曹桂云，寧波，向陽(yáng)，張永清，劉興村，莊雪松，孟兆青，黃蒙蒙，張風(fēng)超

1.山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司中藥研究院 濟(jì)南市專家工作站，濟(jì)南 250103；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，濟(jì)南 250355

蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)的干燥分泌物,多于夏、秋二季捕捉蟾蜍,洗凈,擠取耳后腺和皮膚腺的白色漿液,加工、干燥,即得蟾酥的功能為解毒、止痛、開(kāi)竅醒神,常用于癰疽疔瘡、咽喉腫痛、中暑神昏以及痧脹腹痛吐瀉的治療[1]．現(xiàn)代藥理研究表明,蟾酥具有抗腫瘤、強(qiáng)心、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種作用,近年被用于治療急性心力衰竭、慢性支氣管炎、坐骨神經(jīng)痛等[2-9]．

目前市場(chǎng)上蟾酥質(zhì)量差異較大,一方面所控制成分含量差異較大,另一方面成分之間的組成比例相差較大[10],究其原因可能與產(chǎn)地、加工方法、種質(zhì)等因素有關(guān)[11]．地理環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)地蟾酥的質(zhì)量雖有一定報(bào)道,但由于產(chǎn)地溯源問(wèn)題、樣本量問(wèn)題及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)低的問(wèn)題,導(dǎo)致數(shù)據(jù)不完善甚至存在相互矛盾的地方[12-19]．為此,本試驗(yàn)建立特征圖譜和多成分一測(cè)多評(píng)方法[20],從源頭出發(fā),比較不同產(chǎn)地蟾酥特征圖譜的相似度,進(jìn)行聚類分析和主成分分析[20-24],并檢測(cè)日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量,分析蟾酥藥材的品質(zhì)和產(chǎn)地的關(guān)系,更全面了解我國(guó)蟾酥藥材資源特點(diǎn),并為蟾蜍養(yǎng)殖提供依據(jù)．

1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需的儀器主要有：Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent科技有限公司);DZF-6090型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);XS105電子天平(METTLER TOLEDO);KDM型可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)．

試驗(yàn)樣品及試劑：華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)分別為110803-201807,110718-201809,111981-201501,純度分別為99.6%,98.0%,99.2%),日蟾毒它靈對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號(hào)為170913,純度≥98%),蟾毒它靈對(duì)照品(上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司,批號(hào)為3425,純度≥98%)．乙腈為色譜純,水為屈臣氏純凈水,其他試劑為分析級(jí)．蟾酥由本司到吉林、遼寧、黑龍江、江蘇、四川、河南、山東、河北實(shí)地采集得到,所有樣品均由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張永清教授鑒定為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)的干燥分泌物．樣品信息見(jiàn)表1．

表1 蟾酥產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對(duì)照品適量,加甲醇稀釋,制成濃度分別為51.597 0,102.508 0,87.198 0,97.020 0,51.793 0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液．

2.1.2 供試品溶液的制備

分別對(duì)提取方式、提取溶劑、提取時(shí)間和稱樣量等進(jìn)行考察,確定供試品制備方式如下：取本品細(xì)粉約25 mg,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇20 mL,稱定重量,加熱回流1 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得．

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長(zhǎng)為250 mm,內(nèi)徑為4.6 mm,粒徑為5 μm);以乙腈-0.3%乙酸溶液為流動(dòng)相,梯度洗脫：0～15 min,28%～54%乙腈;15～35 min,54%乙腈;柱溫為30 ℃;流速為每分鐘0.6 mL;檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm．理論板數(shù)按華蟾酥毒基峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000．分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL,注入高液相色譜儀,測(cè)定,即得．

2.3 HPLC特征圖譜研究

2.3.1 方法學(xué)考察

取蟾酥供試品溶液、空白溶劑按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,陰性樣無(wú)干擾,方法專屬性良好(圖1)．按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖．以峰8為參照峰,各標(biāo)識(shí)峰相對(duì)保留時(shí)間RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差)為0.16%～0.41%,相對(duì)峰面積的RSD為0.07%～0.84%,表明該方法重復(fù)性良好．不同分析人員在不同時(shí)間利用另一臺(tái)高效液相色譜儀,再次進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)．分析兩次重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果,各標(biāo)識(shí)峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.16%～0.95%,相對(duì)峰面積的RSD為0.10%～1.02%,表明該方法中間精密度良好．分別在0 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h,測(cè)定同一供試品溶液．以峰8為參照峰,各標(biāo)識(shí)峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.47%～1.82%,相對(duì)峰面積的RSD為0.15%～2.03%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好．采用Agilent 1260和waters e2695兩種高效液相色譜系統(tǒng),4根色譜柱測(cè)定同一供試品溶液,各標(biāo)識(shí)峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.96%～1.46%,相對(duì)峰面積的RSD為1.99%～2.57%;采用不同流速和不同柱溫測(cè)定同一供試品溶液,各標(biāo)識(shí)峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為1.87%～2.05%,峰面積的RSD為0.98%～1.85%．以上結(jié)果表明方法耐用性良好．

1.日蟾毒它靈;4.蟾毒它靈;7.蟾毒靈;8.華蟾酥毒基;9.脂蟾毒配基．圖1 專屬性色譜圖

2.3.2 特征圖譜的建立及檢測(cè)

將24批蟾酥樣品以“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”疊加色譜圖見(jiàn)圖2,對(duì)照特征圖譜見(jiàn)圖3．選擇出峰穩(wěn)定、峰形和分離度較好的9個(gè)共有峰作為特征峰,經(jīng)對(duì)照品對(duì)照,確定峰1為日蟾毒它靈,峰4為蟾毒它靈,峰7～9為蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基．

圖2 24批蟾酥特征圖譜

采用多點(diǎn)校正后對(duì)共有峰進(jìn)行Mark匹配并進(jìn)行相似度分析,24批次蟾酥樣品特征圖譜相似度為0.136～0.996,四川樣本與其他各省樣品相似度最低．對(duì)相同產(chǎn)地樣品特征圖譜進(jìn)行比較：HLJ1和HLJ2,特征圖譜相似度>0.9;JL1-JL3,特征圖譜相似度>0.9;LN1和LN5與其他遼寧批次蟾酥特征圖譜相似度小,LN2,LN3,LN5批次相似度>0.9;SD4與其他山東批次特征圖譜相似度較小,其余山東批次相似度>0.8;HN1和HN2特征圖譜相似度較小,為0.300;JS1和JS2特征圖譜相似度>0.9;SC1和SC3特征圖譜相似度為0.86,SC2和SC1和SC3特征圖譜相似度較小,分別為0.535和0.539．對(duì)不同產(chǎn)地樣品特征圖譜進(jìn)行比較：不同省份樣品差異性較大,但1批河南樣品(HN1)、1批四川樣品(SC3)、1批山東樣本(SD5)特征圖譜相似度大于0.9．以上結(jié)果表明,不同產(chǎn)地蟾酥樣品成分差異較大,相同產(chǎn)地蟾酥樣品相似性相對(duì)較好,但也有同一省份的蟾酥樣品差異性較大的情況(表2)．說(shuō)明蟾酥作為動(dòng)物來(lái)源藥材質(zhì)量不可控性因素復(fù)雜,除地域因素外,可能受藥材基原、動(dòng)物個(gè)體間差異及蟾酥產(chǎn)地加工等影響較大[7,13-14]．

1.日蟾毒它靈;4.蟾毒它靈;7.蟾毒靈;8(S).華蟾酥毒基;9.脂蟾毒配基．圖3 對(duì)照特征圖譜

表2 24批蟾酥樣品特征圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

以峰8為參照峰(S),各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.00%～2.62%,9個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間差異較小,均在平均值±10%范圍內(nèi),選擇相對(duì)保留時(shí)間的平均值作為規(guī)定值．規(guī)定值為：0.38(峰1)、0.48(峰2)、0.63(峰3)、0.67(峰4)、0.73(峰5)、0.75(峰6)、0.84(峰7)、1.09(峰9),允許誤差±10%．峰1至峰7、峰9的相對(duì)峰面積分別為0.133～13.116,0.314～89.607,0.114～52.354,0.241～11.359,0.028～35.626,0.271～7.640,0.183～17.895;相對(duì)峰面積RSD分別為231.63%,404.85%,426.12%,234.93%,385.20%,189.72%,164.88%,190.05%．不同批次蟾酥樣品共有峰相對(duì)峰面積差別較大,其中LN5,SD4,SC1批與其他批次比例差異最大(表3)．

2.4 聚類分析

以24批蟾酥特征圖譜中9個(gè)共有峰峰面積為變量,利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見(jiàn)圖4．當(dāng)刻度距離為15時(shí),可分為3類,HLJ1,HLJ2,JL1,JL2,JL3,LN2,LN3,SD1,SD2,SD3,SD6,HB1,JS1,JS2,SC2聚為一類,LN5,SD4,HN2聚為一類,HN1,SC3,SD5,SC1,LN1聚為一類,說(shuō)明蟾酥中二次代謝產(chǎn)物的積累受一定地域因素影響,但同一產(chǎn)地蟾酥質(zhì)量也存在差異性,不同產(chǎn)地蟾酥質(zhì)量亦具有相似性．聚類分析與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本類似．

2.5 主成分分析

以24批蟾酥特征圖譜中9個(gè)共有峰峰面積為變量,利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行主成分分析,以特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn)得到3個(gè)主成分,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為72.961%,可以代表蟾酥中9個(gè)共有峰成分的大部分信息．碎石圖見(jiàn)圖5,特征值及方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表4,各主成分得分見(jiàn)表5、圖6．由圖6可知,24批蟾酥樣品可分為4類,HLJ1,HLJ2,JL1,JL2,JL3,LN1,LN2,LN3,LN4,SD1,SD2,SD3,SD6,HB1,JS1,JS2,SC2為一類,LN5,SD4,HN2為一類,HN1,SC3,SD5為一類,SC1為一類,主成分分析與聚類分析結(jié)果基本相似．

表4 蟾酥主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率

表5 24批蟾酥主成分分析得分系數(shù)矩陣

續(xù)表5

圖5 蟾酥碎石圖

圖6 蟾酥主成分分析得分圖

2.6 一測(cè)多評(píng)方法建立

2.6.1 方法學(xué)考察

取蟾酥供試品溶液、空白溶劑按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,陰性樣無(wú)干擾,方法專屬性良好．精密量取混合對(duì)照品溶液,采用倍數(shù)稀釋法分別稀釋2,4,8,16倍,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定．以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程及線性范圍,結(jié)果顯示各成分在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表6)．取蟾酥樣品6份按“2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行制備,按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定,日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量的RSD分別為1.44%,2.08%,1.52%,1.51%,1.50%,表明該方法重復(fù)性良好．不同分析人員在不同時(shí)間利用不同儀器進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),綜合分析2次重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果,蟾酥樣品中日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量的RSD分別為1.50%,1.72%,1.43%,1.44%,1.47%,表明方法中間精密度良好．取6份蟾酥粉末約15 mg,精密稱定,加入對(duì)照品溶液適量,按“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行含量測(cè)定,測(cè)定5種成分的含量,并計(jì)算回收率,日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基回收率分別為96.98%～100.13%,99.20%～101.66%,96.91%～99.82%,99.91%～100.82%,100.02%～100.99%,符合分析要求．取同一供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件于0 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h進(jìn)樣測(cè)定,日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量的RSD分別為0.31%,0.22%,0.25%,0.27%,0.21%,表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好．

表6 線性方程及線性范圍結(jié)果

2.6.2 相對(duì)校正因子計(jì)算

根據(jù)“2.4”項(xiàng)下的線性考察結(jié)果,以華蟾酥毒基為內(nèi)參物,按照公式計(jì)算相對(duì)校正因子f[f=(As/Cs)/(Ai/Ci)(As為內(nèi)標(biāo)峰面積,Cs為內(nèi)標(biāo)濃度;Ai為待測(cè)物峰面積,Ci為待測(cè)物濃度)]．日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基的相對(duì)校正因子分別為0.93,1.04,0.92,1.00(表7)．

2.6.3 校正因子的耐用性

采用Agilent 1260和Waters e2695兩種高效液相色譜系統(tǒng),3根色譜柱考察儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果見(jiàn)表8,相對(duì)校正因子RSD值為0.55%～1.11%,表明各待測(cè)組分相對(duì)校正因子在不同儀器和不同色譜柱之間耐用性良好．設(shè)置不同流速及柱溫對(duì)相對(duì)校正因子進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表9,相對(duì)校正因子RSD值為0.56%～1.23%,不同流速及柱溫條件下,各待測(cè)組分相對(duì)校正因子耐用性較好．

表8 不同儀器和色譜柱測(cè)得相對(duì)校正因子

表9 不同流速及不同柱溫測(cè)得相對(duì)校正因子

2.6.4 待測(cè)組分色譜峰的定位

分別計(jì)算各待測(cè)組分與內(nèi)參物華蟾酥毒基的相對(duì)保留時(shí)間(ti/s)與保留時(shí)間差(Δti/s),并考察其在不同儀器和不同色譜柱之間的重現(xiàn)性,結(jié)果見(jiàn)表10,相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)較小,最終選擇不同儀器和不同色譜柱中各待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間值的平均值作為峰定位依據(jù)．

表10 不同儀器和色譜柱中各目標(biāo)成分的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)保留時(shí)間差

2.6.5 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較

分別采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法計(jì)算待測(cè)成分的含量,結(jié)果見(jiàn)表11．外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的含量經(jīng)t檢驗(yàn)比較,p遠(yuǎn)大于0.05,表明兩種方法測(cè)得的含量無(wú)明顯差異,且兩組含量之間相對(duì)誤差<3%,表明所建立的一測(cè)多評(píng)方法準(zhǔn)確性良好,可用于蟾酥的含量測(cè)定．

表11 ESM與QAMS測(cè)定不同產(chǎn)地蟾酥中5種成分含量的比較

2.7 含量測(cè)定結(jié)果分析

由含量測(cè)結(jié)果可以看出,日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基5種蟾毒內(nèi)酯類化合物總含量范圍分別為2.93～43.99 mg/kg,5.17～21.41 mg/kg,4.93～40.23 mg/kg,3.58～82.38 mg/kg,0.36～100.03 mg/g,不同批次樣品含量差別非常大,充分體現(xiàn)了動(dòng)物源性藥材質(zhì)量影響因素的復(fù)雜性．《中國(guó)藥典》2020年版對(duì)蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基的總量建立了質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),24個(gè)樣本中,蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基3種蟾毒內(nèi)酯類化合物總含量范圍為8.87～152.35 mg/g,不同批次含量由高到低依次為L(zhǎng)N1,LN2,LN3,JS2,LN4,JL1,LN5,HB1,JL2,JL3,JS1,HLJ2,SD6,HLJ1,SD3,SD4,SD5,SD1,SD2,HN2,HN1,SC2,SC3,SC1．日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基5種蟾毒內(nèi)酯類化合物總含量范圍為20.00～169.81 mg/g．不同批次含量由高到低依次為L(zhǎng)N1,LN2,LN3,JS2,LN4,LN5,JL1,HB1,JL2,SD4,JL3,SD6,JS1,HLJ2,SD5,SD3,HN2,HLJ1,SD1,SD2,HN1,SC2,SC3,SC1(表11)．由結(jié)果可以看出,吉林和遼寧省所收集蟾酥中蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基的總量及日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基的總量最高,黑龍江、山東和江蘇省批次相應(yīng)蟾毒內(nèi)酯類含量稍低,但均能符合《中國(guó)藥典》2020年版要求．《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定：“本品按干燥品計(jì)算,含蟾毒靈(C24H34O4)、脂蟾毒配基(C26H34O6)、華蟾酥毒基(C24H32O4)的總量不少于7.0%”．河南、四川所收集蟾酥中蟾毒內(nèi)酯的含量最低,無(wú)法達(dá)到藥典限度要求,說(shuō)明蟾毒內(nèi)酯類化合物的含量與地理環(huán)境有關(guān),蟾蜍的棲息地條件在一定程度上影響蟾毒內(nèi)酯類化合物的生物合成．結(jié)果詳見(jiàn)表12、圖7．為了進(jìn)一步考察不同產(chǎn)地樣本中蟾毒內(nèi)酯類化合物的組成比例是否有明顯差別,對(duì)5種化合物的含量數(shù)據(jù)做百分比堆積柱形圖,如圖8所示,不同批次樣本中各成分組成比例差別較大,但未表現(xiàn)出明顯的地域特征．計(jì)算蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基3種蟾毒內(nèi)酯類化合物在日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基中的占比,結(jié)果為44.35%～89.72%,不同批次蟾酥藥材占比有一定差別,說(shuō)明《中國(guó)藥典》2020年版采用3種蟾毒內(nèi)酯類化合物總量進(jìn)行質(zhì)量控制具有一定的局限性．

表12 日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基含量組成比例

圖7 不同產(chǎn)地蟾毒配基堆積柱狀圖

圖8 不同產(chǎn)地蟾毒配基含量比例堆積柱狀圖

3 結(jié)論與討論

蟾酥具有抗腫瘤、強(qiáng)心等多種藥理活性,我國(guó)應(yīng)用蟾酥防病治病已有2 000多年的歷史,很多急救或常用中成藥如麝香保心丸、六神丸、熊膽救心丸等都以蟾酥為原料[2]．蟾酥的需求量不斷增長(zhǎng),2020年國(guó)內(nèi)蟾酥使用量已經(jīng)超過(guò)5 t．而蟾酥市場(chǎng)供應(yīng)量急劇減少,每千克藥材價(jià)格自2010年2 200元一路上揚(yáng),2019年增長(zhǎng)至30 000元,2022年達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)的蟾酥價(jià)格快速上漲至近90 000元．野生蟾酥資源趨近枯竭,蟾酥仿生、半仿生養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)亟待突破,摸清蟾酥品質(zhì)和地理環(huán)境的關(guān)系至關(guān)重要．

蟾酥中的化學(xué)成分主要包括括蟾毒內(nèi)酯類、吲哚類生物堿、甾醇類及其他類化合物,其中蟾毒內(nèi)酯類研究最多．蟾毒內(nèi)酯類化合物具有強(qiáng)心、升壓、增加冠脈血流量、抗腫瘤等多種藥理活性,是蟾酥中的主要有效成分[2-4]．本文針對(duì)蟾毒內(nèi)酯類化合物構(gòu)建指紋圖譜檢測(cè)方法確認(rèn)9個(gè)特征峰,并指認(rèn)其中5個(gè)峰的分別為日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基,進(jìn)行相似度分析,聚類分析和主成分分析．四川蟾酥樣品與其他省份差異較大,相同產(chǎn)地蟾酥樣品相似性相對(duì)較好,也有一些來(lái)源于同一省份的蟾酥樣品相似度較小,說(shuō)明蟾酥藥材質(zhì)量影響因素較多,除具有一定地域規(guī)律性外,可能受藥材基原、動(dòng)物個(gè)體間差異、蟾酥產(chǎn)地加工等影響也較大[11,25]．

針對(duì)特征圖譜中的5種有效成分建立含量一測(cè)多評(píng)檢測(cè)方法,以廉價(jià)、易得的華蟾酥毒基為內(nèi)參物,實(shí)現(xiàn)多個(gè)蟾蜍內(nèi)酯類成分的同步測(cè)定,降低檢測(cè)成本同時(shí)解決了對(duì)照品不足的問(wèn)題．利用所建立的方法對(duì)24批蟾酥含量進(jìn)行測(cè)定,不同批次產(chǎn)品中5種蟾毒內(nèi)酯類化合物含量差異非常大,黑龍江、吉林、遼寧、河北、山東、江蘇省所收集蟾酥中蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基的總量及日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基的總量均較高,且均能符合《中國(guó)藥典》2020年版要求,河南、四川所收集蟾酥中蟾素內(nèi)酯的含量較低,無(wú)法達(dá)到藥典限度要求,說(shuō)明蟾毒內(nèi)酯類化合物的含量與地理環(huán)境有關(guān),蟾蜍的棲息地條件在一定程度上影響蟾毒內(nèi)酯類化合物的生物合成．另外,不同蟾酥批次樣本中各成分組成比例差別較大,但未表現(xiàn)出明顯的地域特征．蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基3種蟾毒內(nèi)酯類化合物在日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基中的占比為44.35%～89.72%,不同批次蟾酥藥材占比有一定差別,說(shuō)明《中國(guó)藥典》2020年版采用蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基3種蟾毒內(nèi)酯類化合物總量進(jìn)行質(zhì)量控制具有一定的局限性,可能造成蟾酥資源的浪費(fèi)及臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)．本研究建立了蟾酥指紋圖譜檢測(cè)方法及含量一測(cè)多評(píng)檢測(cè)方法,該方法在《中國(guó)藥典》2020年版基礎(chǔ)上增加特征峰數(shù)量及含量測(cè)定指標(biāo)的數(shù)量,方法極其簡(jiǎn)便,在不增加工作量及檢測(cè)成本的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高蟾酥質(zhì)控水平,具有推廣價(jià)值,可以為蟾酥藥材真?zhèn)闻袛?、質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供依據(jù)．在蟾酥樣品收集方面,課題組深入到蟾酥產(chǎn)地采集8個(gè)省份的24批蟾酥樣品,避免購(gòu)買(mǎi)不同產(chǎn)地原料混合加工品,樣品具有代表性．對(duì)蟾酥樣品進(jìn)行檢測(cè)及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析研究結(jié)果表明,蟾酥中主要有效成分蟾毒內(nèi)酯的積累具有一定的地域性,對(duì)于蟾蜍藥材產(chǎn)地特征研究、仿生及半仿生養(yǎng)殖及蟾酥藥材資源的合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重要意義．下一步課題組將針對(duì)瀕危名貴道地藥材蟾酥規(guī)?；a(chǎn)的痛點(diǎn)為研究?jī)?nèi)容,重點(diǎn)突破規(guī)模化生產(chǎn)中的關(guān)鍵技術(shù),并進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化研究,從而為實(shí)現(xiàn)蟾酥藥材產(chǎn)業(yè)化、保證以蟾酥為原料中成藥和臨床蟾酥用藥需求夯實(shí)基礎(chǔ)．