白路遙,楊雪飛,魯春華*,沈月毛
(1.山東大學(xué)藥學(xué)院天然產(chǎn)物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250012;2.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物資源與生物技術(shù)研究室,云南 昆明 650201)
流蘇子[Coptosapelta diffusa (Champ.ex Benth.)Steenis]是茜草科流蘇子屬植物,主要分布于中國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南各地和日本的溫帶地區(qū)[1]。《中華本草》記載其根為藥用部位。將其根部加水煮沸后清洗,或直接將根研末調(diào)涂患處可治療皮炎、濕疹瘙癢、蕁麻疹、風(fēng)濕痹痛、瘡疥等皮膚病。作為一種傳統(tǒng)中草藥,其化學(xué)成分和藥理活性研究較少。目前,從該植物中已報(bào)道的化學(xué)成分共約50 個(gè)[2-4],包括蒽醌、萘醌、香豆素和萜類等。本課題組前期已從其地上部分分離得到結(jié)構(gòu)新穎的環(huán)烯醚萜苷和愈創(chuàng)木烯型倍半萜等化合物[3]。
為進(jìn)一步挖掘流蘇子中的化學(xué)成分,本實(shí)驗(yàn)對(duì)其根部的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分離,共鑒定了12 個(gè)化合物(圖1),包括6 個(gè)萘醌lapachol(1)、hydroxyhydrolapachol(2)、dehydro-α-lapachone(3)、α-lapachone(4)、rhinacantin A(5)和β-lapachone(6),2 個(gè)蒽醌2-carbomethoxyanthraquinone (7) 和7-hydroxy-2-methylanthraquinone(8),1 個(gè)香豆素isoscopoletin(9),1 個(gè)環(huán)烯醚萜alyxialactone(10),1 個(gè)芳香化合物(3S)-3-(hydroxymethyl)-3H-isobenzofuran-1-one(11)和1 個(gè)木脂素(7’S,8S,8’R)-4,4’-dihydroxy-3,3’,5,5’-tetramethoxy-7,9-epoxylignan-9’-ol-7-one(12)。通過(guò)紙片擴(kuò)散法篩選了化合物1~12 的抗菌活性,并利用微量稀釋法進(jìn)行了最小抑制濃度測(cè)定。此外,采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)對(duì)主要成分拉帕醇(lapachol,1)進(jìn)行了含量測(cè)定。
圖1 化合物1~12 的化學(xué)結(jié)構(gòu)
Bruker Avance 400 MHz 型核磁共振儀(德國(guó)Bruker 公司);分析型高效液相色譜儀Thermo Scientific UltiMate 3000 (Hypersil GOLDTM,5 μm,250 mm ×4.6 mm);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-100 (BUCHI Labortechnik AG);柱色譜硅膠(200~300 目,青島海洋化工廠);硅膠薄層層析板(煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司);葡聚糖凝膠(25~100 μm,GE Healthcare Bio-Sciences AB);氘代試劑(上海新鉑化學(xué)有限公司);石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇(分析純,天津恒興化學(xué)制造有限公司)。酵母提取物(OXOID),胰蛋白胨(OXOID),氯化鈉(國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。
流蘇子根于2020 年10 月采集于廣西防城港市上思縣南屏鄉(xiāng)汪樂(lè)村向十萬(wàn)大山森林公園方向平龍山木材檢查站(北緯21°51′47.37″,東經(jīng)107°53′0.85″,509 米處)。由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所楊雪飛、楊錦超鑒定為流蘇子 [Coptosapelta diffusa(Champ.ex Benth.)Steenis],標(biāo)本號(hào)為yangxf0209,收藏于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館??咕鷮?shí)驗(yàn)所用病原指示菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis MC2155)、變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris CPCC160013)和白色念珠菌(Candida albicans 5314)菌株均保存于山東大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
新鮮流蘇子根剪成小段,自然風(fēng)干稱重(600.0 g)。用95 %乙醇浸泡1 周,超聲輔助提取30 min,共提取3 次,合并乙醇提取液,40℃減壓濃縮得提取物浸膏(40.0 g)。該提取物首先經(jīng)正相硅膠柱層析(250.0 g),石油醚-乙酸乙酯(100 ∶1~10 ∶1,v/v)梯度洗脫,根據(jù)TLC 檢測(cè)(紫外和磷鉬酸顯色) 結(jié)果分為25 個(gè)組分(Fr.A~Y)。
Fr.J(2.5 g)經(jīng)正相硅膠柱層析(80.0 g),石油醚-乙酸乙酯(200 ∶1~100 ∶1) 梯度洗脫,得到化合物1(2.2 g)。Fr.K(104.9 mg)經(jīng)正相硅膠柱層析(10.0 g),石油醚-乙酸乙酯(200 ∶1~100 ∶1)梯度洗脫,得到組分Fr.K1~K3。Fr.K1(36.8 mg)經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析,二氯甲烷-甲醇(1 ∶3)洗脫,得到化合物3(10.2 mg)。Fr.K2(60.1 mg)經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析,二氯甲烷-甲醇(1 ∶3)洗脫,得化合物7(4.9 mg)。Fr.L(88.1 mg)經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析,二氯甲烷-甲醇(1 ∶3)洗脫,得化合物4(5.1 mg)。Fr.Q(25.8 mg)經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析,MeOH 洗脫,得化合物8(1.7 mg)。Fr.R 經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析,甲醇洗脫,得到7 個(gè)組分(Fr.R1~R7)。Fr.R2(11.7 mg)經(jīng)正相硅膠柱層析(2.5 g),石油醚-乙酸乙酯(30 ∶1)等度洗脫,得到化合物6(2.2 mg)。Fr.U(900.0 mg)經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析,MeOH 洗脫,得到19 個(gè)組分(Fr.U1~U19)。Fr.U8(270.0 mg)經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析,甲醇洗脫合并后又經(jīng)正相硅膠柱層析(2.0 g),二氯甲烷-甲醇(500 ∶1) 等度洗脫,得到化合物2(12.6 mg)、5(2.5 mg)和11(3.4 mg)。Fr.U13(31.5 mg)經(jīng)正相硅膠柱層析(2.0 g),二氯甲烷-甲醇(200 ∶1)等度洗脫,得到化合物9(9.9 mg)。Fr.W(0.6 g)經(jīng)正相硅膠柱層析(12.0 g),石油醚-乙酸乙酯(15 ∶1~1 ∶2)梯度洗脫,得到Fr.W1~W6。Fr.W2(106.5 mg)經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析,甲醇洗脫,得到化合物12(2.2 mg)。Fr.W4(120.0 mg)經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析,甲醇洗脫后又經(jīng)正相硅膠柱層析(1.5 g),二氯甲烷-甲醇(100 ∶1~50 ∶1)梯度洗脫,得到化合物10(7.8 mg)。
化合物1:黃色片狀結(jié)晶,C15H14O3。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.11(1H,dd,J=7.7,1.4 Hz,H-8),8.09(1H,dd,J=7.7,1.4 Hz,H-5),7.74 (1H,td,J=7.7,1.4 Hz,H-7),7.67(1H,td,J=7.7,1.4 Hz,H-6),7.30(1H,s,OH),5.21(1H,m,H-12),3.31(2H,d,J=7.3 Hz,H-11),1.79 (3H,s,CH3-14),1.68 (3H,s,CH3-15);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:184.5(C-1),181.7(C-4),152.7(C-3),134.8(C-7),133.8(C-13),133.0(C-9),132.8(C-6),129.5(C-10),126.8(C-8),126.1(C-5),123.5(C-2),119.7(C-12),25.7(C-15),22.6(C-11),17.9(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]對(duì)比,鑒定化合物為拉帕醇lapachol。
化合物2:黃色粉末,C15H16O4。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.12(1H,dd,J=7.6,1.5 Hz,H-5),8.08(1H,dd,J=7.6,1.4 Hz,H-8),7.76 (1H,td,J=7.6,1.4 Hz,H-6),7.69(1H,td,J=7.6,1.5 Hz,H-7),2.71(2H,t,J=6.6 Hz,H-11),1.70(2H,t,J=6.6 Hz,H-12),1.31(6H,s,CH3-14,CH3-15);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:184.8(C-4),181.3(C-1),153.0(C-2),134.9(C-6),133.0(C-7),129.5(C-9),132.9(C-10),126.8(C-5),126.2(C-8),124.7(C-3),71.0(C-13),41.6(C-12),29.1(C-14,15),18.3(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]對(duì)比,鑒定化合物為hydroxyhydrolapachol。
化合物3:黃色粉末,C15H12O3。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.10 (2H,dd,J=7.0,1.7 Hz,H-5,8),7.71 (1H,td,J =7.0,1.7 Hz,H-6),7.68 (1H,td,J =7.0,1.7 Hz,H-7),6.66(1H,d,J=10.0 Hz,H-11),5.73(1H,d,J=10.0 Hz,H-12),1.56 (6H,s,CH3-14,15);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:181.9(C-1),179.9(C-4),152.5(C-3),134.0(C-6),133.2(C-7),131.6(C-10),131.5(C-9),130.9(C-12),126.3(C-5),126.3(C-8),117.9(C-2),115.5(C-11),80.5(C-13),28.4(C-14,15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]對(duì)比,鑒定化合物為dehydro-α-lapachone。
化合物4:黃色粉末,C15H14O3。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.09(1H,dd,J=6.6,1.8 Hz,H-8),8.07(1H,dd,J=7.4,1.7 Hz,H-5),7.68(1H,m,H-7),7.66(1H,m,H-6),2.63(2H,t,J=6.6 Hz,C-11),1.82(2H,t,J=6.6 Hz,C-12),1.44(6H,s,CH3-14,15);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:184.4(C-1),180.1(C-4),154.7(C-3),133.8(C-7),132.8(C-6),132.0(C-9),131.2(C-10),126.4(C-5),126.0(C-8),120.2(C-2),78.2(C-13),31.4(C-12),26.5(C-14,15),16.8(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]對(duì)比,鑒定化合物為α-lapachone。
化合物5:黃色粉末,C15H14O4。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.04(1H,m,H-5),8.02(1H,m,H-8),7.63(1H,m,H-6),7.60(1H,m,H-7),3.82(1H,m,H-12),2.83(1H,m,H-12a),2.65(1H,m,H-12b),1.41(3H,s,CH3-14),1.35(3H,s,CH3-15);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:184.8(C-1),179.5(C-4),153.8(C-3),134.0(C-7),133.2(C-6),132.1(C-9),131.2(C-10),126.4(C-5),126.0(C-8),118.2(C-2),80.2(C-13),68.4(C-12),25.4(C-11),24.7(C-15),21.7(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]對(duì)比,鑒定化合物為rhinacantin A。
化合物6:黃色粉末,C15H14O3。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.91(1H,dd,J=7.7,1.4 Hz,H-8),7.76(1H,dd,J=7.7,1.3 Hz,H-5),7.63 (1H,td,J=7.7,1.4 Hz,H-6),7.48(1H,td,J=7.6,1.3Hz,H-7),2.44(2H,t,J=6.7 Hz,C-11),1.81(2H,t,J=6.6 Hz,C-12),1.40(6H,s,CH3-14,15);13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ:179.9(C-1),178.6(C-2),162.1(C-4),134.8(C-6),132.7(C-10),130.7(C-7),130.2(C-9),128.6(C-8),124.1(C-5),112.8(C-3),79.3(C-13),31.6(C-12),26.8(C-14,15),16.2(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對(duì)比,鑒定化合物為β-lapachone。
化合物7:黃色粉末,C16H10O4。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.95(1H,d,J=1.7 Hz,H-1),8.41(1H,dd,J=8.1,1.7 Hz,H-3),8.39(1H,d,J=8.1 Hz,H-4),8.36(1H,m,H-8),8.35(1H,m,H-5),7.84(1H,m,H-6),7.83 (1H,m,H-7),4.02 (3H,s,OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:182.6(C-9),182.3(C-10),165.6(COO),136.1 (C-4a),135.2 (C-9a),134.6 (C-3),134.5 (C-6),134.4 (C-7),133.6 (C-2),133.5 (C-10a),133.4(C-8a),128.7(C-1),127.6(C-4),127.5(C-8),127.4(C-5),52.8(OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對(duì)比,鑒定化合物為2-carbomethoxyanthraquinone。
化合物8:黃色粉末,C15H10O3。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:11.05(1H,s,OH),8.09(1H,m,H-5),8.07(1H,m,H-4),7.97(1H,s,H-1),7.71(1H,d,J =8.0 Hz,H-3),7.50 (1H,d,J =2.6 Hz,H-8),7.24(1H,dd,J =8.6,2.6 Hz,H-6),2.50(3H,s,CH3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:183.3(C-9),181.5(C-10),163.5(C-7),145.2(C-2),135.7(C-3),135.7(C-9a),133.5(C-8a),131.4(C-4a),130.2(C-4),127.3(C-1),127.3 (C-5),125.7 (C-10a),122.0 (C-6),112.7(C-8),21.8(CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對(duì)比,鑒定化合物為7-hydroxy-2-methylanthraquinone。
化合物9:黃色粉末,C10H8O4。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.92(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),7.22(1H,s,H-5),6.79(1H,s,H-8),6.22(1H,d,J=9.4 Hz,H-3),3.82(3H,s,OCH3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:161.2(C-2),151.7(C-6),150.0(C-9),145.7(C-7),144.9(C-4),112.1(C-5),110.9(C-10),110.0(C-3),103.2(C-8),56.4(OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對(duì)比,鑒定化合物為isoscopoletin。
化合物10:白色粉末,C10H16O4。1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:4.39(1H,m,H-1a),4.11(1H,m,H-7),4.08 (1H,m,H-1b),3.80 (1H,m,H-11a),3.70(1H,m,H-11b),2.56(1H,m,H-4),2.55(1H,m,H-5),2.22(1H,m,H-9),2.16(1H,m,H-6a),1.77(1H,m,H-8),1.62(1H,m,H-6b),1.05(3H,d,J =6.8 Hz,CH3-10);13C NMR (100 MHz,CD3OD)δ:176.0 (C-3),76.0(C-7),69.5(C-1),59.3(C-11),46.3(C-4),42.6(C-9),42.2(C-8),40.7(C-6),35.4(C-5),12.2(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]對(duì)比,鑒定化合物為alyxialactone。
化合物11:黃色粉末,C9H8O3。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.86(1H,d,J=7.6 Hz,H-4),7.63(1H,m,H-5),7.50(1H,t,J=7.6 Hz,H-6),7.45(1H,d,J=7.6 Hz,H-7),5.50 (1H,m,H-3),4.07 (1H,dd,J =8.4,3.4 Hz,H-10a),3.86(1H,dd,J=12.5,5.6 Hz,H-10b);13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ:170.4 (C-1),146.6(C-9),134.3(C-5),129.6(C-6),126.5(C-8),125.9(C-4),122.1(C-7),81.7(C-3),64.0(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對(duì)比,鑒定化合物為(3S)-3-(hydroxymethyl)-3H-isobenzofuran-1-one。
化合物12:白色粉末,C22H26O9。1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.40 (2H,s,H-2,H-6),6.72(2H,s,H-2’,H-6’),4.64 (1H,m,H-7’),4.27 (1H,m,H-8),4.22(1H,m,H-9a),4.19(1H,m,H-9b),3.92(6H,s,H-3’a,H-5’a),3.86 (6H,s,H-3a,H-5a),3.67(2H,m,H-9),2.64 (1H,m,H-8’);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:198.9(C-7),147.8(C-3),147.8(C-3’),147.7(C-5),147.7(C-5’),141.3(C-4),141.3(C-4’),131.5 (C-1’),127.3 (C-1),106.3 (C-2),106.3(C-6),103.8(C-2’),103.8(C-6’),84.0(C-7’),70.2(C-9),59.9(C-9’),55.5(3’a,5’a-OCH3),55.3(3a,5a-OCH3),53.4(C-8’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對(duì)比,鑒定化合物為(7’S,8S,8’R)-4,4’-dihydroxy-3,3’,5,5’-tetramethoxy-7’,9-epoxylignan-9’-ol-7-one。
4.1 紙片擴(kuò)散法測(cè)抗菌活性 利用紙片擴(kuò)散法[17]測(cè)定化合物1~12 的抗菌活性。從-80 ℃冰箱中取出保存于20%甘油管中的各指示菌,解凍后在LB 平板上劃線,37 ℃培養(yǎng)10~12 h。挑取單克隆菌株分別接種于1 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中,置于220 rpm,37 ℃搖床中培養(yǎng)過(guò)夜。取LB 液體培養(yǎng)基將菌液稀釋100倍,混勻后倒入滅菌的LB 平板中,凝固后待用。用鑷子將直徑6 mm 的圓形濾紙片夾起,加入2 μL 的化合物溶液(各化合物分別用甲醇溶解,濃度為20 μg/μL),揮干溶劑后放置于含指示菌的LB 平板上,倒置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h 后觀察并記錄抑菌圈的有無(wú)及大小,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 抗菌結(jié)果(抑菌圈直徑大小單位:mm;N:無(wú)抑菌圈)
4.2 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法[18]測(cè)定上述有抑菌活性化合物的MIC。將菌液用無(wú)菌的液體LB 培養(yǎng)基稀釋104倍。首先,在96 孔板中加入100 μL 的LB 液體培養(yǎng)基,采用對(duì)倍稀釋法加入藥物,每個(gè)孔加入菌液100 μL,重復(fù)3 次。藥物終濃度分別為128、64、32、16、8、4、2 和1 μg/mL。陰性對(duì)照:僅加LB 液體培養(yǎng)基和菌液;陽(yáng)性對(duì)照:加入卡那霉素,藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2 和1 μg/mL。37 ℃培養(yǎng)16~24 h,沒(méi)有可見(jiàn)菌生長(zhǎng)的最低濃度即為MIC 值。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 化合物對(duì)4 種病原菌的MIC(μg/mL)
5.1 色譜條件 流動(dòng)相由0.5‰甲酸水溶液(A)和乙腈(B)組成,流速為1 mL/min,50% B(0~30 min)等度洗脫。柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。
5.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液:精密稱取lapachol 3.500 mg,置入具塞的5 mL 容量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度定容,搖晃均勻,制成濃度為0.7 mg/mL 的溶液。
供試品溶液:精密稱取3.306 0 g 流蘇子干燥根,用95%乙醇浸泡1 周,超聲輔助提取30 min,共提取3 次。合并提取液,40℃減壓濃縮得到184 mg 乙醇提取物,甲醇溶解,置入具塞的10 mL 容量瓶中,定容至刻度,搖晃均勻,通過(guò)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后,取濾液100 μL 稀釋至1 mL 為供試品溶液。
5.3 線性關(guān)系的考察 將對(duì)照品溶液用甲醇稀釋成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液(700、350、175、87.5、43.75 和21.875 mg/L)進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸。測(cè)定一系列不同濃度的對(duì)照品溶液的峰面積,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),計(jì)算得到lapachol 的線性回歸方程:y=1.7239x+8.9959,其中x 為濃度,y 為峰面積,回歸系數(shù)r=0.9999 (圖2)。表明lapachol 在21.875~700 mg/L 范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。
圖2 lapachol 的標(biāo)準(zhǔn)曲線
5.4 樣品的含量測(cè)定 按外標(biāo)法,測(cè)得lapachol 的峰面積為211.9190,計(jì)算出流蘇子根中l(wèi)apachol 的含量為3.56 g/kg(干重)。
本研究對(duì)流蘇子根的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分離,共鑒定了12 個(gè)化合物的結(jié)構(gòu),其中4~6 和10~12 為首次從該植物中分離得到。采用紙片擴(kuò)散法和微量稀釋法進(jìn)行了抗菌活性篩選,結(jié)果表明:1~4 對(duì)恥垢分枝桿菌表現(xiàn)出較好的抗菌活性,其MIC 值為8~32 μg/mL;化合物6 對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和變形桿菌表現(xiàn)出較好的抗菌活性,其MIC 分別為8、8和16 μg/mL。通過(guò)HPLC 定量分析測(cè)定主要成分lapachol 在根(干重)中的含量為3.56 g/kg,表明流蘇子可以作為拉帕醇的資源植物。Lapachol 是一種天然存在的1,4-萘醌類成分,具有抗腫瘤[19]、抗寄生蟲(chóng)[20]、抗瘧疾[21]、抗菌[22]等多種藥理活性。該研究結(jié)果為流蘇子根抗菌消炎的民間藥用價(jià)值提供了科學(xué)依據(jù),并為其深入研究與開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。