潘 永,楊 莉,李 婷,莫本田,李 剛,趙 濱,唐遠(yuǎn)江,楊粵黔,孫啟躍,徐景峨

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,貴州貴陽 550005)

近年來,在貴州省大力推動(dòng)羊產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的背景下,羊存欄數(shù)截至2022年3月已突破390萬只。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,疾病防控壓力也日益增大,特別是羊病毒性疾病,因其傳播快,致死率高,對(duì)羊養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。羊口蹄疫、羊口瘡和山羊痘是分別由口蹄疫病毒、羊口瘡病毒和山羊痘病毒引發(fā)的疫病,引種、免疫失敗、新變異病毒株是感染上述病毒的常見因素[1-3]。由于3種疾病在臨床上有類似的特征,加之混合感染存在,給臨床診斷造成困難。因此,快速鑒別診斷對(duì)防控上述3種羊病具有重要意義。

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)、羊口瘡(Contagious ecthyma,CE)和山羊痘(Goat pox,GTP)疫病在臨床上存在類似癥狀?？谔阋呤怯煽谔阋卟《?foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,俗稱“口瘡”。家養(yǎng)或野生偶蹄動(dòng)物為該病毒的易感動(dòng)物,臨床表現(xiàn)為唇、舌面、內(nèi)面、齒齦、臉頰部黏膜、四肢下端和乳房處等無毛部位形成水皰,水皰破潰后形成紅色潰爛,嚴(yán)重時(shí)蹄殼脫落,導(dǎo)致動(dòng)物跛行[4]。羊口瘡是由羊口瘡病毒(Orf virus,ORFV)引起的一種接觸性、嗜上皮性傳染病,可通過接觸傳播。山羊、綿羊、鹿科及駱駝科等其他反芻類動(dòng)物為該病的易感動(dòng)物,臨床表現(xiàn)為口、舌、唇、乳房和鼻鏡等皮膚部位形成膿皰、水泡和結(jié)痂[5]。山羊痘是由山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)引起的羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、結(jié)膜炎、鼻炎、過度流涎、皮膚黏膜發(fā)生皰疹和丘疹病變[6]。隨著養(yǎng)羊業(yè)的迅速發(fā)展,羊病的種類也開始增多且難以控制。另外,還存在多種病毒混合感染的現(xiàn)象,如顏新敏等[7]報(bào)道我國存在GTPV、ORFV及山羊傳染性胸膜肺炎混合感染羊的病例。

通過文獻(xiàn)查新發(fā)現(xiàn),目前尚缺乏同時(shí)針對(duì)FMDV、ORFV和GTPV的快速檢測(cè)方法。鑒于傳統(tǒng)檢測(cè)方法在檢測(cè)混合感染病例時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力且容易誤診,現(xiàn)急需建立一種同時(shí)針對(duì)FMDV、ORFV和GTPV的快速鑒別診斷方法。筆者旨在利用PCR技術(shù),建立可同時(shí)檢測(cè)FMDV、ORFV和GTPV的多重PCR方法,以期為未來流行病學(xué)調(diào)查和疾病防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料研究所涉及的ORFV、GTPV、FMDV疫苗株、藍(lán)舌病滅活病毒和小反芻獸疫病毒疫苗株、魏氏梭菌、羊結(jié)核桿菌和山羊支原體樣品均由實(shí)驗(yàn)室保存。臨床樣品包括132份抗凝血和8份已鑒定的羊口瘡陽性痂皮組織,于2021年12月至2022年11月采集自貴州地區(qū)各規(guī)模化養(yǎng)羊場(chǎng)。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備核酸提取試劑盒DNA/RNA Extraction Kit、膠回收試劑盒FastPure? Gel DNA Extraction Mini Kit、質(zhì)粒提取試劑盒RapidLyse Plasmid Mini Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA聚合酶混合物2 × AceTaqMaster Mix(Dye Plus)、基因克隆載體ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit和DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞均為諾維贊產(chǎn)品;DL2000 DNA Marker為天根公司產(chǎn)品;PCR儀為BIO-RAD產(chǎn)品;凝膠電泳儀為北京六一公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)下載NCBI中已上傳的不同血清型FMDV全基因序列、ORFV全基因序列和GTPV全基因序列,利用clustlW軟件對(duì)同一病毒不同血清型基因序列進(jìn)行多序列比對(duì),在保守性高的區(qū)域設(shè)計(jì)引物并由生工生物工程股份有限公司合成。引物信息及預(yù)擴(kuò)增目的片段大小見表1。

表1 引物序列Table 1 Information of primer sequences used

1.4 核酸提取病毒樣品和待檢臨床樣品核酸的提取均使用DNA/RNA提取試劑盒,DNA樣品保存于-20 ℃,RNA樣品隨即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,所獲cDNA產(chǎn)物于-20 ℃保存,剩余RNA 于-80 ℃保存。

1.5 目的片段的擴(kuò)增及克隆分別以FMDV、ORFV和 GTPV病毒樣品DNA/cDNA為模板,利用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2 × AceTaqMaster Mix 12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,DNA/cDNA模板2.0 μL,最后ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收并純化。參照諾維贊ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit試劑盒方法分別將回收產(chǎn)物與載體連接,轉(zhuǎn)化至DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,挑取重組子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將陽性重組質(zhì)粒分別命名為pFMDV、pORFV和pGTPV,測(cè)定各質(zhì)粒濃度并計(jì)算拷貝數(shù)。

1.6 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化以重組質(zhì)粒pFMDV、pORFV和pGTPV為模板,對(duì)反應(yīng)體系中的模板和引物用量以及反應(yīng)程序中的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,以ddH2O作為陰性對(duì)照模板,通過觀察瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,確定多重PCR的最佳反應(yīng)體系和條件。

1.7 特異性試驗(yàn)在已提取獲得DNA/cDNA模板的基礎(chǔ)上,ddH2O作為陰性對(duì)照模板,pFMDV、pORFV和pGTPV質(zhì)粒作為陽性對(duì)照,利用優(yōu)化后的多重PCR方法分別對(duì)藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒、魏氏梭菌、羊結(jié)核桿菌和山羊支原體進(jìn)行檢測(cè),以判斷該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn)將pFMDV、pORFV和pGTPV質(zhì)粒稀釋至同一拷貝數(shù)量級(jí)并等比例混合,以10倍梯度稀釋混合物并作為模板,檢測(cè)多重PCR方法的最低檢測(cè)限,ddH2O作為陰性對(duì)照模板。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)將pFMDV、pORFV、pGTPV混合物等比例混合并作為模板,通過多重PCR反應(yīng)方法檢測(cè)重復(fù)性,重復(fù)試驗(yàn)3次。分別將FMDV疫苗株、ORFV和GTPV病原分離物混合后勻漿,提取總RNA和總DNA,總RNA隨即反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA和總DNA混合物為模板,通過多重PCR反應(yīng)方法檢測(cè)重復(fù)性,重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.10 臨床樣品的檢測(cè)所檢測(cè)臨床樣品包括采集的132份抗凝血、8份陽性羊口瘡痂皮病料按照100 μL病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清和200 μL陰性全血混合分別制備3份ORFV模擬樣品和1份GTPV模擬樣品,將FMDV疫苗株10倍稀釋后與200 μL陰性全血混合制備1份FMDV模擬樣品,將3種病毒液等量混合后取100 μL和200 μL陰性全血制備2份混合型模擬樣品。提取樣品核酸用該試驗(yàn)建立的多重PCR與常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMDV、ORFV、GTPV三重PCR反應(yīng)建立與優(yōu)化通過對(duì)引物和模板用量以及退火溫度的優(yōu)化,確定了該多重PCR最佳反應(yīng)體系為2 × AceTaqMaster Mix 12.5 μL,FMDV上下游引物終濃度200 nmol/L,ORFV引物上下游引物終濃度400 nmol/L,GTPV上下游引物終濃度200 nmol/L,質(zhì)粒、cDNA/DNA模板均為1.5 μL,ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

為明確多重PCR最佳反應(yīng)程序,在最佳反應(yīng)體系確定的基礎(chǔ)上,對(duì)退火溫度進(jìn)行梯度優(yōu)化處理,瓊脂糖凝膠電泳以及測(cè)序結(jié)果顯示,54～58 ℃均可同時(shí)擴(kuò)增出3條大小正確的目的條帶,當(dāng)退火溫度為57 ℃時(shí),目的片段產(chǎn)量較高、引物二聚體較少(圖1)。結(jié)果表明,57 ℃可作為反應(yīng)程序的最佳退火溫度,PCR最佳反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min。

注:M.DL 2 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.53.0 ℃;2.53.3 ℃;3.54.0 ℃;4.54.9 ℃;5.56.1 ℃;6.57.0 ℃;7.57.6 ℃;8.58.0 ℃;9.陰性對(duì)照。Note:M.DL 2 000 DNA marker;1.53.0 ℃;2.53.3 ℃;3.54.0 ℃;4.54.9 ℃;5.56.1 ℃;6.57.0 ℃;7.57.6 ℃;8.58.0 ℃;9.Negative control.圖1 多重PCR退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of multiplex PCR annealing temperature

利用優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系及條件檢測(cè)質(zhì)粒pFMDV、pORFV和pGTPV單一或等比例混合模板,以模擬7種陽性檢測(cè)結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳以及測(cè)序結(jié)果顯示,該法檢測(cè)單一或混合質(zhì)粒模板,目的條帶類型及大小均與預(yù)期相符(圖2)。結(jié)果表明,該法可正確檢測(cè)出FMDV、ORFV和GTPV的單一或混合感染。

注:M.DL 2 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pFMDV、pORFV、pGTPV混合;2.pFMDV;3.pORFV;4.pGTPV;5.pFMDV、pORFV混合;6.pFMDV、pGTPV混合;7.pORFV、pGTPV混合;8.陰性對(duì)照。Note:M.DL 2 000 DNA marker;1.Mixtures of pFMDV,pORFV and pGTPV;2.pFMDV;3.pORFV;4.pGTPV;5.Mixtures of pFMDV and pORFV;6.Mixtures of pFMDV and pGTPV;7.Mixtures of pORFV and pGTPV;8.Negative control.圖2 單一或混合質(zhì)粒模板的多重PCR檢測(cè)Fig.2 Multiplex PCR detection of single or mixed plasmid templates

2.2 特異性試驗(yàn)通過建立的多重PCR方法檢測(cè)5種非FMDV、ORFV和GTPV羊源病原體,以檢驗(yàn)該法的特異性。結(jié)果顯示,與pFMDV、pORFV和pGTPV作為模板的陽性對(duì)照相比,5種羊源病原體無預(yù)擴(kuò)增條帶(圖3)。結(jié)果表明,利用該法檢測(cè)FMDV、ORFV和GTPV,特異性較好。

注:M.DL 2 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pFMDV、pORFV、pGTPV混合;2.pFMDV;3.pORFV;4.pGTPV;5.藍(lán)舌病病毒;6.小反芻獸疫病毒;7.魏氏梭菌;8.羊結(jié)核桿菌;9.山羊支原體;10.陰性對(duì)照。Note:M.DL 2 000 DNA Marker;1.pFMDV,pORFV,pGTPV mixed;2.pFMDV;3.pORFV;4.pGTPV;5.BTV;6.PPRV;7.Clostridium weisseri;8.M.tuberculosis;9.Mycoplasma capricolum;10.Negative control.圖3 多重PCR檢測(cè)不同羊常見病原的特異性試驗(yàn)Fig.3 Multiplex PCR detection of common pathogens in different sheep

2.3 敏感性試驗(yàn)為檢測(cè)多重PCR方法對(duì)模板的最低檢測(cè)限,對(duì)pFMDV、pORFV和pGTPV不同數(shù)量級(jí)拷貝數(shù)模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增(圖4)。結(jié)果顯示,當(dāng)pFMDV和pGTPV數(shù)量級(jí)為103～108拷貝/μL,pORFV數(shù)量級(jí)為104～108拷貝/μL時(shí)均可擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶。結(jié)果表明,該法對(duì)pFMDV和pGTPV最低檢測(cè)數(shù)量級(jí)為103拷貝/μL,對(duì)pORFV則為104拷貝/μL。

注:M.DL 2 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～8分別為108～101拷貝/μL的pFMDV、pORFV、pGTPV混合物;9.陰性對(duì)照。Note:M.DL 2 000 DNA Marker;1-8.The pFMDV,pORFV and pGTPV mixtures are available at concentrations of 108-101 copies per microliter;9.Negative control.圖4 多重PCR敏感性試驗(yàn)Fig.4 Susceptibility test for multiplex PCR

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)通過對(duì)重組質(zhì)粒的混合物以及FMDV疫苗株、ORFV和GTPV病原混合物進(jìn)行多重PCR檢測(cè),檢驗(yàn)該法的重復(fù)性(圖5)。瓊脂糖凝膠電泳以及測(cè)序結(jié)果顯示,該法對(duì)重組質(zhì)粒混合物或FMDV疫苗株、ORFV和GTPV陽性組織樣品混合物的3次試驗(yàn),均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶。結(jié)果表明,該法具有較好的重復(fù)性。

注:M.DL 2 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～3.pFMDV、pORFV、pGTPV混合物(1∶1∶1);4～6.FMDV疫苗株、ORFV和GTPV混合核酸提取物;7.陰性對(duì)照。Note:M.DL 2 000 DNA Marker;1-3.Mixtures of pFMDV,pORFV and pGTPV(1∶1∶1);4-6.FMDV vaccine strain and nucleic acid mixtures of ORFV and GTPV;7.Negative control.圖5 多重PCR重復(fù)性試驗(yàn)Fig.5 Reproducibility of multiplex PCR

2.5 臨床樣品檢測(cè)應(yīng)用常規(guī)PCR和建立的多重PCR方法對(duì)132份全血樣品、7份全血模擬樣品和8份陽性羊口瘡痂皮組織進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,多重PCR方法檢出全血樣品ORFV 感染病例1例,檢出模擬樣品FMDV 3份、ORFV5份、GTPV3份以及FMDV、ORFV 和GTPV的混合全血模擬樣品2份,檢出組織樣品ORFV 感染8份。與常規(guī)PCR檢查結(jié)果符合率為100%(表2)。

表2 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of clinical samples

3 討論

多重 PCR(Multiplex polymerase chain reaction,MPCR)是指通過一次反應(yīng)可同時(shí)擴(kuò)增出2個(gè)或以上的靶基因,因其低成本、高效率、高通量而被廣泛應(yīng)用。該技術(shù)目前在疾病診斷和科學(xué)研究等領(lǐng)域應(yīng)用較多。

多重PCR相較于常規(guī)PCR有諸多優(yōu)勢(shì),同時(shí)也存在著一些不足。該研究在對(duì)多重PCR敏感性檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),對(duì)FMDV和GTPV的最低檢測(cè)限達(dá)到103數(shù)量級(jí)的拷貝,而對(duì)ORFV需要104,通過總結(jié)前人建立的多重PCR方法發(fā)現(xiàn),僅有少數(shù)建立的多重PCR檢測(cè)限能達(dá)到102數(shù)量級(jí)拷貝[8-9]。該研究在檢測(cè)臨床樣品時(shí),全血樣品僅檢出1例ORFV感染,檢出率較低,但不能排除血液樣本病毒載量低,致使核酸模板未達(dá)到該多重PCR方法的最低檢測(cè)限的可能。而使用該方法檢測(cè)羊口瘡陽性病料,檢出率為100%。上述結(jié)果提示,使用該研究建立的多重PCR檢測(cè)ORFV、ORFV和GTPV時(shí),病料的采集應(yīng)盡可能取病毒載量較高的痂皮、水皰皮、水皰液和丘疹。若病原體難以培養(yǎng),RNA或DNA提取率較低,如支原體、衣原體等病原,則需利用敏感性更高,檢測(cè)限可至100數(shù)量級(jí)的科學(xué)工具[10-11]。勾倩倩等[12]建立了一種針對(duì)藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒、ORFV和GTPV的基于TaqMan探針技術(shù)的多重?zé)晒舛縋CR方法,在檢測(cè)病原時(shí)具有較好的特異性,并且對(duì)4種病原的最低檢出量分別達(dá)到17、12、8和9 拷貝/μL。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,基于熒光染料、熒光探針、微流控和于固相載體的多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)將成為未來核酸多重檢測(cè)的重要研究方向,在疾病檢測(cè)方面扮演著重要角色[13-17]。

秦敏等[18]曾建立了藍(lán)舌病、FMDV、小反芻獸疫和水泡性口炎的多重PCR檢測(cè)方法,何亞鵬等[19]建立了涉及FMDV、藍(lán)舌病、小反芻獸疫的多重RT-PCR方法,在臨床應(yīng)用上都有著較好的效果。因羊痘在西北地區(qū)較為流行,何亞鵬等[20]建立了針對(duì)綿羊痘病毒、GTPV及ORFV的多重PCR檢測(cè)方法。盡管前人有關(guān)多重PCR的研究均涉及FMDV、ORFV和GTPV,但尚缺乏針對(duì)FMDV、ORFV以及GTPV病原進(jìn)行系統(tǒng)多重PCR檢測(cè)方法研究的相關(guān)報(bào)道。而該研究通過多項(xiàng)試驗(yàn)驗(yàn)證,建立了一種可同時(shí)檢測(cè)FMDV、ORFV和GTPV的多重PCR方法,為這3種病毒的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查等研究提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

該研究建立了可同時(shí)檢測(cè)FMDV、ORFV和GTPV的多重PCR方法,該方法具有較高的敏感性和特異性,可用于羊病的流行病學(xué)調(diào)查、鑒別診斷和疫情防控。