白綏明，辛雅明，齊 盟，胡 亮，楊銀鳳

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.清澗縣動物疫病預防控制中心，陜西 榆林 718399；3.鄂爾多斯市動物疫病預防控制中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000；4.巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學研究所，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

防御素（defensin）是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一類陽離子抗菌肽，最早從兔肺巨噬細胞和中性粒細胞胞漿顆粒中分離得到［1］， 具有多種生物學作用，是動物機體天然免疫的重要組成部分［2］。 哺乳動物防御素可以殺傷多種病原微生物及某些腫瘤細胞［3］。 β-防御素（β-defensin）由胃腸道、肝臟、皮膚和肺內(nèi)的吞噬細胞、白細胞和上皮細胞產(chǎn)生，是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要通過發(fā)揮抗微生物活性和免疫調(diào)控作用提高機體抗病能力［4］。 在綿羊體內(nèi)有2 種β-防御素，分別在氣管和回腸中發(fā)現(xiàn)了綿羊β-防御素-1 （sheep β-defensin-1，SBD-1）和綿羊β-防御素-2（sheep β-defensin-2，SBD-2）［5］。

益生菌作為飼料添加劑能夠改善動物胃腸道功能，參與機體免疫調(diào)節(jié)［6-7］。 大量研究表明，益生菌可以促進動物胃腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及增強機體先天性免疫功能［8］。 枯草芽孢桿菌作為一種飼用添加劑，應用范圍廣泛。 王佩等［9］研究表明枯草芽孢桿菌可以誘導綿羊瘤胃上皮細胞（ovine ruminal epithelial cells，ORECs） 中SBD-1 的表達且效果顯著。 趙霏霏等［10］研究發(fā)現(xiàn)熱滅活的枯草芽孢桿菌同樣可以顯著誘導ORECs 中SBD-1的表達。 益生性大腸桿菌Nissle 1917 可以誘導人結腸腺癌上皮細胞Caco-2 中人β-防御素-2（human β-defensin-2，hBD-2）的表達，其有效誘導成分是大腸桿菌的鞭毛蛋白［11］。 釀酒酵母細胞壁成分可以誘導ORECs 中SBD-1 的表達［12］。也有研究表明釀酒酵母培養(yǎng)物可以誘導ORECs中SBD-1 的表達［13］。 上述研究表明，益生菌主要通過細胞壁成分和代謝產(chǎn)物影響機體免疫系統(tǒng)?？莶菅挎邨U菌培養(yǎng)上清液中的代謝產(chǎn)物按化學結構分為多肽蛋白類和大環(huán)內(nèi)酯類［14］，其培養(yǎng)上清液中的代謝產(chǎn)物作為發(fā)揮免疫作用的成分之一，與ORECs 中的防御素的表達關系尚未有研究報道。 因此， 筆者開展枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 中SBD-1 表達影響的研究，為從益生菌胞外代謝產(chǎn)物對上皮細胞防御素表達影響的角度揭示益生菌提高動物免疫力和發(fā)揮免疫調(diào)控作用的機制提供參考， 也為更好地將枯草芽孢桿菌開發(fā)為安全綠色的飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種及綿羊瘤胃組織

枯草芽孢桿菌CMCC 63501 購于中國微生物菌種網(wǎng)， 綿羊瘤胃組織來源于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市某屠宰場。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基、青鏈霉素，均購自Gibico公司；胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS），購自四季青公司；綿羊β-防御素-1（DEFβ1）ELISA 檢測試劑盒，購自武漢新啟迪公司；Cell Counting kit-8試劑，購自Proteintech 公司；總RNA 提取試劑盒，購自Axygen 公司。

1.1.3 主要儀器多功能酶標儀，Biotek 公司產(chǎn)品；VIIA7 實時熒光定量PCR 儀，Applied Biosystems 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 原代綿羊瘤胃上皮細胞的培養(yǎng)

將瘤胃組織鈍性分離肌層和漿膜層， 保留黏膜層，用含有1 mg/mL 青鏈霉素、50 μg/mL 慶大霉素、200 μg/mL 兩性霉素的PBS 溶液反復清洗瘤胃組織5～6 次，然后用0.25%Trypsin-0.02%EDTA 消化液于37 ℃恒溫箱進行消化，共消化7 次，消化時間依次為35、25、10、5、3、3、2 min。 每次消化完成后在顯微鏡下觀察， 當出現(xiàn)大量圓而亮的細胞時收集細胞，置于終止液（含20%胎牛血清的DMEM/F12 液體培養(yǎng)基）中終止消化，消化完成后，將收集的消化液用200 目細胞篩過濾3 次，1 500 r/min 離心5 min，收集沉淀，用完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清、200 μg/mL 青鏈霉素、100 μg/mL兩性霉素、2 μg/mL 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑、β-巰基乙醇的DMEM/F12 液體培養(yǎng)基）重懸為均勻的細胞懸液， 裝入細胞瓶置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)3 d 后觀察細胞是否貼壁，每隔3 d換液1 次，當細胞長滿細胞瓶80%～90%進行傳代用于后續(xù)試驗。

1.2.2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液的制備

將枯草芽孢桿菌接種于液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)72 h 后，5 000 r/min 離心10 min，分別收集菌體沉淀與培養(yǎng)上清原液。菌體沉淀用平板計數(shù)法進行計數(shù)，其菌液濃度為6×1013CFU/mL，再按照倍比稀釋法用DMEM/F12 液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1012、1011、1010、109、108、107CFU/mL?？莶菅挎邨U菌培養(yǎng)上清原液用0.22 μm 的濾器過濾除菌后， 按照同樣的稀釋方法將其稀釋為菌液濃度為1012、1011、1010、109、108、107CFU/mL 所對應的上清液，用于后續(xù)試驗。

1.2.3 Cell Counting kit-8（CCK-8）方法檢測枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 的毒性作用

將ORECs 傳于96 孔板， 放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，試驗設置對照組、空白組、試驗組，每組設置6 個重復， 向培養(yǎng)板每孔中加入10 μL 不同濃度（1012、1011、1010、109、108、107CFU/mL） 的枯草芽孢桿菌對應的培養(yǎng)上清液孵育24 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液孵育2 h，用酶標儀測定每孔在450 nm 處的吸光度后計算細胞存活率。 細胞存活率 （%）=［（試驗組OD450nm-空白組OD450nm）/（對照組OD450nm-空白組OD450nm）］×100。用篩選出的對細胞無毒性的最大濃度刺激不同時間（0、2、4、8、12、24、36 h），篩選對細胞無毒性的最大作用時間。

1.2.4 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 的刺激試驗

1.2.4.1試驗分組及處理

將6 孔板中的ORECs 用DPBS 清洗2 次，每孔加入DMEM/F12 基礎培養(yǎng)基饑餓處理24 h，之后在每孔中加入對ORECs 無明顯毒性的不同濃度（1011、1010、109、108、107CFU/mL）的 枯 草 芽 孢 桿菌對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 8 h（通過預試驗確定）， 同時用相同稀釋方法稀釋的LB 培養(yǎng)基做對照，DMEM/F12 基礎培養(yǎng)基作為空白對照，每組設置3 個重復，使用熒光定量PCR（qPCR）技術和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法篩選最佳刺激濃度。使用篩選出的最佳刺激濃度分別刺激ORECs 0、2、4、8、12、24 h，每組設置3 個重復，使用qPCR 技術和ELISA 方法篩選最佳刺激時間。

1.2.4.2 ORECs 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

ORECs 總RNA 的提取參照總RNA 提取試劑盒產(chǎn)品說明書進行操作，用酶標儀檢測提取的總RNA在260 nm 和280 nm 波長下的吸光度，分析其濃度和純度。然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Yeasen）說明書將RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 qPCR 技術檢測SBD-1基因的mRNA相對表達量

內(nèi)參基因β-actin 和目的基因SBD-1 的特異性引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，引物信息見表1。 qPCR 試驗條件按試劑盒說明書進行操作，參照金鑫等［15］報道的qPCR試驗方法檢測目的基因SBD-1 的mRNA 相對表達量。 每個樣品均進行3 次重復反應。

表1 qPCR 試驗內(nèi)參基因及SBD-1 基因引物信息

1.2.4.4 ELISA方法檢測SBD-1 蛋白表達量

按照試劑盒說明書進行ELISA 試驗， 使用Excel 2019 軟件繪制標準曲線得到二次多項式擬合方程， 根據(jù)該方程和各樣品的OD450nm計算SBD-1 蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計分析

使用GraPhPad Prism 7 軟件對試驗結果進行作圖和統(tǒng)計學分析，試驗結果用“平均值±標準差”表示，P＜0.05 表示有顯著差異，P＜0.01 表示有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 ORECs 原代培養(yǎng)結果

ORECs 培養(yǎng)結果如圖1 所示， 剛裝瓶的細胞大小均一、折光度高，亮而圓的細胞為上皮細胞，而折光度低、大小及形態(tài)不規(guī)則的是角質(zhì)細胞（見圖1A）。 培養(yǎng)4 d 的細胞貼壁呈島嶼狀分布（見圖1B）。 培養(yǎng)6 d 的細胞生長狀況良好，細胞連接成片狀生長（見圖1C）。培養(yǎng)8 d 的細胞胞質(zhì)均一，基本長滿整個瓶底 （見圖1D）， 此時可進行傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。

圖1 ORECs 原代培養(yǎng)（100×）

2.2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 的毒性作用結果

用CCK-8 方法檢測枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 的毒性作用。由圖2A 可知，用枯草芽孢桿菌濃度為1012CFU/mL 對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 24 h 時， 與對照組相比，ORECs 發(fā)生了明顯（P＜0.01）的死亡。 因此，選用枯草芽孢桿菌濃度為107、108、109、1010、1011CFU/mL 對應的培養(yǎng)上清液為最佳刺激濃度的篩選范圍。 由圖2B 可知，用對細胞無毒性作用的最大的枯草芽孢桿菌濃度（1011CFU/mL）對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 36 h時，與對照組相比ORECs 發(fā)生了明顯（P＜0.01）的死亡， 故選用0、2、4、8、12、24 h 作為最佳刺激時間的篩選范圍。

圖2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 存活率的影響

2.3 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對ORECs 中SBD-1 表達影響的結果

2.3.1 最佳刺激濃度的篩選結果

用不同濃度 （1011、1010、109、108、107CFU/mL）的枯草芽孢桿菌對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 8 h，從基因和蛋白水平分析最佳的刺激濃度。 由圖3A 可知，枯草芽孢桿菌的濃度分別為109、1010、1011CFU/mL 時對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs后，SBD-1 基因的mRNA 相對表達量均顯著 （P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于對照組；枯草芽孢桿菌的濃度為1011CFU/mL 對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 時，SBD-1 基因的mRNA 相對表達量達到了最高值，與對照組相比呈極顯著（P＜0.01）差異，且與用相同稀釋方法稀釋的LB 培養(yǎng)基相比，呈極顯著（P＜0.01）差異。 ELISA 分析結果顯示（見圖3B）， 枯草芽孢桿菌的濃度分別為108、109、1010、1011CFU/mL 時對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs后，SBD-1 蛋白表達量均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于對照組；枯草芽孢桿菌的濃度為1011CFU/mL 時對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 后，SBD-1 蛋白的表達量達到了最高值， 與對照組相比呈極顯著（P＜0.01）差異。 上述結果表明，枯草芽孢桿菌的濃度為1011CFU/mL 時對應的培養(yǎng)上清液為刺激ORECs 中SBD-1 表達的最佳濃度。

圖3 不同濃度枯草芽孢桿菌對應的培養(yǎng)上清液對ORECs 中SBD-1 表達的影響

2.3.2 最佳刺激時間的篩選結果

用篩選出的最佳刺激濃度的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液刺激ORECs 0、2、4、8、12、24 h，從基因和蛋白水平分析最佳的刺激時間。 由圖4A 可知，刺激24 h 時SBD-1 基因的mRNA 相對表達量達到了最高值，與空白對照組相比呈極顯著（P＜0.01）差異。 ELISA 分析結果表明（見圖4B），用最佳刺激濃度刺激24 h 時，SBD-1 蛋白表達量達到了最高值，與空白對照組相比呈極顯著（P＜0.01）差異。以上結果提示，ORECs 中SBD-1 基因的mRNA 相對表達量與SBD-1 蛋白表達量均在刺激24 h 時達到最高值，結果表明24 h 為最佳刺激時間。

圖4 最佳刺激濃度的培養(yǎng)上清液刺激不同時間對ORECs 中SBD-1 表達的影響

3 討論

近年來， 隨著家畜舍飼和半舍飼飼養(yǎng)模式的逐漸推廣， 隨之而來的是養(yǎng)殖成本的提高以及感染各種傳染病的風險性升高［16］。 我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019 年發(fā)布公告，自2020 年1 月起，我國飼料中全面禁止添加抗生素， 以此減少濫用抗生素造成的危害［17］。 抗生素作為飼料添加劑過度使用不僅引起耐藥菌的出現(xiàn)和傳播，而且對人、動物和環(huán)境造成危害［18］。 防御素是內(nèi)源性抗菌肽中的一個大家族，它與傳統(tǒng)抗生素的抗菌機理不同，即防御素主要作用于病原微生物的細胞膜， 病原微生物不易對其產(chǎn)生抗性［19］。 β-防御素對動物機體的先天性免疫有著極其重要的作用， 因此防御素可以作為一種天然、綠色替抗產(chǎn)品，但是由于其自身表達量很低， 再加上體外生產(chǎn)過程難以實現(xiàn)及成本過高， 因此造成了防御素難以應用于生產(chǎn)實踐當中。 有研究表明給動物飼用益生菌可以誘導其防御素的表達， 因此在飼料中添加益生菌及其有效成分誘導體內(nèi)的防御素表達可能會成為一種新型的方式來替代抗生素的作用。

枯草芽孢桿菌作為益生菌的一種， 添加到飼料中飼喂動物可以增強動物機體胃腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)， 增加養(yǎng)分消化率和飼料轉(zhuǎn)化率來改善其生長性能， 還可提高機體的免疫力從而提高動物的健康狀況［20］。 本實驗室前期的研究已經(jīng)證明枯草芽孢桿菌、 滅活菌以及枯草芽孢桿菌細胞壁［21］均可以誘導ORECs SBD-1 的增加，但是對其有效成分尚不清楚， 本試驗在前期的研究基礎上探討枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液中的代謝產(chǎn)物作為益生菌發(fā)揮免疫作用的有效成分之一， 是否可以誘導ORECs SBD-1 的表達。 本試驗選取王佩等［9］的研究中使用的枯草芽孢桿菌的濃度作為依據(jù)， 選取了107、108、109、1010、1011、1012CFU/mL 6 個 濃 度 作為研究對象，CCK-8 試驗結果顯示，當枯草芽孢桿菌的濃度為1012CFU/mL 對應的培養(yǎng)上清液刺激36 h 時，ORECs 發(fā)生了明顯的死亡，在篩選最佳濃度和最佳時間時應當在表現(xiàn)無明顯毒性作用的濃度和時間范圍內(nèi)進行， 排除高濃度枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物對細胞產(chǎn)生毒性從而導致細胞防御性的產(chǎn)生SBD-1 的可能性。 在最佳濃度的篩選過程中，為了使試驗結果更加準確，在試驗設計時，按照倍比稀釋法用無抗生素的DMEM/F12 基礎培養(yǎng)基 調(diào) 整 菌 液 濃 度 為1012、1011、1010、109、108、107CFU/mL，按照同樣的稀釋方法將其稀釋為菌液濃度為1012、1011、1010、109、108、107CFU/mL 所對應的培養(yǎng)上清液，同時設置相同稀釋方法稀釋過的LB培養(yǎng)基作陰性對照，以排除LB 培養(yǎng)基的作用。 結果顯示， 低濃度的枯草芽孢桿菌對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs SBD-1 的表達效果不明顯，但隨著枯草芽孢桿菌的濃度升高， 其培養(yǎng)上清液的刺激作用也隨著增強，且與各個濃度相對應的LB 培養(yǎng)基刺激組相比，培養(yǎng)上清液的作用均高于LB 培養(yǎng)基的作用， 說明枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液中的代謝產(chǎn)物是誘導ORECs SBD-1 表達的有效刺激成分。當枯草芽孢桿菌的濃度為1011CFU/mL 對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 24 h 時，SBD-1 的mRNA和蛋白表達量達到了最高， 但是隨著枯草芽孢桿菌的濃度進一步升高和刺激時間的延長， 其對應的培養(yǎng)上清液刺激ORECs 時，細胞出現(xiàn)了明顯的死亡， 說明太高的劑量或刺激時間反而會出現(xiàn)抑制作用，由此推測在一定的濃度和時間內(nèi)，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液誘導ORECs SBD-1 的表達可能是機體實現(xiàn)自身穩(wěn)態(tài)的一種調(diào)節(jié)過程。 本試驗證明了枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液是誘導ORECs內(nèi)SBD-1 表達的有效刺激成分，但是對其具體作用機制和代謝產(chǎn)物中具體發(fā)揮作用的成分還有待進一步研究。

4 結論

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清液可以誘導ORECs SBD-1 表達。