王蕤蘭,王月興,楊 健,鄧麗娟

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性復發(fā)性炎癥性疾病,包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎,其發(fā)病機制仍不清楚,可能的病理機制包括免疫反應失調(diào)、細胞炎癥因子產(chǎn)生異常、腸上皮屏障功能受損和腸道菌群紊亂[1]。IBD主要臨床癥狀包括腹痛、腹瀉、黏液膿血便等,此外還可能出現(xiàn)關節(jié)炎、口腔潰瘍、鞏膜炎和結節(jié)性紅斑等胃腸道之外的癥狀[2]。IBD目前主要治療原則是對癥治療,延緩病程發(fā)展,必要時進行手術切除,主要用藥包括氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫調(diào)節(jié)劑和生物制劑等[3]。腸上皮細胞凋亡和炎癥反應在IBD的發(fā)生發(fā)展中至關重要,因此可能成為干預疾病的有效靶點。

菊粉是一種可溶性的膳食纖維,研究表明,菊粉可以調(diào)節(jié)腸道菌群組成結構,使雙歧桿菌明顯增加,厭氧菌和乳酸菌的相對豐度增加,擬桿菌的相對豐度減少[4]。菊粉可維持腸道穩(wěn)態(tài),緩解消化系統(tǒng)疾病癥狀,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,降低血糖,抑制炎癥因子表達,降低結腸癌風險,增強礦物質(zhì)吸收,緩解便秘,調(diào)節(jié)高尿酸血癥等[5-7]。研究發(fā)現(xiàn),菊粉通過調(diào)節(jié)細胞凋亡和抗氧化發(fā)揮器官保護作用[8],也通過抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎癥因子釋放和抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白通路來消除機體炎癥[9],但是菊粉對IBD的影響和作用機制尚不明確。本研究通過2.5%葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導IBD小鼠模型,探討菊粉對IBD小鼠的影響,深入挖掘其潛在的作用機制,為IBD治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑 40只雄性7～8周C57BL/6小鼠,體重20～24 g,飼養(yǎng)于溫度、濕度恒定的動物房內(nèi),光暗循環(huán)12 h,小鼠自由活動、進食。菊粉(Sigma-Aldrich);DSS (Sigma-Aldrich);Trizol(Absin);反轉錄試劑盒(Thermo Fisher);TNF-α、IL-1β、IL-6、GADPH引物由上海生工生物合成;Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、NF-κB和GADPH抗體(CST)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 40只實驗小鼠隨機分為正常對照組、菊粉對照組、模型組和菊粉治療組,每組10只。菊粉對照組和菊粉治療組提前灌胃500 mg/kg菊粉干預14 d,每日一次,正常對照組和模型組每天灌胃0.9%氯化鈉注射液,在干預第8天時開始造模,稱量小鼠體重作為初始質(zhì)量,模型組和菊粉治療組通過飲用7 d 2.5% DSS溶液誘導IBD模型,正常對照組和菊粉對照組飲用蒸餾水,14 d后處死小鼠進行分析。

1.2.2 DAI評分 從使用DSS誘導IBD模型開始,每日對小鼠的體重、糞便黏稠度、是否便血進行記錄,按照DAI評分細則進行評分,這三項指標的平均分即為疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評分。(1)體質(zhì)量減輕:無,0分;1%～5%,1分;6%～10%,2分;11%～15%,3分;>15%,4分。(2)糞便黏稠度:良好顆粒,0分;不會黏附于肛門糊狀糞便,2分;黏附于肛門的稀便,4分。(3)是否便血:無,0分;隱血試驗陽性,2分;肉眼血便4分。

1.2.3 結腸檢查 (1)結腸長度測量:小鼠麻醉后,打開腹腔尋找到結腸與盲腸的交界處,分離結腸到直腸,將其剪斷,4 ℃的0.9%氯化鈉注射液沖洗表面的糞便,然后測量結腸長度。(2)病理學檢查:取下小鼠結腸組織4%多聚甲醛進行固定,脫水、透明、包埋等步驟后,對小鼠結腸組織進行切片,用蘇木精和伊紅進行染色,顯微鏡下觀察結腸組織結構的改變。

1.2.4 實時熒光定量PCR 取下小鼠結腸組織后迅速置于液氮進行保存,使用Trizol法提取結腸組織RNA,根據(jù)反轉錄試劑盒操作將RNA反轉錄成相應的cDNA,加入TNF-α、IL-1β、IL-6、GADPH對應的引物[10]、結腸cDNA、SYBR qpcr Master Mix以及無菌無酶水組成10μl體系在PCR儀設置程序中進行反應,測定各組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的熒光強度,通過2-ΔΔCt法進行計算(表1)。

表1 引物序列

1.2.5 蛋白質(zhì)印記法檢測 分離結腸組織后,用0.9%氯化鈉注射液進行洗滌2次,裂解組織后進行提取蛋白,在100 ℃水中煮沸蛋白使其變性,加樣,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳完后進行轉膜2 h,將蛋白轉移到PVDF膜上,用5%牛奶進行封閉,與Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、NF-κB和GADPH的一抗進行孵育,4 ℃過夜。次日,洗膜3次后,室溫孵育相應二抗2 h,洗膜3次后進行ECL發(fā)光顯影,以GADPH作為內(nèi)參進行歸一化處理,計算不同條帶的灰度比值。

2 結 果

2.1 小鼠一般情況和DAI評分 正常對照組和菊粉對照組在實驗期間未出現(xiàn)腹瀉、血便現(xiàn)象,并隨著實驗進展,該兩組小鼠體質(zhì)量稍有增加,兩組的DAI評分無統(tǒng)計學差異,精神狀態(tài)良好,活動自如。相比于正常對照組,模型組在造模第3天出現(xiàn)明顯血便和腹瀉現(xiàn)象,體質(zhì)量/初始質(zhì)量下降,DAI評分增加[0vs.(3.72±0.31),P<0.05],精神萎靡,活動明顯減少。與模型組相比,菊粉治療組小鼠造模第5天血便和腹瀉現(xiàn)象明顯緩解,體重量/初始質(zhì)量有所恢復,DAI評分降低[(3.81±0.25)vs.(1.78±0.18),P<0.05],精神狀態(tài)良好,活動增加,使用菊粉治療改善了IBD癥狀(表2,表3)。

表2 各組小鼠DAI評分

表3 各組小鼠體質(zhì)量/初始質(zhì)量變化

2.2 小鼠結腸長度 與正常對照組相比,菊粉對照組中小鼠結腸長度無明顯差異[(8.21±0.32)vs.(8.31±0.22),P>0.05],模型組小鼠的結腸長度明顯縮短[(8.21±0.32)vs.(6.61±0.33),P<0.05]。

與模型組相比,菊粉治療組小鼠結腸長度有所增加[(6.61±0.33)vs.(7.06±0.31),P<0.05],說明經(jīng)菊粉治療干預后,小鼠癥狀有所改善(圖1)。

圖1 各組小鼠治療后結腸長度比較

2.3 小鼠結腸組織病理學 與正常對照組相比,模型組的結腸黏膜明顯受損,黏膜結構被破壞,絨毛排列明顯紊亂,炎癥細胞浸潤增多,菊粉對照組與正常對照組在病理組織學二者無明顯差異。與模型組相比,菊粉治療組結腸病理結構明顯改善,病變減輕,黏膜破壞減少,絨毛排列稍整齊,炎癥細胞浸潤也減少(圖2)。

2.4 結腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA 與正常對照組相比,模型組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達水平明顯上調(diào)(P<0.05),菊粉對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與模型組相比,菊粉治療組的TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達水平下降(P<0.05;表4)。

表4 各組小鼠結腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平

2.5 結腸組織細胞凋亡相關蛋白和NF-κB蛋白表達 WB結果顯示,與正常對照組相比,模型組小鼠結腸組織Bcl-2蛋白表達下降,Bax、cleaved caspase-3和NF-κB蛋白表達明顯增加(P<0.05),菊粉對照組小鼠各蛋白表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與模型組相比較,菊粉治療組增加Bcl-2蛋白表達,減少Bax、cleaved caspase-3和NF-κB蛋白表達(P<0.05;圖3,表5)。

圖3 各組小鼠結腸組織細胞凋亡相關蛋白

表5 各組小鼠結腸組織細胞凋亡相關蛋白和NF-κB蛋白表達

3 討 論

IBD是一種病因不明的腸道疾病,其中,NF-κB通路、腸道炎癥和腸道細胞凋亡在IBD中發(fā)揮重要作用。菊粉可增強機體的免疫功能和腸道屏障功能,具有抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡功能。本研究發(fā)現(xiàn)使用菊粉進行干預治療可抑制IBD小鼠腸道炎癥,改善小鼠腸道組織病理,減少腸道細胞的凋亡,抑制NF-κB蛋白表達,單獨使用菊粉對小鼠并無不良影響。本研究推測菊粉可能通過抑制NF-κB信號通路進而減少細胞凋亡與抑制炎癥反應來緩解IBD小鼠的癥狀。

DSS是一種高度水溶性的化合物,在小鼠的飲用水中短期給予DSS會誘導高度急性炎癥,該炎癥僅限于結腸,其特征為糜爛潰瘍、隱窩消失和炎癥細胞浸潤[11]。該模型操作簡單可重復性強,且炎癥反應明顯,DSS誘導的癥狀和組織學特征與人類IBD中的特征相似,為本研究提供了穩(wěn)定的實驗模型。這種由化學藥物誘發(fā)的動物模型與自發(fā)性基因小鼠模型存在一定區(qū)別,前者更加偏向后天環(huán)境的因素影響,而后者更偏向于研究遺傳因素影響[12]。本研究建立DSS模型小鼠表現(xiàn)與之前研究一致,在DSS給藥后3～5 d出現(xiàn)明顯血便與體重下降,精神萎靡、活動能力下降、腹瀉、眼屎增多,結腸變薄縮短,腸上皮出現(xiàn)糜爛潰瘍,病理切片顯示隱窩消失、炎癥細胞浸潤增多等,說明使用2.5% DSS自由喂養(yǎng)小鼠可誘發(fā)IBD癥狀,成功建立實驗模型。

炎癥反應在IBD的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的推動作用,其中TNF-α、IL-6、IL-1β在腸道炎癥的誘導和維持中發(fā)揮重要作用。TNF-α是IBD發(fā)病機制中的關鍵因素,在DSS誘導的IBD中高度上調(diào),與其受體TNFR1和TNFR2結合發(fā)揮作用,可誘導細胞凋亡,促進細胞因子產(chǎn)生,敲除TNFR2會減輕結腸炎的嚴重程度,減少促炎細胞因子的產(chǎn)生,細胞凋亡減少,而敲除TNFR1會導致相反的結果[13]。在目前IBD治療中,TNF-α是一個關鍵的治療靶點,通過使用抗TNF-α單克隆抗體阻斷TNF-α信號可以顯著抑制IBD炎癥并促進腸黏膜愈合[14]。TNF-α在促進炎癥方面也起著重要作用,促進IL-6、IL-1β的產(chǎn)生和釋放,擴大炎癥級聯(lián)反應[15]。IL-6通過與其可溶性IL-6受體結合發(fā)揮促炎作用,有研究證明使用抗IL-6受體單克隆抗體可以阻斷黏附分子表達進而抑制白細胞募集來緩解小鼠結腸炎[16]。IL-1β是一種促炎細胞因子,可增加抗原呈遞并增加促炎細胞因子的釋放,從而加重腸道黏膜炎癥。菊粉在腸道中發(fā)揮重要的抗炎作用,調(diào)節(jié)腸道菌群,增強腸上皮屏障功能。本研究中DSS誘導IBD小鼠模型中,小鼠腸組織的TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平顯著增高,使用菊粉治療后,腸組織炎癥因子的水平下降,炎癥反應緩解,再次證明菊粉在腸道炎癥中發(fā)揮了重要的抗炎作用。因此,本實驗可能通過抗炎功能來保護IBD小鼠。

此外,腸道上皮細胞的完整性在腸道保護中占據(jù)著重要作用,腸道上皮的屏障功能有賴于腸道上皮細胞的完整性。腸道上皮細胞的凋亡與增殖處在一種動態(tài)平衡中進而保證細胞的更新和正常的功能,一旦凋亡過度會造成屏障功能受損,導致細菌從管腔進入腸壁甚至血液造成敗血癥并引發(fā)炎癥級聯(lián)反應,這也是IBD發(fā)病機制之一[17]。IBD患者腸黏膜中TNF-α表達增加,會誘導腸上皮細胞凋亡[18]。菊粉在抗細胞凋亡方面也發(fā)揮重要作用,菊粉可通過抑制甲氨蝶呤造成的肝細胞過度凋亡從而改善肝功能,可減少心臟細胞凋亡進而降低2型糖尿病中心臟并發(fā)癥的發(fā)生率[19],也可減少腸道細胞凋亡。在本研究中,DSS誘導IBD小鼠腸道細胞凋亡增多,Bax、cleaved caspase-3蛋白表達明顯增加,Bcl-2蛋白表達下降,經(jīng)過菊粉治療后,腸道的細胞凋亡被抑制,Bax、cleaved caspase-3蛋白表達明顯減少,Bcl-2蛋白表達增加,說明菊粉可通過抗細胞凋亡來緩解IBD癥狀。

NF-κB的激活與IBD中免疫反應激活相關,通過抑制NF-κB可抑制結腸炎的發(fā)生發(fā)展,表明了NF-κB在炎癥誘導和病程發(fā)生發(fā)展的重要作用[20]。腸上皮細胞中NF-κB通路的穩(wěn)態(tài)對于維持腸上皮完整性和腸道的免疫穩(wěn)態(tài)至關重要。NF-κB在IBD患者中被顯著誘導激活,特別是在巨噬細胞和腸上皮細胞中,從而促進腸黏膜炎癥反應[21]。NF-κB也是介導炎癥反應重要的轉錄因子,可促進下游炎癥因子和黏附分子的釋放。此外,NF-κB可誘導下游TNF-α的釋放,反過來TNF-α能夠進一步增強NF-κB的激活,形成正反饋級聯(lián)放大機制。菊粉可通過抑制TLR4/NF-κB通路激活調(diào)節(jié)腸道微生物來減輕炎癥反應,并且菊粉不被腸道消化吸收,可直接到達結腸段被菌群分解代謝從而發(fā)揮局部調(diào)節(jié)優(yōu)勢。在本研究的DSS誘導小鼠模型中,檢測到NF-κB蛋白表達量明顯增加,這與之前的研究是一致的,使用菊粉干預后,可降低NF-κB的表達,由此推測菊粉可通過抑制NF-κB進而減少細胞凋亡和抑制炎癥反應來發(fā)揮腸道保護作用。

本研究為臨床治療IBD提供了新的思路和方向,擴展了菊粉應用的適應證,為未來IBD的治療奠定了一定理論基礎。但是本研究目前局限在實驗動物身上,尚未進行臨床試驗,結論能否應用于臨床還需要進一步的論證與實踐。