汪 健，金順琪，2，黃 菲，張露蓉*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215007；2.蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 蘇州 215101）

三黃膠囊是蘇州市中醫(yī)院的經(jīng)典制劑（蘇藥制字Z04001094），其中包含大黃、黃芩、黃柏3 味中藥，能夠清熱解毒，在用于治療瘡瘍濕證，邪滯內(nèi)阻腸道之證時(shí)，充分體現(xiàn)了吳門醫(yī)派治“濕熱”以“清熱燥濕兼投并進(jìn)”的治法。方中大黃主要含蒽醌類成分如大黃素、大黃酸等[1-2]，黃芩多含黃酮類成分如黃芩苷、漢黃芩素等[3-4]，黃柏主要含生物堿類成分如鹽酸小檗堿[5-6]等，以上代表性成分分別是大黃、黃芩、黃柏含量測定中的指標(biāo)成分，也是其發(fā)揮藥效的主要活性成分，可作為藥材質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。

目前這三種單味藥材，已分別建立了多種含量測定方法，但三黃膠囊僅有一篇測定其中鹽酸小檗堿含量的報(bào)道[7]。含量測定作為藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，憑單一成分是遠(yuǎn)不夠的，因此，本實(shí)驗(yàn)綜合2020 版《中國藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)中對主要有效成分的含量測定，利用高效液相色譜法同時(shí)對三黃膠囊中11 種主要成分進(jìn)行含量測定，進(jìn)一步完善了三黃膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 液相色譜系統(tǒng)（DAD 二極管陣列檢測器）；純水儀（Millipore 默克milli-q 公司）；超聲波清洗機(jī)（南京先歐儀器制造有限公司）；電子天平（Mettler-Toledo 公司）。

1.2 試劑 甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)：203194）；超純水；無水乙醇（江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司，批號(hào)：20211101）；磷酸（上海聯(lián)試化工試劑有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)品：鹽酸小檗堿（批號(hào)：15062403）、黃芩苷（批號(hào)：18041007）、漢黃芩苷（批號(hào)：17010904）、黃芩素（批號(hào)：19112803）、漢黃芩素（批號(hào)：17012304）、大黃素甲醚（批號(hào)：16062404）購自上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度均大于98%；槲皮素（批號(hào)：081-9003）、大黃素（批號(hào)：110756-200110）、大黃酚（批號(hào)：110796-200310）購自中國藥品生物制品檢定所；蘆薈大黃素（批號(hào)：110795-201710）、大黃酸（批號(hào)：110757-200206）購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 藥材 三黃膠囊共10 批（批號(hào)：181107、190610、191211、200212、201030、201031、201101、201105、201106、220506），均源于蘇州市中醫(yī)醫(yī)院。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 稱取0.3 g 膠囊粉末，放于25 mL 容量瓶中，加入70%乙醇，使液面至刻度線，超聲1 h，待放冷后，補(bǔ)足70%乙醇，搖勻、過濾即得。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿、黃芩苷、槲皮素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚這11種標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇配成濃度為418.36、544.80、100.58、110.66、7.93、4.70、9.02、15.56、15.04、27.74、10.85 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件 根據(jù)文獻(xiàn)改良色譜條件[8]，考察不同條件下的分離效果，得到以下優(yōu)化的色譜條件。色譜柱：Agilent Extend-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：pH 2.5 的甲醇-磷酸水溶液；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫條件如表1。供試品及混合對照品色譜圖，見圖1 和圖2。

圖1 供試品溶液圖譜

圖2 混合對照品溶液色譜圖

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 選擇同一批次的三黃膠囊，按“2.1”中的方法提取樣品，并在相同的色譜條件下檢測6 次得到鹽酸小檗堿、黃芩苷、槲皮素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，RSD 分別為0.17%、0.37%、0.55%、0.27%、1.24%、1.59%、1.74%、0.41%、0.37%、0.60%、0.30%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇同一批次的三黃膠囊，將制得的樣品溶液分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 進(jìn)樣得到11 種化學(xué)成分的峰面積（同前），RSD 分別為1.92%、0.51%、0.43%、0.81%、1.88%、1.77%、0.73%、1.45%、0.71%、0.78%、0.97%，結(jié)果表明24 h 內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 選擇6 份同一批次的三黃膠囊，按同樣操作制備樣品溶液，并進(jìn)樣。計(jì)算得到11 種成分（同前） 平均含量的RSD 分別為0.89%、0.77%、1.10%、0.76%、0.84%、0.53%、0.98%、0.56%、1.50%、0.68%、0.84%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 線性關(guān)系考察 用甲醇將配好的混合對照品按濃度由高到低稀釋成5 份，把濃度（C）作為橫坐標(biāo)，峰面積（A）作為縱坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2）。

表2 11 種成分的回歸方程

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別把6 份已知含量的供試品與對照品溶液混合，進(jìn)樣，加樣回收率結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.6 含量測定 取10 批三黃膠囊提取得到10份供試品溶液，進(jìn)樣，計(jì)算膠囊中各成分的含量（見表4）。

表4 樣品含量測定結(jié)果（mg/粒）

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 應(yīng)用甲醇和乙醇分別進(jìn)行超聲提取，結(jié)果顯示（圖3）得到的圖譜峰型差異不大，其中乙醇提取的含量相對較高，并且考慮到乙醇較甲醇來說毒性低，危害小，故以乙醇作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑色譜圖

3.2 色譜條件的選擇

3.2.1 波長的選擇 通過紫外全波長掃描后，選擇比較波長為265 nm、280 nm、345 nm 時(shí)的色譜圖（圖4），當(dāng)波長為280 nm 的色譜峰整體分離效果較好，峰面積相對偏大，所以將280 nm 確定為檢測波長。

圖4 不同波長的色譜圖

3.2.2 pH 的選擇 流動(dòng)相方面選擇了三個(gè)不同pH（pH=2.5、pH=3.0、pH=3.5） 的甲醇-磷酸水溶液，當(dāng)pH 為2.5 的樣品各峰分離效果相對較好，即用磷酸調(diào)pH 2.5 時(shí)最佳（圖5）。

圖5 不同pH 的色譜圖

該實(shí)驗(yàn)建立了三黃膠囊中每味藥的主要指標(biāo)成分含量測定的方法，能夠同時(shí)測定11 種主要指標(biāo)成分，該法簡便、穩(wěn)定、可靠。結(jié)合前期建立的指紋圖譜，可以全面控制該制劑質(zhì)量，使其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)更加完尚。