楊宏 吳文元 趙廣澤

（北京工業(yè)大學(xué)城市建設(shè)學(xué)部 北京 100124）

0 引言

高鹽對生物脫氮技術(shù)有著很大的影響，反硝化細菌作為細胞結(jié)構(gòu)本身會受到滲透壓的影響，而且高鹽會抑制細菌的正常生長代謝，導(dǎo)致細菌脫氮能力降低甚至消失。在現(xiàn)有的工業(yè)生產(chǎn)中，像皮革生產(chǎn)、化肥制造、垃圾填埋、采油等行業(yè)產(chǎn)生的廢水為高鹽廢水［1］，用一般的活性污泥法進行處理時，細菌活性必然會受到抑制。DINCER 等［2］研究了鹽度對反硝化脫氮的影響，發(fā)現(xiàn)NaCl 濃度從0 提升至60 g/L 時，NO3--N 的去除率下降為原來的30%，可見鹽度對反硝化速率影響較大。反硝化細菌不是某一種細菌，而是具有反硝化能力的細菌集合。目前所知的反硝化細菌大約有50 多個屬，130 多個種［3］，其中也包括一部分嗜鹽菌，這部分反硝化菌可以在相對較高的鹽度下高效地發(fā)揮反硝化作用。有研究表明鹽單包菌（Halomonas）因產(chǎn)生滲透壓補償溶質(zhì)而具有適應(yīng)高鹽環(huán)境的能力，是中度嗜鹽菌的典型菌屬［4］。那么如何富集培養(yǎng)耐鹽反硝化細菌成為本次討論的重點。

本研究以實驗室初期篩選污泥為接種污泥，采用SBR 培養(yǎng)方式，探究污泥富集培養(yǎng)過程中污泥濃度、污泥量、反硝化速率等的變化規(guī)律，并結(jié)合高通量測序技術(shù)探究富集培養(yǎng)過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化，最終找出培養(yǎng)方案的不足并提出改進措施，以尋求高效可行的污泥培養(yǎng)方案。

1 材料與方法

1.1 接種污泥

污泥最初取自北京某污水處理廠回流污泥，經(jīng)過1 個月左右的篩選培養(yǎng)，污泥的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，其中反硝化菌屬以固氮弓菌屬（Azoarcus）為主，占比21.28%，Halomonas（12.4%）次之。本實驗將該污泥作為接種污泥。

1.2 實驗原水

實驗中發(fā)酵罐的體積為3 000 L，容積較大，故采用高濃度低流量進藥的方式。為了延長配藥周期，配制接近飽和的硝酸鹽原水，將碳氮比控制為3.3 左右，并加入微量元素［8］，以達到最佳的富集培養(yǎng)效果。具體配比見表1。

表1 實驗原水營養(yǎng)鹽配比

1.3 反應(yīng)裝置

發(fā)酵罐實驗室反應(yīng)裝置示意圖見圖1。

圖1 發(fā)酵罐裝置圖

如圖1 所示，污泥富集培養(yǎng)的主體裝置為3 000 L 的發(fā)酵罐，并設(shè)有pH、溫度在線監(jiān)測儀表，攪拌裝置，水浴加熱裝置等。通過PCL 自控設(shè)備控制發(fā)酵罐內(nèi)pH 為8.0～8.5 之間，溫度控制在25～30 ℃之間。設(shè)有懸浮標尺用以計算發(fā)酵罐內(nèi)混合液體積。罐體下端設(shè)有取泥口，中間部分設(shè)有取樣口，便于監(jiān)測污泥的增長狀態(tài)。

1.4 運行工況

反硝化細菌的培養(yǎng)采用SBR 運行方式，分為反應(yīng)、靜置、排水、進水4 個階段。攪拌強度視污泥濃度而定，一般設(shè)為13～20 r/min。

（1）反應(yīng)：根據(jù)上階段的反硝化效率，確定本階段的進藥流量；運行時硝酸鹽的積累量維持在20～30 mg/（L·h）。

（2）靜置：根據(jù)反應(yīng)速率和硝酸鹽、亞硝酸鹽的積累量，確定攪拌停止時間，再靜置30～60 min，待上清液清澈后，便可排水。

（3）排水：排水過程中為了防止污泥的流失，用潛水泵將上清液抽走。要避免水流攪動導(dǎo)致污泥浮動，確定污泥不流失的最低排水液面。

（4）進水：將事先配制好的高濃度硝酸鹽原水以流加的方式加入發(fā)酵罐，通過計量泵調(diào)節(jié)進水流量，使之與反硝化速率匹配。

1.5 分析項目及檢測方法

實驗過程中涉及到檢測指標包括：NO2--N、NO3--N、COD、混合液懸浮固體濃度（MLSS）、揮發(fā)性有機物濃度（MLVSS）、pH 和溫度等，均采用標準監(jiān)測方法進行測定［5］。樣品處理前每個水樣都經(jīng)過0.45 μm 濾膜的預(yù)處理，避免水樣中游離細菌及固體懸浮物的影響。為保證檢測真實有效，每個水樣均保證一式三份進行檢測。此外，采用16S rRNA 高通量測序技術(shù)對反硝化污泥中微生物菌群的多樣性及菌群結(jié)構(gòu)進行分析［6］，以探究反硝化菌群結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 富集培養(yǎng)過程中污泥的增長情況分析

如圖2 所示為反硝化污泥穩(wěn)定富集培養(yǎng)階段的相關(guān)數(shù)據(jù)，污泥培養(yǎng)采用SBR 模式周期運行，圖中1～4 d（Ⅰ），5～8 d（Ⅱ），10～13 d（Ⅲ），14～17 d（Ⅳ），18～21 d（Ⅴ），22～24 d（Ⅵ）分別對應(yīng)1 個運行周期。結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)，就污泥濃度、MLSS、MLVSS 進行如下分析。

圖2 富集培養(yǎng)過程中MLSS、MLVSS 污泥濃度的變化情況

2.1.1 污泥濃度分析

如圖2 所示，在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ3 個運行周期中，污泥濃度逐漸增大。需要說明的是，圖中的污泥濃度數(shù)值為不同體積下的實測值，說明在這3 個階段運行過程中，污泥增長迅速。對比Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ3 個周期，污泥濃度在周期內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢。不同的是Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ周期污泥濃度的基數(shù)相對較低，為7 000～14 000 mg/L之間，說明這個濃度范圍內(nèi)更有利于污泥的增長。當(dāng)污泥基數(shù)＞15 000 mg/L 時，污泥的比增長速率降低了。該結(jié)論與張鑫等［7］、何海超等［8］的研究結(jié)果相符。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是由于菌群密度較大，限制了污泥的生長。一方面，在高菌群密度情況下，反硝化速率較高，代謝產(chǎn)物分泌旺盛，再加上SBR 運行模式會導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的大量積累，代謝產(chǎn)物中存在有害物質(zhì)，限制了細菌的增長；另一方面，菌群之間會存在競爭生長，造成了環(huán)境容量限制。

2.1.2 MLSS 相關(guān)分析

有關(guān)MLSS 分析從兩方面展開，首先是運行周期內(nèi)MLSS的變化。由圖2 中MLSS 增長曲線可以看出，在Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ3 個周期中曲線的變化大致相同，整體呈現(xiàn)增長趨勢但是斜率越來越小，說明污泥的增長速率減慢，說明當(dāng)污泥濃度＞15 000 mg/L時不利于污泥增長。而在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ3 個周期中，MLSS 不僅整體呈現(xiàn)上升趨勢而且斜率也有所上升。如圖2 所示，在第2、12、15 天對應(yīng)的斜率較大，此時的污泥比增長速率最大，這3 d對應(yīng)的污泥濃度均在11 000～13 000 mg/L 之間，這與2.1.1 小節(jié)關(guān)于污泥比增長速率的分析存在交集，最終確定污泥比增長速率的最大值在12 000 mg/L 左右。其次是周期間的分析，在第14、18、22 天均存在MLSS 減少的情況，這是由于排水階段有污泥損失，第14 天減少MLSS 大約為4 000 g，第18、22 天減少量約為6 000 g，說明污泥濃度越大，污泥損失量越大。造成該現(xiàn)象的原因一方面是由于污泥濃度較大，可以允許排水的最低液位沒有及時做出調(diào)整，導(dǎo)致排水過程中泥面受到水力攪動，部分污泥隨之排出；另一方面，發(fā)酵罐中如果存在硝酸鹽的積累，會在靜置沉淀過程中反應(yīng)，再加上發(fā)酵罐中鹽度較大，細菌多以絮體的形式存在［9］，液體較為渾濁黏稠，產(chǎn)生的氣體不易從絮體表面脫落，致使絮體密度降低，污泥上浮，導(dǎo)致細菌流失。

2.1.3 MLVSS 相關(guān)分析

實驗過程中對MLVSS 進行檢測，以此來反映污泥中有機物占比，間接反映出菌量。如圖2 所示，每個時間點對應(yīng)的MLSS-MLVSS 為無機物的量。令A(yù)=MLSS-MLVSS，在每個運行周期內(nèi)，A 值都呈現(xiàn)增大趨勢，產(chǎn)生這個現(xiàn)象的原因是運行過程中存在鹽度積累。由于發(fā)酵罐容積較大，采用高濃度進水的方式，進水中除了一些有用的營養(yǎng)鹽被細菌消耗掉之外，還有一些其他離子，如鈉離子、鉀離子等，這些離子會在發(fā)酵液中積累，因此鹽度每個周期內(nèi)都會增加。第9 天時取泥，并對罐中污泥進行清洗，降低鹽度，所以第10 天時A 值較小，伴隨反應(yīng)的進行A 值增大，對應(yīng)的鹽度也越來越高。趙凱峰等［9］表明，污泥容積指數(shù)（SVI）隨著鹽度的升高而降低，與本實驗所得結(jié)論一致。6 個周期間，每個周期MLVSS 的量幾乎一致，也就是說在這6 個周期，雖然持續(xù)進藥，但MLVSS 沒有升高。這主要是由于SBR 運行模式下，細菌損失造成的。

2.2 反硝化速率的變化規(guī)律

污泥培養(yǎng)馴化階段硝化速率變化曲線見圖3。

圖3 污泥培養(yǎng)馴化階段反硝化速率變化曲線

如圖3 所示，污泥的反硝化速率呈現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢，第24 天時，反硝化速率達到300 mg/（L·h）。在第9 天時，反硝化速率有一個明顯的降低，一方面是取泥導(dǎo)致污泥量減少，從而使得整體反硝化速率降低；另一方面是由于洗泥造成的，自來水水溫較低并且水中含有少量余氯，會使得反硝化細菌活性受到抑制。結(jié)合比反硝化速率來看，倘若只是污泥減少導(dǎo)致的反硝化速率降低，那么比反硝化速率不會降低，然而實際比反硝化速率降低了，說明是兩者綜合作用的結(jié)果。實驗中比反硝化速率是以MLVSS 為基礎(chǔ)計算出來的，比反硝化速率呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢，最高可達到65 mg N/（g MLVSS·h），結(jié)合高通量測序可知是由于菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，優(yōu)勢菌群為鹽單胞菌（Halomonas），占比57.79%，該菌可以在較高的鹽度下高效地發(fā)揮反硝化作用。

2.3 微生物群落多樣性分析

2.3.1 菌群多樣性分析

培養(yǎng)前后樣本菌群結(jié)構(gòu)多樣性變化見表2。

表2 培養(yǎng)前后樣本菌群結(jié)構(gòu)多樣性變化

實驗過程中，為探究培養(yǎng)過程中污泥菌群結(jié)構(gòu)的變化，進行了高通量跟蹤測定，第1 天與第24 天進行取樣，分別命名為D1、D2。如表2 所示，D1 的Shannon 指數(shù)為4.33，大于D2的Shannon 指數(shù)，并且D1 的Simpson 指數(shù)低于D2 Simpson 指數(shù)，說明D1 的多樣性大于D2，也就是說運行24 d 后，菌群多樣性降低了。這主要是由于富集培養(yǎng)過程中條件（溫度、pH、底物類型等）單一，只有某幾種微生物在適宜的環(huán)境下生長，其他更多的微生物受到限制，從而降低了菌群多樣性。

2.3.2 優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)分析

D1、D2 樣本微生物菌群結(jié)構(gòu)（門水平）見圖4，D1、D2 樣本中微生物種類及占比情況（屬水平）見圖5。

圖4 D1、D2 樣本微生物菌群結(jié)構(gòu)（門水平）

圖5 D1、D2 樣本中微生物種類及占比情況（屬水平）

如圖4 所示，在門水平上，D1、D2 樣本沒有較大差異，都以Proteobacteria 為主，在D1、D2 樣本中分別占比85.7%、86.58%，LIAO 等［10］稱大多數(shù)的反硝化細菌屬于Proteobacteria菌門。其他菌門占比較低，應(yīng)該是由于單一環(huán)境下，其他菌門細菌的生長受到限制。

如圖5 所示，在屬水平上，D1 的反硝化菌屬以Azoarcus（21.28%）為主，Halomonas（12.4%）次之，經(jīng)過了24 d 的富集培養(yǎng)后，D2 的Halomonas 樣本占比57.79%，Azoarcus 占比降至7.95%。有報道稱Halomonas 菌屬可以在高鹽環(huán)境中進行高效的反硝化作用，并且對于亞硝酸鹽具有很強的耐受能力和還原能力［11-13］。物競天擇，適者生存，對于微生物而言亦是如此。可見該培養(yǎng)模式下，可以富集培養(yǎng)高效的耐鹽反硝化細菌。

3 結(jié)論

（1）當(dāng)污泥濃度超過15 000 mg/L 時，污泥的增長速率會下降。要想實現(xiàn)污泥的連續(xù)生產(chǎn)培養(yǎng)，污泥濃度應(yīng)控制在12 000 mg/L 左右，以獲得最大的污泥增長率。

（2）高濃度進藥的培養(yǎng)方式會導(dǎo)致鹽度積累，導(dǎo)致污泥容積指數(shù)（SVI）降低，無機組分含量升高。

（3）SBR 運行模式會存在污泥流失的風(fēng)險，在培養(yǎng)過程中應(yīng)注意把握好污泥沉降性、沉淀時間和允許排水最低液面三者之間的關(guān)系。

（4）富集培養(yǎng)過程中反硝化速率增長較快，比效率最高可達到65 mg N/（g MLVSS·h），并且菌群結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)過程中因鹽度積累發(fā)生變化，形成了以Halomonas 為主的耐鹽反硝化污泥。