楊合霖，劉霞飛,2，張穎，呂偉華，王念民，豐超杰，徐偉，曹頂臣

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省特殊生境魚類種質(zhì)特性與抗逆育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023）

我國鹽堿水域分布廣泛，尤其黑龍江省的碳酸型鹽堿水域資源豐富，極大制約了我國東北地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1]。為進一步拓展水產(chǎn)養(yǎng)殖空間和實現(xiàn)鹽堿水域魚類養(yǎng)殖增產(chǎn)，開發(fā)優(yōu)質(zhì)耐鹽堿魚類已經(jīng)成為近年來的重要研究課題[2]。鱘個體大、抗逆性強，廣鹽性，已被列為II 類鹽堿水養(yǎng)殖魚類，養(yǎng)殖技術(shù)相對成熟，已有多個高原和低洼等鹽堿水域成功養(yǎng)殖的實例，具有一定鹽堿馴化潛力[3-5]。雜交鱘“鱘龍1 號”（Huso dauricus♀×Acipenser schrenckii♂）為中國自主研發(fā)的第一個雜交鱘新品種，兼具生長快和性腺品質(zhì)高等優(yōu)勢，為優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖品種[6,7]。

水體堿度變化影響魚類的生長和發(fā)育[8-10]，甚至?xí){魚類的生存[11,12]，在過高的堿度下，養(yǎng)殖魚類的食用價值也會下降[13]。大量研究表明，魚類的Na+/K+-ATP 酶（Na+/K+-ATPase,NKA）響應(yīng)堿度的變化。當(dāng)堿度超過魚類的耐受范圍時，mRNA 表達水平下降，NKA 的酶活力減弱[14-16]。項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，在碳酸鹽堿度脅迫下“鱘龍1 號”鰓的Na+/K+轉(zhuǎn)運相關(guān)的代謝通路變化明顯，atp1α1 基因與atp1β1 基因表達下調(diào)，其中atp1α1 基因與atp1β1基因分別注釋到了NKA 蛋白的NKAα1 亞基和NKAβ1 亞基[17]。

NKA 為普遍存在于動物細胞膜上的跨膜結(jié)合蛋白，參與細胞膜內(nèi)外的Na+和K+運輸，可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的靜息電位與離子平衡[18]。NKAα 亞基為NKA 的催化亞基，是Na+與K+的結(jié)合位點。NKAα1為NKAα 的一種亞型[19,20]；NKAβ 亞基主要參與輔助NKAα 亞基正確折疊、靶向和插入到細胞膜，穩(wěn)定其構(gòu)型及調(diào)節(jié)其活性。NKAβ1 為NKAβ 的一種亞型[21-23]。研究證實，NKA在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[10]、松江鱸（Trachidermus fasciatus）[24]、大鱗鲃（Luciobarbus capito）[15]、俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti）[25]與大黃魚（Larimichthys crocea）[26]等魚類的滲透壓平衡與鹽堿適應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于鱘的研究較少。因此，本研究克隆了“鱘龍1 號”的atp1α1 基因與atp1β1 基因的cDNA全長序列，分析了其序列特征，比較了不同碳酸鹽堿度脅迫下atp1α1 基因和atp1β1 基因的表達特征，以期為揭示鱘科魚類耐鹽堿脅迫響應(yīng)機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及分組

本研究中涉及魚類處理的所有實驗均獲得了中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江漁業(yè)研究所動物護理和使用委員會（HRFRI）的批準(zhǔn)，并按照指南進行。30 日齡”鱘龍1 號”幼魚體長（133.17±16.75）mm，體質(zhì)量（12.43±3.99）g，取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚工程繁育中心。試驗前在水溫（17±2）℃、溶氧量大于6 mg L-1下暫養(yǎng)2 周。試驗分4 組，每組3 個重復(fù)，對照組為提前曝氣的自來水，實際測定堿度為（3.16±0.03）mmol·L-1（C 組）；依據(jù)II 類鹽堿水質(zhì)養(yǎng)殖魚類適應(yīng)堿度標(biāo)準(zhǔn)（SC/T 9406-2012）和前期預(yù)實驗結(jié)果，在3 個試驗組中添加99%純度的食用小蘇打（哈爾濱市呼蘭區(qū)三鑫制堿廠），實測堿度分別為（7.61±0.12）mmol·L-1（T1 組）、（12.10±0.05）mmol·L-1（T2 組）和（15.30±0.85）mmol·L-1（T3 組）。于養(yǎng)殖第30 d，采集對照組的鰓、皮膚、肌肉、心臟、肝臟、脾臟、頭腎、腸道、眼、胃和腎臟和3 個試驗組的鰓，每個重復(fù)各取5 尾混合，每組共采集15 尾魚，裝入凍存管后用液氮速凍，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 提取和cDNA 合成

采用北京康為世紀生物科技有限公司的試劑，采用Trizol 法提取總RNA，按照說明書方法操作。使用nanodrop 8000 儀器檢測各RNA 樣品的純度和濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，并于-80 ℃分裝保存?zhèn)溆?。以總RNA 為模板，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 的說明進行反轉(zhuǎn)錄，將合成的cDNA 稀釋1/10 后于-20 ℃分裝保存。

1.3 “鱘龍1 號”atp1α1 與atp1β1 基因的全長克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的部分CDS 序列設(shè)計引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司（蘇州）合成（表1）。采用5× Es Taq MasterMix（TaKaRa）進行PCR擴增，反應(yīng)程序為：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；終延伸2 ℃，延伸7 min；采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（CWBIO）對目的片段進行切膠回收，純化片段連接到pMD18-T載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)染至大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細胞（TaKaRa），在含Amp 的LB 固體平板培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)；采用菌落PCR 鑒定陽性克隆，送菌液至蘇州泓迅生物科技股份有限公司測序。

表1 實驗使用的引物及序列Tab.1 Sequences of primers used in the experiment

根據(jù)測序獲得的CDS 區(qū)的部分片段設(shè)計5’RACE 和3’RACE 的特異性引物（GSP 和NGSP）（表1），按 照SMARTer RACE 5’/3’Kit（TaKaRa，clontech）試劑盒的方法進行兩輪PCR 擴增，獲得5’/3’末端序列正確片段后，進行膠回收、連接載體、轉(zhuǎn)化、鑒定陽性及送測序。

1.4 “鱘龍1 號”atp1α 與atp1β 基因的序列分析

使用DNAMAN 軟件將atp1α1 與atp1β1 基因的5’RACE 和3'RACE 測序結(jié)果與部分CDS 區(qū)進行拼接與去冗余，得到cDNA 全長序列；采用NCBI ORF finder 平臺分析開放閱讀框并翻譯為相應(yīng)的氨基酸序列，用NCBI 中的BLAST 程序比對獲得的序列；使用蛋白在線分析系統(tǒng)（Expert Protien Analysis System,Ex PASy）分析氨基酸序列的理化參數(shù)；使用在線分析平臺（SOPMA）分析蛋白二級結(jié)構(gòu)等信息；用TMHMM Server v.2.0 預(yù)測蛋白跨膜區(qū)；用Net-Phos-3.1 平臺預(yù)測磷酸化位點，分數(shù)閾值為0.5；采用Mega7 軟件和最大似然法（Maximum-Likehood）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap Replications 為1 000。

1.5 實時熒光定量PCR 檢測atp1α 與atp1β 基因的表達

根據(jù)CDS 序列設(shè)計定量引物（表1），以不同堿度組的鰓、對照組鰓、皮膚和肌肉等11 個組織提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 作為熒光定量PCR模板，以β-actin 基因為內(nèi)參，使用ABI 7500（Applied Biosystems，USA）熒光定量PCR 儀，并采用TB GreenPremix Ex TaqTMII（TaKaRa）試劑盒，按照說明書進行實驗操作。相對表達量的結(jié)果采用2-ΔΔCT的方法計算，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。使用Excel 2019 軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，使用SPSS 22 軟件進行單因素方差分析及Dunnett 多重比較，顯著性水平為P<0.05。使用GraphPad Prism9進行表達水平結(jié)果可視化。為保證試驗的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，設(shè)15 個生物重復(fù)，5 個生物重復(fù)為一個混樣，并做3 個技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 “鱘龍1 號”atp1α1 和atp1β1 基因的cDNA 全長序列信息

本研究擴增獲得“鱘龍1 號”的atp1α1 基因和atp1β1 基因均為單一產(chǎn)物，無多態(tài)性擴增。其中atp1α1 基因的cDNA 全長序列為3 417 bp（GenBank登錄號為OM808728），其中5’端非編碼區(qū)（5’UTR）為126 bp，3’端非編碼區(qū)（3’UTR）為207 bp，開放閱讀框（ORF）為3 084 bp，共編碼1 027 個氨基酸（圖1）；atp1β1 基因的的cDNA 全長序列為2 170 bp（GenBank 登錄號為OM808729），其中5'UTR 為180 bp，3'UTR 為1 075 bp，ORF 為915 bp，共編碼304 個氨基酸（圖2）。

圖1 “鱘龍1 號”atp1α1 基因序列Fig.1 Sequence of atp1α1 gene of the hybrid sturgeon

圖2 “鱘龍1 號”atp1β1 基因cDNA 全長序列Fig.2 Full-length cDNA sequence of atp1β1 gene of the hybrid sturgeon

2.2 “鱘龍1 號”atp1α1 與atp1β1 基因的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

對atp1α1 與atp1β1 基因的開放閱讀框蛋白質(zhì)的預(yù)測結(jié)果顯示，NKAα1 蛋白質(zhì)分子式為C5041H803N1337O1498S52，相對分子質(zhì)量為113.01KDa，理論PI 值為5.37；NKAβ1 蛋白質(zhì)分子式為C1578H2428N412O457S10，相對分子質(zhì)量為34.80KDa，理論PI 值為8.80；跨膜結(jié)構(gòu)與蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，NKAα1 蛋白有8 個跨膜區(qū)，跨膜片段為TM1（102～124 aa）、TM2（134～153 aa）、TM3（294～316 aa）、TM4（326～348 aa）、TM5（854～876 aa）、TM6（917～936 aa）、TM7（957～974 aa）與TM8（989～1 005 aa）。NKAβ1 蛋白有1 個跨膜區(qū)，跨膜片段為TM（34～56 aa）（圖1～ 圖3）；蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測結(jié)果顯示，NKAα1 與NKAβ1 蛋白均以絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）為潛在磷酸化位點（圖4）。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，NKAα1與NKAβ1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋與無規(guī)則卷曲，β-轉(zhuǎn)角僅局部分布（圖5）。

圖3 “鱘龍1 號”NKAα1 和NKAβ1 跨膜蛋白Fig.3 Transmembrane protein of NKAα1 and NKAβ1 of the hybrid sturgeon

圖4 “鱘龍1 號”NKAα1 和NKAβ1 氨基酸潛在磷酸化位點Fig.4 Potential phosphorylation sites of amino acids of NKAα1 and NKAβ1 of the hybrid sturgeon

圖5 “鱘龍1 號”NKAα1 和NKAβ1 蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure of protein of NKAα1 and NKAβ1of the hybrid sturgeon

2.3 NKAα1 與NKAβ1 蛋白的同源性分析

系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，“鱘龍1 號”的NKAα1蛋白和NKAβ1 蛋白與小體鱘（Acipenser ruthenus）的親緣關(guān)系最近（圖6、圖7）。其中“鱘龍1 號”的NKAα1 蛋白與小體鱘、匙吻鱘（Polyodon spathula）、葦棲多鰭魚（Erpetoichthys calabaricus）、鱷雀鱔（Atractosteus spatula）、歐洲鰻鱺（Anguilla_anguilla）和大海鰱（Megalops_cyprinoides）的同源性較高（圖6）；“鱘龍1 號”的NKAβ1 蛋白與小體鱘、匙吻鱘、噬人鯊（Carcharodon carcharias）、點紋斑竹鯊（Chiloscyllium punctatum）、鯨鯊（Rhincodon typus）和虎紋貓鯊（Scyliorhinus torazame）的的同源性較高（圖7）。

圖6 “鱘龍1 號”NKAα1 與其他魚類NKAα1 的系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of NKAα1 between the hybrid sturgeon and other fish

圖7 “鱘龍1 號”NKAβ1 與其他魚類NKAβ1 的系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of NKAβ1 between the hybrid sturgeon and other fish

2.4 “鱘龍1 號”atp1α1 和atp1β1 基因的組織表達 特征

采用熒光定量PCR 方法檢測“鱘龍1 號”的atp1α1 基因和atp1β1 基因的組織表達特征。結(jié)果顯示，atp1α1 基因和atp1β1 基因在鰓、皮膚、肌肉、心臟、肝臟、脾臟、頭腎、腸道、眼、胃和腎臟中均表達，其中atp1α1 基因在鰓中表達水平最高，其次為腎臟和腸，鰓與其他組織的表達量均差異顯著（P<0.05）；atp1β1 基因在心臟中表達水平最高，其次為肝臟、腸、腎臟和鰓等組織（圖8）。

圖8 “鱘龍1 號”atp1α1 基因與atp1β1 基因組織表達差異Fig.8 Tissue expression difference of atp1α1 gene and atp1β1 gene in the hybrid sturgeon

2.5 不同堿度下“鱘龍1 號”鰓atp1α1 基因和atp1β1 基因的表達特征

不同碳酸鹽堿度下，“鱘龍1 號”鰓中atp1α1 基因和atp1β1 基因的表達特征顯示，atp1α1 基因的表達水平隨堿度升高呈先上升后下降趨勢，其中T1組的atp1α1 基因表達水平顯著高于對照組（P<0.05），T2 組與T3 組的atp1α1 基因表達水平均低于對照組，差異不顯著（P>0.05）；atp1β1 基因的表達水平隨堿度升高而下降，組間表達水平差異不顯著（P>0.05）（圖9）。

圖9 “鱘龍1 號”鰓atp1α1 與atp1β1 基因在不同堿度下的表達特征Fig.9 Expression characteristics of atp1α1 and atp1β1 genes in gill of the hybrid sturgeon exposed to different alkalinities

3 討論

鱘形目魚類的染色體核型復(fù)雜，鱘魚的基因組大小與染色體倍型仍有爭議。主流觀點認為達氏鰉核型為四倍體，施氏鱘核型為八倍體。然而雜交鱘“鱘龍1 號”的染色體核型仍尚未被闡明，這給雜交鱘的基因研究工作增加一定了難度[27]。研究證實，動物遠緣雜交后代的表型和基因型都會發(fā)生改變，表現(xiàn)為介于父母本的雜交特征。在雌性白鯽（Carassius auratus cuvieri Temminck et Schlegel）和雄性紅鯽的雜交研究中，其雜交子代序列兼有雙親特異堿基位點，表現(xiàn)出了重組現(xiàn)象[28,29]。本研究發(fā)現(xiàn)，雜交鱘“鱘龍1 號”的atp1α1 基因和atp1β1 基因無多態(tài)性擴增，推測其基因重組穩(wěn)定，但由于目前親本基因組信息較少，雜交子代的基因重組機制仍有待進一步研究。由于動物雜交導(dǎo)致易遺傳水平的基因組失衡，故不同倍體雜交也可能發(fā)生不兼容現(xiàn)象[30]，但在生產(chǎn)實踐中，“鱘龍1 號”的子代兩性可育，表型穩(wěn)定遺傳，可能得益于鱘科魚類復(fù)雜的染色體倍型，符合孫大江等的猜想[27]。

魚類的NKA 主要由分子量約為100 KDa 的α催化亞基和分子量約為40 KDa 的β 輔助亞基組成[31]。其中，云斑尖塘鱧（Oxyeleotris marmorata）[32]的NKAα1 亞基分子量為112.5 KDa，攀鱸（Anabas testudineus）[33]的NKAα1 亞基分子量為113 KDa，遮目魚（Chanos Chanos）[34]的NKA α1 亞基分子量為100 kDa，NKA β1 亞基分子量為40 KDa。與其它魚類的研究結(jié)果相似。本研究中，“鱘龍1 號”的NKAα1 亞基分子量為113.01 KDa，NKA β1 亞基分子量為34.80 KDa。NKA 在執(zhí)行離子轉(zhuǎn)運功能的過程中，需要通過cAmp 依賴性蛋白激酶（PKA）和蛋白激酶C（PKC）等的作用下被磷酸化和去磷酸化，改變NKA 亞基的構(gòu)型，而泵入鉀離子和泵出鈉離子[18]。NKA 磷酸化位點的分布與數(shù)量具有物種差異性，如攀鱸NKA 亞基的磷酸化位點為絲氨酸（Ser），果蠅（Drosophila virilis）的磷酸化位點為蘇氨酸（Thr），在NkAα1 和NkAβ1 中保守[35]。本研究中，“鱘龍1 號”的NKA 具有多個潛在磷酸化位點，包括絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr），與攀鱸NKA 功能相同。鱘NKA 磷酸化位點數(shù)量決定了其較強的鹽堿適應(yīng)能力。

研究證實，NKA 中的α1 亞基與β1 亞基廣泛分布于魚類的各組織中[36,37]。本研究中，“鱘龍1 號”atp1α1 和atp1β1 基因在鰓、心臟等11 個組織中均有分布，其中atp1β1 基因在心臟與肝臟中高表達，推測其可能參與調(diào)控心肌與肝臟中的生物過程[38,39]。魚類在響應(yīng)非等滲透介質(zhì)脅迫時會發(fā)生不同的NKA表達模式。對遮目魚[35]、鳉（Oryzias latipes）[40]與攀鱸[41]等魚類的研究結(jié)果表明，鰓中NKAα1 和NKAβ1 參與了滲透壓轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)，且NKAα1 和NKAβ1 亞基的mRNA 表達水平與蛋白質(zhì)含量在魚類由海水至淡水轉(zhuǎn)移過程中逐漸升高，被視為“高滲介質(zhì)NKA 低表達型”魚類，而對瓦氏雅羅魚（Leuciscus waleckii）[42]的研究結(jié)果表明，其NKA 活性隨鹽堿濃度增加而增加，被視為“高滲介質(zhì)NKA高表達型”魚類。與遮目魚[35]等魚類相似，“鱘龍1號”鰓組織中atp1α1 和atp1β1 基因的mRNA 表達水平隨堿度上升而下降，堿度達到12.10 mmol·L-1時均開始低于對照組水平，推測“鱘龍1 號”為“高滲介質(zhì)NKA 低表達型”魚類。值得注意的是，堿度為7.61 mmol·L-1的條件下，“鱘龍1 號”的鰓中atp1α1 基因的mRNA 表達水平顯著高于對照組和高堿度組（P<0.05），而atp1β1 基因的表達水平無顯著變化。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大西洋鮭（Salmo salar）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）等鮭科魚類逐漸暴露于海水中時，在Nka1b 基因的mRNA 表達水平上升之前，NKA 活性已經(jīng)增強，表明NKAα 亞基可能已經(jīng)優(yōu)先發(fā)生響應(yīng)[18,43]。與鮭科魚類相似，“鱘龍1 號”的NKAα 亞基在低堿度下優(yōu)先發(fā)生響應(yīng)，而NKAβ亞基作為輔助亞基，起到穩(wěn)定NKAα 亞基構(gòu)型及調(diào)節(jié)NKAα 亞基活性的作用，變化不明顯。當(dāng)堿度上升到12.10 mmol·L-1時，atp1α1 基因的mRNA 表達水平下降，推測NKA 功能已受阻，該結(jié)果與大鱗鲃[15]相似。

綜上所述，雜交鱘“鱘龍1 號”NKAα1 和NKAβ1 具有高度保守區(qū)域，與小體鱘的親緣關(guān)系最近；atp1α1 和atp1β1 基因表達具有組織表達特異性，其中atp1α1 基因在鰓組織中表達水平最高，atp1β1 基因在心臟中表達水平為最高。不同碳酸鹽堿度下，“鱘龍1 號”的atp1α1 基因在堿脅迫下優(yōu)先發(fā)生響應(yīng)，表明NKA 參與了“鱘龍1 號”的碳酸鹽堿度脅迫應(yīng)答。