3。

圖1 各組大鼠腎組織的HE 和MASSON 染色

圖2 各組大鼠腎臟α-SMA mRNA 的表達

圖3 各組大鼠腎臟α-SMA 蛋白的表達

3 討論

DKD 是終末期腎臟疾病最常見病因，臨床發(fā)現(xiàn)DKD 的進展常伴有蛋白尿。腎臟纖維化是DKD 的重要病理特點。本研究顯示DKD 組大鼠在第8 周時尿蛋白明顯增多，染色顯示多處膠原纖維增生。這與Wang 等[3]研究結(jié)果一致，該研究表明在DKD大鼠腎間質(zhì)纖維化增多，DKD 分子標志物的表達增加。腎臟纖維化的機制非常復雜，目前尚未完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)DKD 大鼠給予Apelin-13 腹腔注射后，腎臟纖維化減少。也有研究報道Apelin-13反應性升高，對腎臟纖維化的關鍵靶分子轉(zhuǎn)化生長因子-β 的阻斷作用增強，緩解慢性間歇性缺氧引起的腎臟纖維化，對腎臟起到一定的保護作用[4]。

Apelin-13 是脂肪細胞分泌的一種脂肪細胞因子，與腎纖維化相關[4]。在細胞中加入Apelin-13外源性刺激，可以顯著降低轉(zhuǎn)化生長因子-β 誘導的鈣黏蛋白E 表達和增加α-SMA 表達，且呈劑量依賴性[5]。α-SMA 作為肌纖維母細胞的標志蛋白，可用于評估腎間質(zhì)纖維化損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)DKD 組α-SMA mRNA 和蛋白水平明顯升高，但腹腔給予Apelin-13 注射后，α-SMA mRNA 和蛋白水平下降，這揭示了外源性Apelin-13 刺激在改善纖維化中發(fā)揮著重要作用。血漿中的Apelin-13也可能在纖維化中發(fā)生變化。當發(fā)生纖維化時，血漿Apelin-13 表達水平降低，這一理論在肝臟纖維化和心肌纖維化中得到了驗證[6，7]。Apelin-13 是Apelin 的一個亞型，在血液中分布最廣泛。實驗中，我們檢測了3 組大鼠的血清Apelin-13 水平，發(fā)現(xiàn)相比于假手術(shù)組，單側(cè)腎切組和DKD 組血清Apelin-13 水平下降，且DKD 組Apelin-13 水平下降更明顯。Xu 等[8]研究表明，單側(cè)腎臟切除時，腎臟會發(fā)生纖維化，在單側(cè)輸尿管梗阻模型中，腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化與腎功能障礙的關系比腎小球損傷更為密切。當合并糖尿病時，纖維化程度進一步加重，所以本研究發(fā)現(xiàn)DKD 組大鼠血清Apelin-13 水平表達最低。

本研究通過探討單側(cè)腎切除聯(lián)合STZ 誘導的DKD 大鼠模型，分析DKD 誘導成功后腎臟纖維化的變化。并研究了脂肪細胞因子Apelin-13 對DKD 纖維化的影響。這對于DKD 的分子機制探討有一定的參考價值，為臨床上DKD 的預防和治療提供了重要的研究思路。