董 薇,余永亮,楊紅旗,許蘭杰,譚政委,楊 青,李 磊,安素妨,魯?shù)さ?梁慧珍

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心,河南鄭州 450002)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale),又名黑節(jié)草,為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物,鐵皮石斛是珍貴的中草藥,具有極高的保健功效,性甘,微寒,歸胃、腎經(jīng),益胃生津,滋陰清熱[1]。鐵皮石斛是我國珍貴的國家級二級保護植物,對生長環(huán)境要求苛刻,自然繁殖率很低,常規(guī)分株扦插等繁殖方式效率低,耗時長,不能滿足生產(chǎn)需要,因此大多采用組織培養(yǎng)方式繁殖鐵皮石斛種苗以滿足生產(chǎn)需求[2-6]。該研究以河南鐵皮石斛的種子為外植體,以馬鈴薯泥為培養(yǎng)基添加物,對種子組培實生苗的培養(yǎng)過程加以優(yōu)化,為河南鐵皮石斛種質(zhì)資源開發(fā)及工廠化育苗提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料鐵皮石斛種子采摘自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玻璃溫室,人工授粉后選擇八成熟的蒴果。

1.2 培養(yǎng)條件該試驗采用1/2MS、MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度6-BA、NAA、馬鈴薯泥,培養(yǎng)基中蔗糖為30 g/L,瓊脂為6 g/L,pH為5.8～6.0。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃,光照2 000 lx,時間16 h/d。

1.3 試驗方法

1.3.1材料消毒。將鐵皮石斛蒴果先用毛刷在流水下洗凈,在超凈工作臺上,先用75%乙醇浸泡30 s,再用84消毒液浸泡10 min,用無菌水沖洗3～4次后置于無菌濾紙上晾干水分。

1.3.2種子萌發(fā)。用剪刀剪開一端,將種子倒在滅菌水里,每瓶用移液槍吸取1 mL均勻撒在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。以1/2MS+10 g/L馬鈴薯泥作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加不同濃度的NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L),分析不同濃度激素組合對鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響。每個處理10瓶,重復(fù)3次。暗培養(yǎng)3 d促進種子萌發(fā),隨后光照培養(yǎng)。

1.3.3原球莖增殖分化。將種子萌發(fā)獲得的原球莖接種在繼代培養(yǎng)基上。有機添加劑可以減少新生組織褐化并促進原球莖增殖,繼代培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。添加不同濃度激素組合6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)、NAA(0.3、0.5、1.0 mg/L)和有機物(20、40、60、80 g/L馬鈴薯泥),觀察每種培養(yǎng)基中原球莖增殖情況。每處理20瓶,每瓶接種5個原球莖,3次重復(fù),培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計增殖情況,培養(yǎng)90 d后統(tǒng)計原球莖分化生長情況。

1.3.4生根壯苗。選取繼代增殖中3 cm左右、長勢一致的幼苗,轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中,以MS+1.0 g/L活性炭為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加不同濃度NAA和馬鈴薯泥,每種培養(yǎng)基接種20瓶,每瓶接5株,3次重復(fù),培養(yǎng)90 d。

1.3.5煉苗移栽。當(dāng)生根苗長至3～5 cm且有3～4片葉時,即可煉苗移栽。將培養(yǎng)瓶置于溫室煉苗7 d,取出試管苗,用清水洗凈幼苗根部培養(yǎng)基,置于通風(fēng)陰涼處1 h晾干水分。將煉苗后的試管苗移栽到松樹皮基質(zhì)中并澆透水,之后基質(zhì)保持一定濕度即可。鐵皮石斛喜濕、耐寒,移栽環(huán)境需陰涼,避免陽光直射,空氣相對濕度不低于80%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度激素對鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響培養(yǎng)10 d后,陸續(xù)可見鐵皮石斛種子萌發(fā),種胚黃綠色并逐漸增大,培養(yǎng)28 d后,大部分種胚顏色轉(zhuǎn)綠并進一步膨大,可見圓錐狀葉原基。統(tǒng)計結(jié)果(表1)表明,4種培養(yǎng)基都能使鐵皮石斛種子萌發(fā),并生長成圓錐狀原球莖。比較幾種培養(yǎng)基的萌發(fā)時間和長勢可知,只添加馬鈴薯泥萌發(fā)時間長,且原球莖生長較慢,個體偏小,且原球莖誘導(dǎo)出現(xiàn)少量黃綠色。培養(yǎng)基中添加NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時,鐵皮石斛種子萌發(fā)時間明顯縮短,原球莖綠色,隨著培養(yǎng)基中添加NAA質(zhì)量濃度增加,鐵皮石斛種子萌發(fā)時間變短,且原球莖生長變快,顏色變綠,但當(dāng)NAA添加質(zhì)量濃度為0.3 mg/L時,隨著培養(yǎng)時間的延長,原球莖部分出現(xiàn)半透明狀。因此,1/2MS+10 g/L馬鈴薯泥+0.2 mg/L NAA更有益于鐵皮石斛種子萌發(fā),該培養(yǎng)基中鐵皮石斛種子萌發(fā)快,顏色深綠,長勢旺盛。

2.2 不同濃度激素對鐵皮石斛原球莖增殖和分化的影響從表2可以看出,在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA和NAA均能促進鐵皮石斛原球莖增殖和分化。6-BA濃度在1.0～2.0 mg/L,鐵皮石斛原球莖增殖和分化系數(shù)整體呈上升趨勢,培養(yǎng)基添加不同濃度6-BA和NAA組合,鐵皮石斛原球莖增殖生長和分化生長有一定區(qū)別,6-BA在同一濃度水平時,隨著NAA濃度的升高原球莖增殖率增加而分化系數(shù)先增加后減少,而且,當(dāng)6-BA和NAA添加量分別達到2.0和1.0 mg/L時,培養(yǎng)90 d出現(xiàn)部分玻璃化。MS添加2.0 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA更適合原球莖增殖、分化,原球莖增殖過程中顏色深綠,新生原球莖飽滿,分化成苗后苗色濃綠,生長旺盛。

表2 不同濃度激素對鐵皮石斛原球莖增殖和分化的影響Table 2 Effects of different concentrations of hormones on the proliferation and differentiation of Dendrobium officinale protocorms

2.3 添加馬鈴薯泥對鐵皮石斛原球莖增殖和分化的影響從表3可以看出,培養(yǎng)基中添加馬鈴薯泥,鐵皮石斛原球莖增殖和分化速度沒有明顯變化,但是隨著馬鈴薯泥添加量的增加,添加馬鈴薯泥培養(yǎng)基中原球莖更加膨大,顏色更深,在培養(yǎng)90 d后,分化的幼苗高度略有降低,但幼苗莖粗增加、葉片更大。馬鈴薯泥在原球莖增殖階段能夠明顯增加增殖系數(shù),在分化階段,雖然添加馬鈴薯泥后分化系數(shù)增加,但是增加系數(shù)低于增殖過程中的系數(shù)。添加量在80 g/L時,由于馬鈴薯本身所含淀粉,培養(yǎng)基質(zhì)地較硬,因此最終選擇馬鈴薯泥添加量為60 g/L。

2.4 鐵皮石斛組培苗生根培養(yǎng)從表4可以看出,鐵皮石斛幼苗生根馬鈴薯泥添加量的增加根長先增加后減少,隨著NAA濃度增加根數(shù)明顯增多,結(jié)合表4中2種添加物對鐵皮石斛壯苗生根的綜合影響,1/2MS+1.0 g/L活性炭+0.5 mg/L NAA+40 g/L馬鈴薯泥幼苗長勢最好。

表3 添加馬鈴薯泥對鐵皮石斛原球莖增殖和分化的影響Table 3 Effect of adding mashed potato on the proliferation and differentiation of Dendrobium officinale protocorms

2.5 鐵皮石斛馴化移栽煉苗7 d后,鐵皮石斛葉色轉(zhuǎn)深,莖稈明顯粗壯,根系生長,即可移栽。移栽時選擇直徑1.0～1.5 cm的松樹皮基質(zhì),可在表面覆蓋苔蘚以保濕,移栽后大棚濕度在85%左右直至新葉長出,成活率達到90%以上。

表4 添加物對鐵皮石斛壯苗生根的影響Table 4 Effects of additives on the rooting of Dendrobium officinale seedlings

3 討論與小結(jié)

石斛屬植物組織培養(yǎng)中常利用的外源激素主要是BA、ZT和KT等細胞分裂素類和NAA、IAA、IBA等生長素類[7],楊立昌等[8]研究表明6-BA濃度在3.0 mg/L時原球莖誘導(dǎo)效果最好,而張雪梅等[9]研究表明6-BA濃度超過1.0 mg/L原球莖生長受到抑制。張華通等[10]研究表明6-BA與NAA對石斛種子的誘導(dǎo)效果不同,6-BA更有利于原球莖的增殖,而NAA對芽苗的生長更有益?，F(xiàn)在石斛屬植物組織培養(yǎng)過程中有機添加物主要是蘋果、香蕉、椰汁、馬鈴薯、蛋白胨等。俞涵曦等[11]研究表明幾種有機添加物中40 g/L馬鈴薯對串珠石斛原球莖增殖分化的促進效果最好。

該試驗以鐵皮石斛種子為材料,以馬鈴薯泥為有機添加物,研究了鐵皮石斛種子萌發(fā)到原球莖增殖和分化,再到組培苗壯苗生根和煉苗移栽過程中不同培養(yǎng)基激素添加配比的影響。研究結(jié)果表明,1/2MS+10 g/L馬鈴薯泥+0.2 mg/L NAA更有益于鐵皮石斛種子萌發(fā),MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+60 g/L馬鈴薯泥適合鐵皮石斛原球莖增殖和分化,原球莖深綠,長勢旺盛,分化出的幼苗莖葉深綠,粗壯旺盛。壯苗生根階段最終選擇1/2MS+1.0 g/L活性炭+0.5 mg/L NAA+40 g/L馬鈴薯泥,鐵皮石斛幼苗生長健壯,移栽易成活。