劉 兵

（商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476000）

生鮮牛乳中的主要固體成分為脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖， 其中， 脂肪含量最高， 一般在3%～5%（W/V），包括甘油三酯、甘油二酯、磷脂、鞘脂、非酯化脂肪酸以及膽固醇等［1］。 牛乳中的脂肪酸可以分為三大類， 即飽和脂肪酸 （saturated fatty acid，SFA）、 單不飽和脂肪酸 （monounsaturated fatty acid，MUFA） 和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），其中，長鏈飽和脂肪酸的含量普遍較高［2］。 脂肪酸的組成以及比例是牛乳質(zhì)量與營養(yǎng)價(jià)值的重要衡量指標(biāo)， 而脂肪酸分子的高度結(jié)構(gòu)多樣性增加了鑒定和定量的復(fù)雜性。 近年來有許多研究注重于測定生鮮牛乳中的脂肪酸的組成及含量，常見的方法有氣相色譜-氫火焰離子檢測 （gas chromatography-flame ionization detection，GC-FID）、氣相色譜與質(zhì)譜連用（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）、直接進(jìn)樣質(zhì)譜、液相色譜與質(zhì)譜連用 （liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）等。 GC-MS 法借助氣相色譜法的高效分析能力和質(zhì)譜的準(zhǔn)確鑒定能力， 在脂肪酸的檢測乳品上具有一定優(yōu)勢，且定量限較低，可以達(dá)到0.001 g/100 g［3］。 GC-MS 法是一種簡單易行、 準(zhǔn)確可靠的方法， 適用于牛乳脂肪酸的檢測。有研究結(jié)果顯示，生鮮牛乳中脂肪酸主要以飽和脂肪酸為主，其含量達(dá)到了62.43%［4］。

脂肪酸的組成和比例對(duì)牛乳質(zhì)量與營養(yǎng)價(jià)值具有重要指示和評(píng)價(jià)作用。本研究采用GC-MS 方法對(duì)3 個(gè)地區(qū)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的生鮮牛乳樣品進(jìn)行檢測， 重點(diǎn)分析河南省牧場生鮮牛乳的脂肪酸組成特征， 并與相鄰省份河北省和山西省采集的乳樣進(jìn)行比較， 以期為河南省乳業(yè)資源的合理開發(fā)和利用， 以及解析不同地區(qū)生鮮牛乳質(zhì)量差異提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

于2019 年5 月至2020 年3 月，從河南省、河北省、山西省各選取1 個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場，按照四個(gè)季節(jié)采集健康奶牛乳樣，每個(gè)季節(jié)采集1 次，每次采樣設(shè)3 個(gè)平行，每次采集的乳樣由10 頭奶牛的乳樣混合， 即每個(gè)地區(qū)采集乳樣12 份，3 個(gè)地區(qū)共36 份乳樣。采集牛乳后及時(shí)進(jìn)行樣品處理和分析測定。

1.1.2 主要試劑

鹽酸、二氯甲烷、無水碳酸鈉均為分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酰氯、無水甲醇均為色譜純， 美國默克公司產(chǎn)品；37 種脂肪酸甲酯混標(biāo)品，美國Sigma 公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器與設(shè)備

6890-5975 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀，美國Agilent Technologies 公司產(chǎn)品；7683B 型自動(dòng)進(jìn)樣器， 美國Agilent Technologies 公司產(chǎn)品；XW-80A 型渦旋混合器， 寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；BSA124S-CW 型電子分析天平， 德國Sartorius 公司產(chǎn)品；Sorvall ST 8 低速離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；DC-0515 恒溫水浴鍋，上海衡平儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酸的提取及甲酯化

準(zhǔn)確量取30 mL 牛乳置于50 mL 離心管，加入5 mL 的二氯甲烷/甲醇溶液（2∶1，V/V），并加入3 mL 的鹽酸溶液（0.1 mol/L），劇烈振搖60 min 使離心管內(nèi)液體明顯分層；收集下層有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后將有機(jī)相倒入離心管，4 000 r/min離心10 min；吸取1 mL 上層有機(jī)油相進(jìn)行甲酯化操作。

將以上1 mL 脂肪提取液置于10 mL 離心管，加入10%的乙酰氯甲醇溶液5 mL，氮?dú)獗Ｗo(hù)及70℃水浴條件下振蕩60 min；隨后取出冷卻至室溫，加入6%的碳酸鈉溶液3 mL 混勻，4 000 r/min 離心10 min，取甲酯上清液進(jìn)行氣相色譜分析。

1.2.2 分析條件

氣相色譜條件： 使用CP-WAX 52 CB 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm），載氣：高純氦氣，壓力設(shè)置為95 kPa，流量為1 mL/min，以不分流模式進(jìn)行注射。 程序升溫：GC 柱溫箱以10 ℃/min 的速率從50 ℃程序升溫至175 ℃，保持15 min，然后以5 ℃/min 的速率升溫至240 ℃，在240 ℃下保持10 min， 最后以90 ℃/min 的速率升溫至250 ℃并保持5 min。 總運(yùn)行時(shí)間為60 min， 進(jìn)樣溫度為250 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，吹掃流速為10 mL/min，吹掃時(shí)間為2 min［5］。

質(zhì)譜條件：70 eV 的電子轟擊離子源， 質(zhì)量掃描范圍為45～700 m/z。 掃描時(shí)間為1.00 s，掃描間延遲時(shí)間為0.50 s。 質(zhì)譜儀的分辨率調(diào)整為2 000。 離子源溫度設(shè)置為250 ℃，傳輸線保持在250 ℃。

1.2.3 定性與定量方法

定性分析方法為將生鮮牛乳樣品待測組分的出峰保留時(shí)間與37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)使用NIST05 譜庫進(jìn)行脂肪酸的定性結(jié)構(gòu)分析，確定其脂肪酸組成成分。采用面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有樣品按照上述處理方法進(jìn)行脂肪酸分析，結(jié)果以每個(gè)地區(qū)乳樣脂肪酸含量的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品定性

通過比較生鮮牛乳中脂肪酸甲酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)GC 保留時(shí)間與37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，以及通過比較質(zhì)譜與NIST05 數(shù)據(jù)庫中可用的圖譜進(jìn)行定性分析。 37 種混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1 所示，相對(duì)應(yīng)的脂肪酸甲酯組成、出峰順序以及每種成分占比如表1 所示。 生鮮牛乳中脂肪酸甲酯的檢測結(jié)果如圖2 所示。 與標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)圖譜相比， 生鮮牛乳樣本的脂肪酸甲酯圖譜存在少量的雜質(zhì)基線干擾， 但是各種脂肪酸甲酯的峰形和分離度均良好， 證明該分析方法適合牛乳中脂肪酸含量的測定。

表1 脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的組成及洗脫順序 單位：%

圖1 脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖

圖2 生鮮牛乳中脂肪酸對(duì)應(yīng)的脂肪酸甲酯隨時(shí)間變化的相對(duì)離子豐度

2.2 不同地區(qū)生鮮牛乳中脂肪酸組成及含量檢測結(jié)果

根據(jù)色譜圖中保留時(shí)間對(duì)比以及NIST05 數(shù)據(jù)庫檢索， 可以確定生鮮牛乳樣品中含量較高的脂肪酸甲酯有癸酸甲酯、月桂酸甲酯、十三烷酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸/反油酸甲酯、花生酸甲酯、木蠟酸甲酯等，通過面積歸一化法對(duì)各脂肪酸含量進(jìn)行計(jì)算， 結(jié)果如表2 所示。 3 個(gè)地區(qū)的生鮮牛乳中都未檢測到反亞油酸甲酯、γ-亞麻酸甲酯、 順-15-碳烯酸甲酯、芥酸甲酯、順-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸甲酯， 原因可能是牛乳中這些不飽和脂肪酸含量本身就很低，達(dá)不到GC-MS 分析條件的檢測限。

表2 不同地區(qū)采集的生鮮牛乳中脂肪酸甲酯組成及含量（n=12） 單位：%

從河南省采集的生鮮牛乳中檢測出的脂肪酸甲酯結(jié)果來看，共檢出28 種脂肪酸；飽和脂肪酸種類有15 種，其中，癸酸甲酯［（6.66±1.45）%］、月桂酸甲酯［（4.18±0.96）%］、肉豆蔻酸甲酯［（9.01±1.76）%］、硬脂酸甲酯［（17.15±1.98）%］、棕櫚酸甲酯［（20.03±2.34）%］5 種飽和脂肪酸含量較高，占檢出脂肪酸總含量的57.03%；不飽和脂肪酸種類有13 種，多數(shù)含量較低，只有油酸/反油酸甲酯含量較高，占檢出脂肪酸總含量的32.26%。 從河北省以及山西省采集的生鮮牛乳中均檢出30 種脂肪酸，但其組成有所不同：河北省乳樣中未檢出花生酸甲酯， 山西省乳樣中未檢出順-11-二十碳一烯酸甲酯；2 個(gè)省份生鮮牛乳的脂肪酸含量檢測結(jié)果與河南省生鮮牛乳的檢測結(jié)果相似， 飽和脂肪酸含量占檢出脂肪酸總含量的比例均在60%左右。 河北省生鮮牛乳中的油酸/反油酸含量為39.80%，在3 個(gè)地區(qū)中最高。

3 討論

3.1 樣品中脂肪酸的提取

該研究使用GC-MS 法進(jìn)行生鮮牛乳中的脂肪酸含量測定，該方法要求脂質(zhì)樣品經(jīng)過水解、脂肪提取、脂肪酸甲酯化等處理步驟之后，才可進(jìn)樣分析。 由于牛乳中的許多脂肪是以游離態(tài)而非結(jié)合態(tài)的形式存在，所以一般不需要經(jīng)過水解過程，直接從牛乳中提取脂質(zhì)即可［6］。 脂肪酸的提取方法 常 參 考Folch 等［7］和Bligh 等［8］報(bào) 道 的 通 用 方法，前者使用氯仿/甲醇（2∶1，V/V）作為萃取溶劑，后者使用氯仿/甲醇（1∶2，V/V）加1 體積的氯仿/水（1∶1，V/V）作為提取溶劑。 近年來有許多基于上述2 種方法的脂質(zhì)提取方法改進(jìn)，例如，有研究使用甲基叔丁基醚作為提取溶劑， 體系分層后有機(jī)相位于上層， 避免了傳統(tǒng)方法中收集提取液時(shí)將移液槍頭穿過上層溶液進(jìn)入下層而造成的提取物污染［9］。 有研究發(fā)現(xiàn)在使用氯仿甲醇溶劑提取脂質(zhì)時(shí)加入0.1 mol/L 的鹽酸溶液可以提高樣品中的脂質(zhì)回收率［10］。在該研究中，考慮到氯仿的毒性較強(qiáng)且具有揮發(fā)性，因此，選擇使用二氯甲烷代替氯仿進(jìn)行脂質(zhì)提取， 同時(shí)在提取溶劑中加入了0.1 mol/L 的鹽酸以提高提取效率。

3.2 脂肪酸的甲酯化

脂肪酸含有羧基的極性基團(tuán)， 極性大、 沸點(diǎn)高，因此，不能直接進(jìn)行氣相分析，需要進(jìn)行脂肪酸甲酯化處理， 變成極性低且易揮發(fā)的甲酯化衍生物。常見的脂肪酸甲酯化方法有酯交換法［11］、酸堿酯化法［12］、乙酰氯-甲醇化法［13］等。 酸酯化法能夠甲基化所有脂肪酸， 但過程相當(dāng)耗時(shí)并且可能導(dǎo)致共軛亞油酸發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變［14］。 堿酯化法反應(yīng)速度快， 但存在部分脂肪酸不能被甲基化的問題。乙酰氯-甲醇化法操作簡單、結(jié)果可靠，特別適合大批量樣品的處理，因此，該研究選擇乙酰氯-甲醇法進(jìn)行甲酯化處理。 從生鮮牛乳樣品中的色譜圖結(jié)果可以看出， 該研究應(yīng)用的GC-MS 法檢測靈敏度高， 脂肪酸甲酯的峰形對(duì)稱與混合標(biāo)準(zhǔn)品沒有區(qū)別， 也證明了脂肪酸甲酯化的處理是成功的。

3.3 牛乳樣品中的脂肪酸含量

牛乳中存在400 余種脂肪酸［15］，然而由于檢測技術(shù)的限制，截至目前，已有的研究報(bào)道中對(duì)牛奶中脂肪酸含量的分析測定不超過50 種。牛乳中常被檢測到的脂肪酸包括丁酸（C4:0）、己酸（C6:0）、辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）、月桂酸（C12:0）、肉豆蔻酸（C14:0）、肉豆蔻油酸（C14:1）、十五烷酸（C15:0）、棕櫚酸（C16:0）、棕櫚油酸（C16:1）、十七烷酸（C17:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）和亞油酸（C18:2），以及大量低豐度脂肪酸， 包括花生四烯酸（C20:4）、二十碳五烯酸（C20:5）和二十二碳六烯酸（C22:6，DHA）。 文獻(xiàn)報(bào)道，牛乳中最豐富的脂肪酸有棕櫚酸、油酸、肉豆蔻酸和硬脂酸［16］，該研究中3 個(gè)地區(qū)的生鮮牛乳脂肪酸含量檢測結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相似。 中國荷斯坦奶牛乳中的部分營養(yǎng)成分和礦物質(zhì)元素含量接近或優(yōu)于荷斯坦奶牛和西門塔爾牛。同時(shí)，中國荷斯坦奶牛乳的脂肪酸含量和組成與荷斯坦奶牛相近， 但脂肪酸組成優(yōu)于西門塔爾牛［17］。 冷季牛乳粉的MUFA、PUFA、必需脂肪酸（essential fatty acid，EFA）含量和占比均高于暖季；而冷季牛乳粉的USFA 與SFA 比值為44.79%，暖季為38.55%［18］。 值得一提的是，該研究使用的毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）不能使油酸和反油酸的峰分離，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，長度為100 m 的色譜柱也無法充分分離這對(duì)雙鍵異構(gòu)體， 理想的分離措施是氣相進(jìn)樣前先使用薄層色譜法進(jìn)行預(yù)分餾［19］。

該研究選取3 個(gè)地區(qū)的生鮮牛乳進(jìn)行脂肪酸含量的測定，結(jié)果表明，3 個(gè)地區(qū)生鮮牛乳的脂肪酸組成和含量都沒有明顯區(qū)別， 唯一有所差異的是它們的油酸/反油酸含量。 河北省生鮮牛乳中的油酸/反油酸含量最高，接近檢出脂肪酸總含量的40%。 3 個(gè)地區(qū)生鮮牛乳的脂肪酸中，肉豆蔻酸甲酯占比為7.11%～9.01%， 棕櫚酸甲酯占比為19.3%～20.16%， 硬脂酸甲酯占比為16.53%～17.50%，油酸/反油酸甲酯含量在脂肪酸中比例最高（32.26%～39.80%）。 據(jù)郭艷霞等［20］的研究顯示，廣西地區(qū)水牛乳中的脂肪酸含量具有明顯的季節(jié)性變化， 在夏季的飽和脂肪酸含量要明顯下降且長鏈脂肪酸占比增加，中鏈脂肪酸占比降低，而多不飽和脂肪酸含量基本不隨季節(jié)而變化。

4 結(jié)論

對(duì)從河南省、河北省、山西省規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場采集的生鮮牛乳樣品進(jìn)行了脂肪酸組成及含量分析，結(jié)果表明，3 個(gè)地區(qū)生鮮牛乳中的脂肪酸含量都比較豐富，以飽和脂肪酸為主，所有脂肪酸中以油酸/反油酸甲酯含量最高，但脂肪酸組成及含量也存在一定差異。 研究結(jié)果為解析不同地區(qū)生鮮牛乳質(zhì)量差異提供了參考。