王蕤蘭,王月興,楊 健,鄧麗娟

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病,包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎,其發(fā)病機(jī)制仍不清楚,可能的病理機(jī)制包括免疫反應(yīng)失調(diào)、細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生異常、腸上皮屏障功能受損和腸道菌群紊亂[1]。IBD主要臨床癥狀包括腹痛、腹瀉、黏液膿血便等,此外還可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、口腔潰瘍、鞏膜炎和結(jié)節(jié)性紅斑等胃腸道之外的癥狀[2]。IBD目前主要治療原則是對癥治療,延緩病程發(fā)展,必要時進(jìn)行手術(shù)切除,主要用藥包括氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫調(diào)節(jié)劑和生物制劑等[3]。腸上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)在IBD的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要,因此可能成為干預(yù)疾病的有效靶點(diǎn)。

菊粉是一種可溶性的膳食纖維,研究表明,菊粉可以調(diào)節(jié)腸道菌群組成結(jié)構(gòu),使雙歧桿菌明顯增加,厭氧菌和乳酸菌的相對豐度增加,擬桿菌的相對豐度減少[4]。菊粉可維持腸道穩(wěn)態(tài),緩解消化系統(tǒng)疾病癥狀,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,降低血糖,抑制炎癥因子表達(dá),降低結(jié)腸癌風(fēng)險,增強(qiáng)礦物質(zhì)吸收,緩解便秘,調(diào)節(jié)高尿酸血癥等[5-7]。研究發(fā)現(xiàn),菊粉通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和抗氧化發(fā)揮器官保護(hù)作用[8],也通過抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎癥因子釋放和抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白通路來消除機(jī)體炎癥[9],但是菊粉對IBD的影響和作用機(jī)制尚不明確。本研究通過2.5%葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)IBD小鼠模型,探討菊粉對IBD小鼠的影響,深入挖掘其潛在的作用機(jī)制,為IBD治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑 40只雄性7～8周C57BL/6小鼠,體重20～24 g,飼養(yǎng)于溫度、濕度恒定的動物房內(nèi),光暗循環(huán)12 h,小鼠自由活動、進(jìn)食。菊粉(Sigma-Aldrich);DSS (Sigma-Aldrich);Trizol(Absin);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher);TNF-α、IL-1β、IL-6、GADPH引物由上海生工生物合成;Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、NF-κB和GADPH抗體(CST)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 40只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常對照組、菊粉對照組、模型組和菊粉治療組,每組10只。菊粉對照組和菊粉治療組提前灌胃500 mg/kg菊粉干預(yù)14 d,每日一次,正常對照組和模型組每天灌胃0.9%氯化鈉注射液,在干預(yù)第8天時開始造模,稱量小鼠體重作為初始質(zhì)量,模型組和菊粉治療組通過飲用7 d 2.5% DSS溶液誘導(dǎo)IBD模型,正常對照組和菊粉對照組飲用蒸餾水,14 d后處死小鼠進(jìn)行分析。

1.2.2 DAI評分 從使用DSS誘導(dǎo)IBD模型開始,每日對小鼠的體重、糞便黏稠度、是否便血進(jìn)行記錄,按照DAI評分細(xì)則進(jìn)行評分,這三項(xiàng)指標(biāo)的平均分即為疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評分。(1)體質(zhì)量減輕:無,0分;1%～5%,1分;6%～10%,2分;11%～15%,3分;>15%,4分。(2)糞便黏稠度:良好顆粒,0分;不會黏附于肛門糊狀糞便,2分;黏附于肛門的稀便,4分。(3)是否便血:無,0分;隱血試驗(yàn)陽性,2分;肉眼血便4分。

1.2.3 結(jié)腸檢查 (1)結(jié)腸長度測量:小鼠麻醉后,打開腹腔尋找到結(jié)腸與盲腸的交界處,分離結(jié)腸到直腸,將其剪斷,4 ℃的0.9%氯化鈉注射液沖洗表面的糞便,然后測量結(jié)腸長度。(2)病理學(xué)檢查:取下小鼠結(jié)腸組織4%多聚甲醛進(jìn)行固定,脫水、透明、包埋等步驟后,對小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行切片,用蘇木精和伊紅進(jìn)行染色,顯微鏡下觀察結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的改變。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR 取下小鼠結(jié)腸組織后迅速置于液氮進(jìn)行保存,使用Trizol法提取結(jié)腸組織RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作將RNA反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA,加入TNF-α、IL-1β、IL-6、GADPH對應(yīng)的引物[10]、結(jié)腸cDNA、SYBR qpcr Master Mix以及無菌無酶水組成10μl體系在PCR儀設(shè)置程序中進(jìn)行反應(yīng),測定各組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的熒光強(qiáng)度,通過2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算(表1)。

表1 引物序列

1.2.5 蛋白質(zhì)印記法檢測 分離結(jié)腸組織后,用0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行洗滌2次,裂解組織后進(jìn)行提取蛋白,在100 ℃水中煮沸蛋白使其變性,加樣,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳完后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜2 h,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%牛奶進(jìn)行封閉,與Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、NF-κB和GADPH的一抗進(jìn)行孵育,4 ℃過夜。次日,洗膜3次后,室溫孵育相應(yīng)二抗2 h,洗膜3次后進(jìn)行ECL發(fā)光顯影,以GADPH作為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理,計(jì)算不同條帶的灰度比值。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般情況和DAI評分 正常對照組和菊粉對照組在實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)腹瀉、血便現(xiàn)象,并隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展,該兩組小鼠體質(zhì)量稍有增加,兩組的DAI評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,精神狀態(tài)良好,活動自如。相比于正常對照組,模型組在造模第3天出現(xiàn)明顯血便和腹瀉現(xiàn)象,體質(zhì)量/初始質(zhì)量下降,DAI評分增加[0vs.(3.72±0.31),P<0.05],精神萎靡,活動明顯減少。與模型組相比,菊粉治療組小鼠造模第5天血便和腹瀉現(xiàn)象明顯緩解,體重量/初始質(zhì)量有所恢復(fù),DAI評分降低[(3.81±0.25)vs.(1.78±0.18),P<0.05],精神狀態(tài)良好,活動增加,使用菊粉治療改善了IBD癥狀(表2,表3)。

表2 各組小鼠DAI評分

表3 各組小鼠體質(zhì)量/初始質(zhì)量變化

2.2 小鼠結(jié)腸長度 與正常對照組相比,菊粉對照組中小鼠結(jié)腸長度無明顯差異[(8.21±0.32)vs.(8.31±0.22),P>0.05],模型組小鼠的結(jié)腸長度明顯縮短[(8.21±0.32)vs.(6.61±0.33),P<0.05]。

與模型組相比,菊粉治療組小鼠結(jié)腸長度有所增加[(6.61±0.33)vs.(7.06±0.31),P<0.05],說明經(jīng)菊粉治療干預(yù)后,小鼠癥狀有所改善(圖1)。

圖1 各組小鼠治療后結(jié)腸長度比較

2.3 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué) 與正常對照組相比,模型組的結(jié)腸黏膜明顯受損,黏膜結(jié)構(gòu)被破壞,絨毛排列明顯紊亂,炎癥細(xì)胞浸潤增多,菊粉對照組與正常對照組在病理組織學(xué)二者無明顯差異。與模型組相比,菊粉治療組結(jié)腸病理結(jié)構(gòu)明顯改善,病變減輕,黏膜破壞減少,絨毛排列稍整齊,炎癥細(xì)胞浸潤也減少(圖2)。

2.4 結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA 與正常對照組相比,模型組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05),菊粉對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與模型組相比,菊粉治療組的TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05;表4)。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平

2.5 結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和NF-κB蛋白表達(dá) WB結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組小鼠結(jié)腸組織Bcl-2蛋白表達(dá)下降,Bax、cleaved caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05),菊粉對照組小鼠各蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與模型組相比較,菊粉治療組增加Bcl-2蛋白表達(dá),減少Bax、cleaved caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)(P<0.05;圖3,表5)。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

表5 各組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)

3 討 論

IBD是一種病因不明的腸道疾病,其中,NF-κB通路、腸道炎癥和腸道細(xì)胞凋亡在IBD中發(fā)揮重要作用。菊粉可增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能和腸道屏障功能,具有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡功能。本研究發(fā)現(xiàn)使用菊粉進(jìn)行干預(yù)治療可抑制IBD小鼠腸道炎癥,改善小鼠腸道組織病理,減少腸道細(xì)胞的凋亡,抑制NF-κB蛋白表達(dá),單獨(dú)使用菊粉對小鼠并無不良影響。本研究推測菊粉可能通過抑制NF-κB信號通路進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡與抑制炎癥反應(yīng)來緩解IBD小鼠的癥狀。

DSS是一種高度水溶性的化合物,在小鼠的飲用水中短期給予DSS會誘導(dǎo)高度急性炎癥,該炎癥僅限于結(jié)腸,其特征為糜爛潰瘍、隱窩消失和炎癥細(xì)胞浸潤[11]。該模型操作簡單可重復(fù)性強(qiáng),且炎癥反應(yīng)明顯,DSS誘導(dǎo)的癥狀和組織學(xué)特征與人類IBD中的特征相似,為本研究提供了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＿@種由化學(xué)藥物誘發(fā)的動物模型與自發(fā)性基因小鼠模型存在一定區(qū)別,前者更加偏向后天環(huán)境的因素影響,而后者更偏向于研究遺傳因素影響[12]。本研究建立DSS模型小鼠表現(xiàn)與之前研究一致,在DSS給藥后3～5 d出現(xiàn)明顯血便與體重下降,精神萎靡、活動能力下降、腹瀉、眼屎增多,結(jié)腸變薄縮短,腸上皮出現(xiàn)糜爛潰瘍,病理切片顯示隱窩消失、炎癥細(xì)胞浸潤增多等,說明使用2.5% DSS自由喂養(yǎng)小鼠可誘發(fā)IBD癥狀,成功建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

炎癥反應(yīng)在IBD的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的推動作用,其中TNF-α、IL-6、IL-1β在腸道炎癥的誘導(dǎo)和維持中發(fā)揮重要作用。TNF-α是IBD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素,在DSS誘導(dǎo)的IBD中高度上調(diào),與其受體TNFR1和TNFR2結(jié)合發(fā)揮作用,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生,敲除TNFR2會減輕結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度,減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,細(xì)胞凋亡減少,而敲除TNFR1會導(dǎo)致相反的結(jié)果[13]。在目前IBD治療中,TNF-α是一個關(guān)鍵的治療靶點(diǎn),通過使用抗TNF-α單克隆抗體阻斷TNF-α信號可以顯著抑制IBD炎癥并促進(jìn)腸黏膜愈合[14]。TNF-α在促進(jìn)炎癥方面也起著重要作用,促進(jìn)IL-6、IL-1β的產(chǎn)生和釋放,擴(kuò)大炎癥級聯(lián)反應(yīng)[15]。IL-6通過與其可溶性IL-6受體結(jié)合發(fā)揮促炎作用,有研究證明使用抗IL-6受體單克隆抗體可以阻斷黏附分子表達(dá)進(jìn)而抑制白細(xì)胞募集來緩解小鼠結(jié)腸炎[16]。IL-1β是一種促炎細(xì)胞因子,可增加抗原呈遞并增加促炎細(xì)胞因子的釋放,從而加重腸道黏膜炎癥。菊粉在腸道中發(fā)揮重要的抗炎作用,調(diào)節(jié)腸道菌群,增強(qiáng)腸上皮屏障功能。本研究中DSS誘導(dǎo)IBD小鼠模型中,小鼠腸組織的TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平顯著增高,使用菊粉治療后,腸組織炎癥因子的水平下降,炎癥反應(yīng)緩解,再次證明菊粉在腸道炎癥中發(fā)揮了重要的抗炎作用。因此,本實(shí)驗(yàn)可能通過抗炎功能來保護(hù)IBD小鼠。

此外,腸道上皮細(xì)胞的完整性在腸道保護(hù)中占據(jù)著重要作用,腸道上皮的屏障功能有賴于腸道上皮細(xì)胞的完整性。腸道上皮細(xì)胞的凋亡與增殖處在一種動態(tài)平衡中進(jìn)而保證細(xì)胞的更新和正常的功能,一旦凋亡過度會造成屏障功能受損,導(dǎo)致細(xì)菌從管腔進(jìn)入腸壁甚至血液造成敗血癥并引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng),這也是IBD發(fā)病機(jī)制之一[17]。IBD患者腸黏膜中TNF-α表達(dá)增加,會誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡[18]。菊粉在抗細(xì)胞凋亡方面也發(fā)揮重要作用,菊粉可通過抑制甲氨蝶呤造成的肝細(xì)胞過度凋亡從而改善肝功能,可減少心臟細(xì)胞凋亡進(jìn)而降低2型糖尿病中心臟并發(fā)癥的發(fā)生率[19],也可減少腸道細(xì)胞凋亡。在本研究中,DSS誘導(dǎo)IBD小鼠腸道細(xì)胞凋亡增多,Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加,Bcl-2蛋白表達(dá)下降,經(jīng)過菊粉治療后,腸道的細(xì)胞凋亡被抑制,Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯減少,Bcl-2蛋白表達(dá)增加,說明菊粉可通過抗細(xì)胞凋亡來緩解IBD癥狀。

NF-κB的激活與IBD中免疫反應(yīng)激活相關(guān),通過抑制NF-κB可抑制結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展,表明了NF-κB在炎癥誘導(dǎo)和病程發(fā)生發(fā)展的重要作用[20]。腸上皮細(xì)胞中NF-κB通路的穩(wěn)態(tài)對于維持腸上皮完整性和腸道的免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。NF-κB在IBD患者中被顯著誘導(dǎo)激活,特別是在巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中,從而促進(jìn)腸黏膜炎癥反應(yīng)[21]。NF-κB也是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)重要的轉(zhuǎn)錄因子,可促進(jìn)下游炎癥因子和黏附分子的釋放。此外,NF-κB可誘導(dǎo)下游TNF-α的釋放,反過來TNF-α能夠進(jìn)一步增強(qiáng)NF-κB的激活,形成正反饋級聯(lián)放大機(jī)制。菊粉可通過抑制TLR4/NF-κB通路激活調(diào)節(jié)腸道微生物來減輕炎癥反應(yīng),并且菊粉不被腸道消化吸收,可直接到達(dá)結(jié)腸段被菌群分解代謝從而發(fā)揮局部調(diào)節(jié)優(yōu)勢。在本研究的DSS誘導(dǎo)小鼠模型中,檢測到NF-κB蛋白表達(dá)量明顯增加,這與之前的研究是一致的,使用菊粉干預(yù)后,可降低NF-κB的表達(dá),由此推測菊粉可通過抑制NF-κB進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡和抑制炎癥反應(yīng)來發(fā)揮腸道保護(hù)作用。

本研究為臨床治療IBD提供了新的思路和方向,擴(kuò)展了菊粉應(yīng)用的適應(yīng)證,為未來IBD的治療奠定了一定理論基礎(chǔ)。但是本研究目前局限在實(shí)驗(yàn)動物身上,尚未進(jìn)行臨床試驗(yàn),結(jié)論能否應(yīng)用于臨床還需要進(jìn)一步的論證與實(shí)踐。