程忠泉,葉紅慶,馮月燕,楊 丹

(1.廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院,廣東廣州 510450;2.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣東東莞 523808)

石崖茶系山茶科(Theaceae)楊桐屬(Adinandra)植物亮葉楊桐(AdinandranitidaMerr.ex Li)的干燥葉[1],又名猴茶、石芽茶、石巖茶等,分布于廣西、廣東、貴州等地,生長于海拔500～1 000 m的溝谷溪邊、林緣、林中或石巖邊[2]。石崖茶味甘、微苦,性涼,歸肝、膽、胃經(jīng)。石崖茶不含咖啡堿,茶色碧綠,飲后有回甘[3],不影響睡眠[4],具有抗菌、抗腫瘤、護(hù)肝明目、消炎、清熱解毒、養(yǎng)顏、降血壓、健胃消食等作用[5-6],可用于目赤腫痛、目暗干澀、癰瘡腫毒、黃疸等[7],在壯、瑤、苗、侗等少數(shù)民族地區(qū)有著悠久的使用歷史[8],常用于治療咽喉炎、腮腺炎、肥胖癥、糖尿病、高血壓、高血脂、痢疾等疾病[9-10]。石崖茶含茶堿量低,黃酮含量高,有很高的開發(fā)利用價(jià)值,榮獲“中國名優(yōu)茶葉”[11]稱號(hào)。該研究對(duì)石崖茶水提取物經(jīng)大孔樹脂用不同濃度乙醇洗脫后各部分的抗氧化活性進(jìn)行分析,以進(jìn)一步挖掘該植物的研究與應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試劑。DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、維生素C、1,10-鄰菲啰啉、鄰苯三酚、Na2HPO4、NaH2PO4、硫酸亞鐵銨[FeSO4(NH4)2SO4]、H2O2、鐵氰化鈉、三氯乙酸、FeCl3、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、乙醇等,以上試劑均為分析純。

1.1.2儀器。TU-1901雙波長紫外分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;電子分析天平,青島精誠儀器儀表有限公司;101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱,天津市泰斯儀器有限公司;501型超級(jí)恒溫水浴鍋,上海試驗(yàn)儀器有限公司。

1.1.3試材及其處理。石崖茶于2020年6月采自桂林平樂。石崖茶干燥后粉碎,稱取100 g,1 000 mL水80 ℃熱提2次,每次1 h,合并提取液,放冷后上大孔吸附樹脂,分別以0、50%、70%、100%乙醇沖洗,濃縮干燥后得各濃度乙醇沖洗物粉末。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1DPPH自由基清除率的測定。

1.2.1.1VC對(duì)DPPH自由基的清除率。精密稱取DPPH粉末0.010 g,用95%乙醇溶解并定容至100 mL,配制成0.1 mg/mL的乙醇樣液。取7個(gè)10 mL容量瓶,分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的0.1 mg/mL 的VC,然后再分別向7個(gè)容量瓶中加入1.0 mL 0.1 mg/mL 的DPPH溶液,搖勻,用95%乙醇定容至刻度。室溫下,暗處反應(yīng)30 min,然后在517 nm波長處迅速測其吸光度,以不加樣液溶液為空白,用乙醇溶液參比,計(jì)算出VC對(duì)DPPH自由基的清除率,公式如下:

(1)

式中:A0為不加樣液時(shí)的吸光度;A樣為加VC的吸光度。

1.2.1.2樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。分別精密稱取50%、70%、100%乙醇沖洗的石崖茶大孔樹脂洗脫物0.010 0 g樣品粉末,用95%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成0.1 mg/mL樣品溶液。取7個(gè)10 mL容量瓶,分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的0.1 mg/mL的樣品溶液,測定吸光度,并計(jì)算各洗脫物對(duì)DPPH自由基的清除率,計(jì)算公式如下:

(2)

式中:A0為不加樣液時(shí)的吸光度;A樣為加DPPH的吸光度;A樣0為樣品本身的本底值。

1.2.2羥基自由基清除率的測定。

1.2.2.1溶液配制。

(1)溶液Ⅰ。分別取10 mmol/L的FeSO4溶液、10 mmol/L的H2O2溶液、30 mmol/L的水楊酸乙醇溶液各100 mL,依次加至棕色瓶中,振蕩搖勻,于37 ℃烘箱中恒溫15 min。

(2)溶液Ⅱ。分別取10 mmol/L的FeSO4溶液、蒸餾水、30 mmol/L的水楊酸乙醇溶液各100 mL,依次加至棕色瓶中,振蕩搖勻,于37 ℃烘箱中恒溫15 min。

(3)VC或樣品溶液。精密稱取10 mg VC或樣品粉末,用95%乙醇溶解并定容至10 mL,配制成1 mg/mL VC或樣品溶液。

1.2.2.2VC對(duì)羥基自由基的清除率。取6個(gè)10 mL容量瓶,先向容量瓶中加入5.0 mL溶液Ⅰ,再依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的1 mg/mL的VC溶液,以蒸餾水定容至10 mL,搖勻,然后將6個(gè)容量瓶一起置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min,以不加VC溶液為空白溶液,用蒸餾水做參比,在510 nm測定吸光度,并計(jì)算出VC對(duì)DPPH自由基的清除率,公式如下:

(3)

式中:A0為以蒸餾水代替VC的吸光度;A樣為加VC的吸光度。

1.2.2.3樣品對(duì)羥基自由基的清除率。取6個(gè)10 mL容量瓶,分別加入5.0 mL溶液Ⅰ,然后再分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的1.0 mg/mL的樣品溶液,用蒸餾水定容至刻度;另取6個(gè)10 mL容量瓶,分別加入溶液Ⅱ,然后再分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的1 mg/mL的樣品溶液,用蒸餾水定容至刻度。一起置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min,以蒸餾水做參比,以不加樣液為空白溶液,于510 nm處測定吸光度,并計(jì)算出各溶液對(duì)羥基自由基的清除率,公式如下:

(4)

式中:A0為以蒸餾水代替樣液的吸光度;A樣為加樣液的吸光度;A樣0為樣液本身的本底值。

1.2.3超氧陰離子自由基清除率的測定。

1.2.3.1VC和樣品溶液的配制。精密稱取VC或樣品粉末0.001 0 g,用乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成0.1 mg/mL VC或樣品溶液。

1.2.3.2VC和樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率。取7個(gè)10 mL容量瓶,分別加入5.0 mL預(yù)先于25 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱20 min的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH = 8.0),然后分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的0.1 mg/mL的VC或樣品溶液,再分別加入0.5 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液,充分混勻后置于25 ℃恒溫烘箱中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min,立即加入10 mmol/L濃鹽酸終止反應(yīng),于420 nm處測定吸光度。以相同體積的蒸餾水代替樣液做空白試驗(yàn),用蒸餾水做參比。VC和樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率計(jì)算見公式(1)和公式(2)。

1.2.4還原能力的檢測。

1.2.4.1溶液配制。精密稱取VC或樣品粉末0.005 g,用乙醇溶解并定容至10 mL,再從中移取1 mL定容至10 mL,最終配制成0.05 mg/mL VC或樣品溶液。

1.2.4.2VC和樣品的吸光度。取7個(gè)10 mL容量瓶,分別向其加入1.0 mL pH = 6.6的緩沖溶液,再分別加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL的0.05 mg/mL的VC或樣品溶液,然后再分別加入1.0 mL 1%鐵氰化鉀(淡黃色)溶液,在50 ℃恒溫烘箱中反應(yīng)20 min,冷至室溫,再加入1.0 mL 10%三氯乙酸,如有沉淀,混合后以3 000 r/min分離10 min,取上層清液2.0 mL,加入0.5 mL 0.1% 的三氯化鐵溶液(普魯士藍(lán)),混勻,用蒸餾水定容至10 mL,在700 nm處測吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品對(duì)DPPH自由基的清除率由圖1可知,石崖茶各乙醇洗脫物對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而增大,且均低于對(duì)照品VC。石崖茶70%乙醇洗脫物對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng),濃度在0.006 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率為68.8%;其次是50%乙醇洗脫物,濃度在0.006 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率為42.6%;100%乙醇洗脫物對(duì)DPPH自由基的清除能力最弱,濃度在0.006 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率僅為13.6%。

圖1 不同乙醇濃度大孔樹脂洗脫物對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH radical by macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

2.2 樣品對(duì)羥基自由基的清除率由圖2可知,石崖茶各乙醇洗脫物對(duì)羥基自由基的清除率隨濃度的增加而增大,且均低于對(duì)照品VC。石崖茶100%乙醇洗脫物有較強(qiáng)的清除能力,但在濃度為0.25 mg/mL時(shí),對(duì)羥基自由基的清除率仍僅為34.6%;50%和70%的乙醇洗脫物對(duì)羥基自由基的清除率相近,在濃度為0.25 mg/mL時(shí),對(duì)羥基自由基的清除率分別為15.2%、18.5%。

圖2 不同乙醇濃度大孔樹脂洗脫物對(duì)羥基自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of p-hydroxy radical by macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

2.3 樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率由圖3可知,石崖茶各乙醇洗脫物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨濃度的增加而增大,且均低于對(duì)照品VC。石崖茶50%乙醇洗脫物有較強(qiáng)的清除能力,但在濃度為0.025 mg/mL時(shí),對(duì)超氧陰離子自由基的清除率仍僅為48.4%。70%和100%的乙醇洗脫物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率相近,在濃度為0.025 mg/mL時(shí),對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別為27.7%、14.6%。

圖3 不同乙醇濃度大孔樹脂洗脫物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of superoxide anion radical by macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

2.4 樣品的還原能力由圖4可知,石崖茶各乙醇洗脫物還原能力隨濃度的增加而增大,且均低于對(duì)照品VC。石崖茶70%乙醇洗脫物有較強(qiáng)的還原能力,50%和100%的乙醇洗脫物的還原能力相近。

圖4 不同乙醇濃度大孔樹脂洗脫物的還原能力Fig.4 Reduction ability of macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

3 結(jié)論

該研究對(duì)石崖茶水提取物經(jīng)大孔樹脂用不同濃度乙醇洗脫后各部分的抗氧化活性進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%、70%、100%乙醇洗脫物的DPPH自由基的清除率最高值分別為42.6%、68.8%、13.6%,對(duì)羥基自由基的清除率最高值分別為15.2%、18.5%、34.6%,對(duì)超氧陰離子自由基的清除率最高值分別為48.4%、27.7%、14.6%,以上3種濃度的乙醇洗脫物還原能力均不及VC。70%乙醇洗脫物具有較好的DPPH自由基清除率(68.8%),各洗脫物對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基清除率及還原能力較弱。通過對(duì)石崖茶水提取物抗氧化活性的測定,進(jìn)一步挖掘該植物的研究價(jià)值,有助于推動(dòng)該種植物資源的學(xué)術(shù)研究及社會(huì)價(jià)值的挖掘,積極推進(jìn)民族地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展。