杜 麗,袁耀宗,王 徽,高宏生

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤,在呼吸道惡性腫瘤中的發(fā)生率位居第二。早期的喉癌患者經(jīng)過放療、化療、手術(shù)等治療后生存情況有所改善,但是晚期患者的預后仍然較差[1,2]。研究指出,喉癌的發(fā)生發(fā)展與吸煙、飲酒、飲食等因素相關(guān),但是其具體的發(fā)病機制尚不確定[3],所以需要完善調(diào)控喉癌發(fā)展的機制。外泌體是一類由多種活細胞分泌的納米級囊泡,可在細胞間發(fā)揮信息傳遞的功能[4],其中,腫瘤細胞分泌的外泌體可在腫瘤微環(huán)境中調(diào)控巨噬細胞、中性粒細胞、成纖維細胞等基質(zhì)細胞的功能,進而影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[5,6]。在腫瘤微環(huán)境中,腫瘤相關(guān)巨噬細胞是重要的免疫細胞之一,可誘導腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,靶向腫瘤相關(guān)巨噬細胞是腫瘤免疫治療的重要路徑[7],但是腫瘤細胞分泌的外泌體可通過分泌miRNA、DNA、蛋白質(zhì)等多種內(nèi)含物而促進腫瘤相關(guān)巨噬細胞的功能,進而實現(xiàn)免疫逃逸[8]。MiR-20a被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤外泌體中高表達,并調(diào)控腫瘤的病理進程,例如,Shi等[9]發(fā)現(xiàn),外泌體miR-20a可抑制非小細胞肺癌的化療敏感性,Moloudizargari等[10]發(fā)現(xiàn),外泌體miR-20a可作為血液系統(tǒng)腫瘤診斷的標志物。但是,喉癌外泌體miR-20a是否能調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞的功能尚無報道,由于腫瘤相關(guān)巨噬細胞的功能和表型與M2型巨噬細胞相似,所以M2型巨噬細胞常作為探究腫瘤相關(guān)巨噬細胞的體外模型[11]。本文探究了喉癌細胞外泌體miR-20a對M2型巨噬細胞增殖和凋亡的影響,旨在為喉癌的免疫治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 人單核細胞THP-1、支氣管上皮細胞系16HBE,喉癌細胞系TU686、TU177、TU212購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心,Trizol試劑和Lipofectamine 2000試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司,All-In-One 5X RT MasterMix試劑盒和BlasTaqTM2X qPCR MasterMix試劑盒購自愛必夢生物科技有限公司,CCK8試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司,佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、白細胞介素4( Interleukin 4,IL-4)和 白細胞介素13( Interleukin 13,IL-13)購自美國 Sigma 公司,NF-κB、p-NF-κB、GAPDH、CD9、CD63、TSG101抗體、山羊抗兔IGg購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 16HBE、TU686、TU177、TU212培養(yǎng)于含10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中,細胞置于37 ℃,5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中,細胞生長至匯合度達80%時進行細胞傳代。取對數(shù)生長期的TU212 細胞使用Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染陰性對照和miR-20a 模擬物。

THP1細胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中,THP1細胞與10 ng/ml PMA共孵育24 h,誘導其極化為 M0 型巨噬細胞,M0 型巨噬細胞與20 ng/ml IL-4和20 ng/ml IL-13共孵育48 h,誘導其分化為 M2 型巨噬細胞。

1.3 外泌體的提取與鑒定 收集16HBE、TU686、TU177、TU212細胞,以及轉(zhuǎn)染miR-20a 模擬物和陰性對照的TU212細胞培養(yǎng)上清,使用差速離心法提取外泌體(記為16HBE exo、TU686 exo、TU177 exo、TU212 exo、miR-NC exo、miR-20a exo),將細胞培養(yǎng)清液3000×g,4 ℃離心15 min去死細胞;取上清液6000×g 離心 40 min,取上清;10 000 ×g離心1 h,取上清;100×kg離心1 h,收集沉淀,用400 μl無菌 PBS 重懸外泌體,所得外泌體-80 ℃條件下保存。透射電鏡下觀察外泌體的結(jié)構(gòu),Western blot檢測外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101。

1.4 細胞分組 M2型巨噬細胞分為PBS組、16HBE exo組、TU686 exo組、TU177 exo組、TU212 exo組、miR-NC exo組、miR-20a exo組,即M2型巨噬細胞分別與PBS及10 ng/ml的16HBE exo、TU686 exo、TU177 exo、TU212 exo、miR-NC exo、miR-20a exo共孵育48 h。

1.5 實時熒光定量PCR檢測miR-20a、Arg-1、CD206、iNOS和CD16表達 根據(jù)Trizol試劑盒提取各組細胞及外泌體中的總RNA,然后使用All-In-One 5X RT MasterMix試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后使用BlasTaqTM2X qPCR MasterMix試劑盒進行qRT-PCR反應,反應條件為:95 ℃ 3 min,1次循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40次循環(huán)。記錄CT值,以U6或GAPDH為內(nèi)參,使用2-ΔΔCT法檢測miR-20a、Arg-1、CD206、iNOS和CD16的相對表達量。引物序列如表1。

表1 miR-20a和U6的引物序列

1.6 CCK8法檢測細胞增殖 將上述各組M2型巨噬細胞稀釋至2×104個/ml,然后96孔板每孔接種100 μl,每組設置3個復孔,然后將96孔板放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在0、24、48、72 h去除對應的96孔板,每孔加入10 μl的CCK8溶液,共孵育4 h后,使用酶標儀檢測450 nm條件下各孔的吸光度值(OD值)。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取各組M2型巨噬細胞1×105個于流式管中,PBS溶液清洗后再用500 μl的Binding Buffer重懸,各組流式管中加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,并設置Annexin V-FITC和PI單獨染色管,用于調(diào)光補償,4 ℃避光染色15 min,使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.8 Western bloting檢測各組M2型巨噬細胞及外泌體總蛋白 RIPA蛋白提取試劑盒提各組M2型巨噬細胞及外泌體總蛋白,蛋白定量后,取10 μg進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h,使用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,然后使用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h,與p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH、CD9、CD63、TSG101(1∶1000稀釋)一抗孵育過夜,與山羊抗兔IGg二抗(1∶5000稀釋)室溫孵育1.5 h,TBST洗膜后使用ECL試劑盒曝光拍照,用Image J軟件對曝光結(jié)果進行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 外泌體鑒定結(jié)果 本文所提取的16HBE exo、TU686 exo、TU177 exo、TU212 exo具有雙層膜結(jié)構(gòu),粒徑為30～100 nm,形態(tài)呈“杯托”樣。并且16HBE exo、TU686 exo、TU177 exo、TU212 exo均表達外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101(圖1)。

圖1 喉癌細胞外泌體結(jié)構(gòu)及標志物鑒定

2.2 M2型巨噬細胞誘導結(jié)果 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,M0+IL-4+IL-13組細胞M2型巨噬細胞標志蛋白Arg-1(5.45±0.62)高于M0+PBS組(1.00±0.00)(t=12.39,P<0.001),CD206(3.90±0.71)表達水平亦高于M0+PBS組(1.00±0.00)(t=7.09,P<0.01)。M0+IL-4+IL-13組細胞M1型巨噬細胞標志蛋白iNOS表達(0.11±0.05)顯著低于M0+PBS組(1.00±0.00)(t=30.74,P<0.001),CD16表達(0.12±0.04)亦顯著低于M0+PBS組(1.00±0.00)(t=43.57,P<0.001),說明M0細胞使用IL-4和IL-13誘導后可顯著促進M2型巨噬細胞的極化,所得M2型巨噬細胞用于后續(xù)研究。

2.3 喉癌細胞外泌體調(diào)控M2型巨噬細胞的增殖與凋亡 CCK8檢測結(jié)果顯示,相比于PBS組,TU686 exo組、TU177 exo組、TU212 exo組M2型巨噬細胞在24、48、72 h的OD值顯著增加(P均<0.05),而16HBE exo組M2型巨噬細胞OD值無顯著變化(表2)。細胞凋亡檢測結(jié)果(圖2)顯示,TU686 exo組(9.67%±1.53%)、TU177 exo組(8.67%±2.08%)、TU212 exo組(4.00%±1.00%)M2型巨噬細胞凋亡率顯著低于PBS組(21.67%±4.72%)(t=4.19、4.36、6.33,P均<0.01),16HBE exo組(19.67%±4.16%)M2型巨噬細胞凋亡率無顯著變化(t=0.55)。

圖2 喉癌細胞外泌體對M2型巨噬細胞凋亡的影響

表2 各組喉癌細胞M2型巨噬細胞OD值比較

2.4 miR-20a高表達于喉癌細胞及外泌體 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,喉癌細胞TU686(3.18±0.56)、TU177(4.23±0.27)、TU212(5.24±0.27)中miR-20a表達顯著高于PBS組(1.00±0.00)(t=6.73、20.55、27.34,P<0.01),TU212中miR-20a表達最高。TU686 exo(3.25±0.25)、TU177 exo(3.63±0.28)、TU212 exo(4.30±0.31)中miR-20a表達顯著高于16HBE exo(1.00±0.00)(t=15.31、16.50、18.57,P<0.001)。在TU212中轉(zhuǎn)染miR-20a 模擬物以及陰性對照后,并收集外泌體(miR-20a exo和miR-NC exo),相比于miR-NC exo(1.00±0.00),miR-20a exo中miR-20a表達(5.12±0.57)顯著上調(diào)(t=12.50,P<0.001)。

2.5 外泌體miR-20a影響M2型巨噬細胞的增殖和凋亡 CCK8檢測結(jié)果顯示(表3),相比于miR-NC exo組,miR-20a exo組M2型巨噬細胞在24、48、72 h的OD值顯著增加(P<0.01)。細胞凋亡檢測結(jié)果(圖3)顯示,相比于miR-NC exo組(14.33%±1.53%),miR-20a exo組M2型巨噬細胞凋亡率(8.33%±1.52%)顯著降低(t=4.81,P=0.0086)。

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組喉癌細胞凋亡率

表3 各組喉癌細胞M2型巨噬細胞OD值比較

2.6 外泌體miR-20a激活M2型巨噬細胞PI3K/AKT信號通路 Western blot檢測結(jié)果(圖4,表4)顯示,相比于PBS組,TU686 exo組、TU177 exo組和TU212 exo組M2型巨噬細胞中PI3K和AKT磷酸化水平均顯著增高(P<0.001),16HBE exo組細胞中PI3K和AKT磷酸化水平與PBS組無顯著差異。相比于miR-NC exo組,miR-20a exo組M2型巨噬細胞中PI3K和AKT磷酸化水平均顯著增高(P<0.001)。

圖4 Western blot 檢測各組喉癌細胞中PI3K

表4 各組喉癌細胞PI3K和AKT磷酸化水平比較

3 討 論

外泌體是粒徑為30～100 nm的微囊泡,內(nèi)含包括miRNA、lncRNA、mRNA、DNA等多種遺傳物質(zhì),其多數(shù)內(nèi)含物具有作為腫瘤診斷和治療標志物的前景[12],其中miRNA是一類研究較為廣泛的外泌體內(nèi)含物,外泌體miRNA可調(diào)控腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、血管新生、免疫逃逸等多種病理進程[13,14]。Yu等[15]研究表明,腫瘤外泌體miR-15-5p可增強喉癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。血清外泌體miR-941可作為喉癌診斷的重要標志物[16]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-20a在喉癌細胞及喉癌細胞分泌外泌體中顯著高表達。Xu等[17]發(fā)現(xiàn),miR-20a可調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞的功能。本文即探究了喉癌細胞外泌體中miR-20a對腫瘤相關(guān)巨噬細胞的影響及機制。

腫瘤微環(huán)境是一個復雜的系統(tǒng),由多種基質(zhì)細胞組成,包括腫瘤干細胞、血管內(nèi)皮細胞及免疫細胞等。巨噬細胞通常分為M1和M2兩種表型,其中M1型巨噬細胞具有抗腫瘤的作用,而M2型巨噬細胞能夠促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[18],腫瘤相關(guān)巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的重要免疫細胞,其功能以及表型與M2型巨噬細胞相似,可促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[19]。因此,在體外研究中可以使用M2型巨噬細胞作為腫瘤相關(guān)巨噬細胞的研究模型。M2型產(chǎn)生促腫瘤作用,依賴IL-4/IL-13或免疫復合物激活,分泌組織蛋白酶和絲氨酸蛋白酶等破壞內(nèi)皮細胞的基底層,促使腫瘤細胞遷移[20]。本文首先利用IL-4和IL-13的誘導獲得M2型巨噬細胞,然后將喉癌細胞外泌體與M2型巨噬細胞共孵育,發(fā)現(xiàn)喉癌細胞外泌體可促進M2型巨噬細胞的增殖,以及抑制M2型巨噬細胞的凋亡,所以推測喉癌外泌體具有調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞增殖和凋亡的功能。Su等[21]發(fā)現(xiàn),腫瘤相關(guān)巨噬細胞的激活可促進喉癌的淋巴管生成, Guo等[22]發(fā)現(xiàn),腫瘤相關(guān)巨噬細胞的激活可促進喉癌細胞化療敏感性,所以,我們也推測喉癌外泌體激活的腫瘤相關(guān)巨噬細胞可促進喉癌的發(fā)生發(fā)展。

miRNA是重要的外泌體內(nèi)含物,腸癌外泌體miR-934可促進M2型巨噬細胞極化[23],膀胱癌外泌體miR-21可激活腫瘤相關(guān)巨噬細胞[24]。本研究發(fā)現(xiàn)喉癌細胞以及其外泌體中miR-20a均高表達,并且發(fā)現(xiàn)喉癌外泌體miR-20a可促進M2型巨噬細胞的增殖,抑制M2型巨噬細胞的凋亡。PI3K/AKT信號通路是經(jīng)典的胞內(nèi)信號通路,其下游的基因如Nf-kB、VEGF、FOXO等,多是促增殖抑凋亡的因子[25],本研究發(fā)現(xiàn),喉癌細胞外泌體以及外泌體miR-20a可促進M2型巨噬細胞中PI3K和AKT的磷酸化,即PI3K/AKT信號通路激活,所以推測,喉癌外泌體可激活PI3K/AKT信號通路而調(diào)控M2型巨噬細胞的增殖和凋亡。

綜上所述,喉癌細胞外泌體miR-20a可促進M2型巨噬細胞的增殖,抑制凋亡,其機制可能為激活PI3K/AKT信號通路,但是miR-20a是通過靶向何種靶基因而發(fā)揮的調(diào)控作用還需進一步探究,并且外泌體miR-20a是否可作為喉癌診斷和治療的新靶點也需進一步探究。