石建州，于金冉，王彥偉，王鐵軍，李 娜，劉陽坤，姚倫廣

（1.南陽師范學(xué)院，河南 南陽 473061；2.神農(nóng)種業(yè)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；3.鄭州大學(xué)，河南 鄭州 450001；4.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 南陽 473000；5.河南省動(dòng)物疫病防控工程技術(shù)研究中心，河南 南陽 473000）

淅川烏骨雞（原稱藥雞）是我國珍貴的地方雞種， 中心產(chǎn)地是河南省南陽市淅川縣老城鎮(zhèn)以及盛灣鎮(zhèn)石板溝村等區(qū)域，在2006 年全國畜禽遺傳資源調(diào)查時(shí)被發(fā)現(xiàn)。 2010 年，淅川烏骨雞被《國家畜禽遺傳資源名錄》收錄；2011 年，淅川烏骨雞作為優(yōu)質(zhì)的家禽遺傳資源被列入 《中國畜禽遺傳資源志·家禽志》。淅川烏骨雞體型較小而緊湊，頭部大小適中，主體白羽，腿肌、胸肌發(fā)達(dá)，蛋殼綠色，具有適應(yīng)性廣、抗病力強(qiáng)、覓食能力強(qiáng)、喜群居、耐寒性強(qiáng)、耐粗飼、飼料消耗低等特征，不僅具有肉質(zhì)鮮美的肉用價(jià)值，以及蛋品質(zhì)高的蛋用價(jià)值，更具有天然保健的藥用功效等優(yōu)點(diǎn)［1-2］， 是稀有的“肉、蛋、藥”兼用型地方品種。 淅川烏骨雞遺傳性能穩(wěn)定，最顯著的特征是雞體含有大量的黑色素，具有典型的“五烏”特征（烏喙、烏腿、烏皮、烏骨、烏肉），烏色呈顯性遺傳，是烏骨雞的重要種質(zhì)遺傳資源；產(chǎn)綠殼蛋也是淅川烏骨雞的重要特征之一，綠殼蛋比率能夠達(dá)到罕見的73%，并且該雞是目前唯一生產(chǎn)綠殼蛋的白羽烏骨雞品種［3］。 烏骨雞作為健康食品，使得“肉、蛋、藥”三位一體兼用型淅川烏骨雞的市場需求愈來愈高，備受關(guān)注的淅川烏骨雞具有深遠(yuǎn)的育種價(jià)值和經(jīng)濟(jì)開發(fā)潛力［4］。

全轉(zhuǎn)錄組是指在一定時(shí)空狀態(tài)下有機(jī)體特定細(xì)胞或組織能夠轉(zhuǎn)錄出的所有轉(zhuǎn)錄本， 其中蘊(yùn)含著重要的生物學(xué)調(diào)控規(guī)律。 全轉(zhuǎn)錄組研究能夠?qū)蚪Y(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行更深層次地分析與探究，揭示基因表達(dá)與生命現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系。 轉(zhuǎn)錄本是生物體特定細(xì)胞或者組織在某一特定條件下的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物， 包括編碼RNA （messenger RNA，mRNA）和非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）［5］。全轉(zhuǎn)錄組測序能夠?qū)?xì)胞mRNA 及ncRNA 進(jìn)行整體測序分析。 微RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA），這三類ncRNA 在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄合成過程中具有靶向調(diào)節(jié)作用，其調(diào)控對象與mRNA 有關(guān)。 基于RNA 序列長度的差異，一般將全轉(zhuǎn)錄組分為small RNA 文庫（miRNA）與去rRNA 鏈特異性文庫（mRNA、lncRNA、circRNA）［6］。

淅川烏骨雞出殼的雛雞與未出殼的雞胚相比，基因表達(dá)是否存在時(shí)間差異？差異表達(dá)基因包括哪些？ 這些差異表達(dá)基因在淅川烏骨雞個(gè)體發(fā)育中發(fā)揮著哪些作用？ 這些科學(xué)問題的解決對于揭示淅川烏骨雞胸肌的黑色素沉積、脂肪代謝、發(fā)育性變化等相關(guān)機(jī)制具有重要意義。

該研究選擇出殼前后的淅川烏骨雞雞胚和雛雞為研究對象， 利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測不同生長發(fā)育階段胸肌組織中基因的表達(dá)水平， 鑒定組織中的mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA 的差異表達(dá)基因， 并分析篩選相關(guān)性狀的候選基因以及差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能， 進(jìn)一步探索差異表達(dá)基因在淅川烏骨雞在生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用， 以期為優(yōu)良的地方雞種淅川烏骨雞的遺傳育種改良以及機(jī)理解析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

淅川烏骨雞種蛋由河南興盛源牧業(yè)有限公司提供。對照組隨機(jī)選取3 只入孵14 d、發(fā)育健康的蛋胚（記為X-14 d），取胸肌組織；試驗(yàn)組隨機(jī)選取3 只1 日齡的雛雞（記為X-1 d），采集胸肌組織。將用于測序的胸肌組織放入液氮中速凍，于-80 ℃條件下保存。

1.2 儀器及試劑

微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技Nanodrop 2000）、PCR 儀 （東勝興業(yè)科學(xué)儀器 有限 公司ETC811）、Agilent 2100 生物分析儀和High Sensitivity DNA assay Kit 5067-4626 文庫質(zhì)檢試劑盒（Agilent Technologies）、 離 心 機(jī) （Eppendorf 5427R）、試劑盒#7530NEB 和小RNA 建庫試劑盒#E7300（New England Biolabs）。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

提取胸肌的總RNA，對RNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測，純化mRNA，將mRNA 片段化并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，用Illumina Hiseq 2000（Illumina，San Diego，CA，USA）平臺(tái)上機(jī)測序（由廣州基迪奧生物科技有限公司完成）。

1.4 生物信息學(xué)分析

對差異表達(dá)的mRNA 進(jìn)行GO（Gene Ontology）和KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。GO 是標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，全面描述基因與產(chǎn)物的屬性。 GO 描述基因的分子功能（molecular function）、細(xì)胞組分（cellular component）、 參與的生物過程 （biological process）， 進(jìn)行基因的GO 功能分類注釋及顯著性富集 分 析。 將 基 因 向GO 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.geneontology.org/）各詞條映射，計(jì)算詞條的基因數(shù)，得到具有某個(gè)GO 功能的基因列表和數(shù)目， 進(jìn)行超幾何檢驗(yàn)和基因組背景比對， 得到顯著富集的GO 條目。

不同基因協(xié)調(diào)行使生物學(xué)功能，Pathway 分析有助于進(jìn)一步探究基因的生物學(xué)功能。 KEGG 是Pathway 的數(shù)據(jù)庫， 顯著性富集分析以KEGG Pathway 為單位，超幾何檢驗(yàn)，與基因組背景比對，得到顯著性富集的Pathway。 通過Pathway 顯著性富集可以確認(rèn)基因參與的最主要的生化代謝途徑與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［7-8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)分析

對mRNA、lncRNA、circRNA 和miRNA 依據(jù)表達(dá)量進(jìn)行顯著差異表達(dá)分析， 基于錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05 且｜log2FC｜＞1 的閾值條件， 篩選差異表達(dá)mRNA、lncRNA、circRNA；基于P＜0.05 且｜log2FC｜＞1 的閾值條件， 篩選差異表達(dá)miRNA。 圖1 為各比較組顯著差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs） 整體統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 測序結(jié)果顯示， 出孵1 d 的雛雞與入孵14 d的雞胚相比（X-14 d vs X-1 d），胸肌生長發(fā)育過程中大量的基因轉(zhuǎn)錄組水平發(fā)生顯著變化，上調(diào)的基因包括1 054 個(gè)mRNA、222 個(gè)lncRNA、148 個(gè)circRNA、159 個(gè)miRNA； 下調(diào)的基因包括2 804 個(gè)mRNA、149 個(gè)lncRNA、168 個(gè)circRNA、218 個(gè)miRNA。

圖1 淅川烏骨雞出殼前后胸肌mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA 顯著差異表達(dá)基因結(jié)果統(tǒng)計(jì)（X-14 d vs X-1 d）

2.2 mRNA 差異表達(dá)基因的GO 富集分析

通過測序方法分析剛出殼1 d 的淅川烏骨雞雛雞胸肌與入孵14 d 的雞胚胸?。╔-1 d vs X-14 d）的mRNA 差異表達(dá)基因（X-14 d vs X-1 d）。 針對具有表達(dá)差異的mRNA 進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果顯示（見圖2），差異表達(dá)基因主要集中在“生物學(xué)過程”，其次是“細(xì)胞組分”，最后是“分子功能”。首先，在“生物學(xué)過程”方面，細(xì)胞過程、單組織過程、多組織過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)控、刺激反應(yīng)、定位、多細(xì)胞有機(jī)體過程、細(xì)胞組成、組織或生物發(fā)生、信號(hào)、正負(fù)調(diào)節(jié)生物過程、生長過程、免疫系統(tǒng)過程、生物黏附、運(yùn)動(dòng)、行為、繁殖、生殖過程、生長、規(guī)律性發(fā)生過程、解毒、細(xì)胞死亡、參與突觸傳遞的突觸前過程、生命階段、細(xì)胞集合等多個(gè)條目被顯著富集。

圖2 mRNA 差異表達(dá)基因的GO 富集分類

其次，在“細(xì)胞組分”方面，細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞器、膜、膜部分、細(xì)胞器部分、大分子復(fù)合物、膜包圍的腔、胞外域、胞外部分、細(xì)胞結(jié)、突觸、突觸部分、超分子纖維、細(xì)胞外基質(zhì)、類核、細(xì)胞外基質(zhì)成分、其他生物等條目被顯著富集。

最后，在“分子功能”方面，分子功能、綁定、催化活性、運(yùn)輸活性、分子功能調(diào)節(jié)劑、分子換能器活性、信號(hào)換能器活性、結(jié)構(gòu)分子活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、電子載體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白結(jié)合、抗氧化活性、翻譯調(diào)節(jié)因子活性、化學(xué)引誘活性、化學(xué)排斥活性、金屬伴侶蛋白活性、形態(tài)發(fā)生活性等條目被顯著富集。

2.3 mRNA 差異表達(dá)基因的KEGG 通路富集分析

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示（見圖3）：心肌收縮，黏附連接，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，氨基酸的生物合成，氧化磷酸化，碳代謝，檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)），緊密連接，間隙連接，心肌細(xì)胞中的腎上腺素信號(hào)，2-氧羧酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，代謝途徑，焦點(diǎn)黏附，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，糖酵解/糖異生，癌癥中的microRNA，丙酮酸代謝，Notch 信號(hào)通路， 以及黑素原生成等多個(gè)信號(hào)通路被顯著富集。

圖3 mRNA 差異表達(dá)基因的KEGG 富集氣泡圖

3 討論

淅川烏骨雞的黑色素沉淀、免疫性能、肌肉發(fā)育、肉質(zhì)性狀等直接影響其生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)等組學(xué)技術(shù)能夠從分子的角度進(jìn)行相關(guān)性狀調(diào)控機(jī)制的闡述。同時(shí)，采用組學(xué)的方法，能夠快速篩選鑒定與目的性狀相關(guān)的候選基因和分子功能， 了解其性狀形成機(jī)制，在生產(chǎn)上，將鑒定出的關(guān)鍵遺傳標(biāo)記進(jìn)行應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的精準(zhǔn)遺傳選育，也是有效實(shí)現(xiàn)品種選育以及縮短育種實(shí)踐工作周期的有效方法。 全轉(zhuǎn)錄組是在特定時(shí)空狀態(tài)下生物體可以轉(zhuǎn)錄出的所有轉(zhuǎn)錄本， 包含生物學(xué)調(diào)控信息。mRNA 作為蛋白質(zhì)合成的直接模板， 雖然只占細(xì)胞總RNA 的2%～5%， 但因其轉(zhuǎn)錄后修飾繁多而在疾病的研究中意義重大［9］。 miRNA 是一類長度約為19～25 nt 的內(nèi)源性ncRNA，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控活動(dòng)，具有高度序列保守性、表達(dá)時(shí)序性和組織特異性。 lncRNA 是長度大于200 nt 的ncRNA，lncRNA 直接參與調(diào)控基因的表達(dá)， 也能夠作為競爭性內(nèi)源RNA （competing endogenous RNA，ceRNA）與miRNA 相互調(diào)控，影響靶基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，具有無蛋白編碼功能、低表達(dá)、物種間保守性低等特性，參與生物過程如組蛋白修飾、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖分化等［10］。 circRNA 由編碼蛋白的外顯子生成， 并通過下游剪接供體反向共價(jià)連接上游剪接體環(huán)化形成［11］。 不同差異circRNA 來源基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能。全轉(zhuǎn)錄組學(xué)以差異基因的功能富集、 候選基因的功能預(yù)測等生物信息學(xué)分析為主。 該文旨在通過分析淅川烏骨雞出殼前后胸肌的全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，從分子層面揭示基因和非編碼RNA 在淅川烏骨雞兩個(gè)生長階段的胸肌表達(dá)特點(diǎn)。

淅川烏骨雞是我國新發(fā)現(xiàn)的“肉、蛋、藥”兼用型珍禽， 是目前唯一報(bào)道過的產(chǎn)綠殼蛋的白羽烏骨雞。 為了更好地了解和保護(hù)淅川烏骨雞品種資源［12］，利用組學(xué)技術(shù)挖掘經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)基因是必要的。 該研究首次構(gòu)建了淅川烏骨雞入孵14 d的雞胚和出殼1 d 的雛雞的胸肌的全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜， 篩選獲得3 858 個(gè)顯著差異表達(dá)mRNA，371個(gè)顯著差異表達(dá)lncRNAs，316 個(gè)顯著差異表達(dá)circRNAs 和377 個(gè)顯著差異表達(dá)miRNAs。 通過GO 功能富集和KEGG 通路分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，挖掘與胸肌發(fā)育相關(guān)的基因，獲得了差異表達(dá)基因的功能分類和信號(hào)通路， 以揭示淅川烏骨雞生長發(fā)育的遺傳機(jī)制。

淅川烏骨雞出殼前后， 顯著差異表達(dá)基因主要富集在催化活性、運(yùn)輸活性、分子功能調(diào)節(jié)劑、信號(hào)換能器活性、結(jié)構(gòu)分子活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白結(jié)合、抗氧化活性、翻譯調(diào)節(jié)因子活性、金屬伴侶蛋白活性、形態(tài)發(fā)生活性等GO 條目，參與細(xì)胞過程、單/多組織過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)控、刺激反應(yīng)、定位、多細(xì)胞有機(jī)體過程、細(xì)胞組成、信號(hào)、正/負(fù)調(diào)節(jié)生物過程、生長過程、免疫系統(tǒng)過程、生物黏附、規(guī)律性發(fā)生過程、解毒、細(xì)胞死亡、參與突觸傳遞的突觸前過程等多個(gè)生物學(xué)過程。 KEGG 通路富集分析表明， 差異表達(dá)mRNA 顯著富集在黏附連接、 肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、 氨基酸的生物合成、氧化磷酸化、碳代謝、檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）、緊密連接、 間隙連接、 心肌細(xì)胞中的腎上腺素信號(hào)、2-氧羧酸代謝、代謝途徑、焦點(diǎn)黏附、糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝、黑素原生成、Notch 信號(hào)通路等多條信號(hào)通路。 基于測序結(jié)果挖掘影響淅川烏骨雞胸肌生長發(fā)育、脂肪沉積、黑色素沉積、免疫系統(tǒng)等相關(guān)性狀的關(guān)鍵基因以及基因的功能。 肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、糖酵解/糖異生等與肉質(zhì)性狀相關(guān)［13］。 Notch 信號(hào)通路由相鄰細(xì)胞的Notch受體與配體互作而被激活［14］，參與多種不同細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，例如細(xì)胞凋亡、分化、增殖和遷移等［15］。烏色作為烏骨雞品種的顯著特征，有著十分重要的研究意義。 黑素原生成通路參與黑色素生成過程［16］，與淅川烏骨雞的肌肉烏色相關(guān)。烏骨雞與非烏骨雞的顯著不同之處在于是否含有黑色素，烏骨雞體內(nèi)富含黑色素，黑色素是機(jī)體活性功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，黑色素決定了烏骨雞的藥用價(jià)值［17］。隨著分子技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)的迅速發(fā)展， 逐漸對黑色素生成的分子機(jī)制有了認(rèn)識(shí)， 在黑色素細(xì)胞的遷移分化、 黑色素的產(chǎn)生分布等過程中受眾多基因的協(xié)同調(diào)控，涉及多個(gè)信號(hào)通路。 目前，黑色素的生成受到多種信號(hào)通路的調(diào)控， 研究發(fā)現(xiàn)Edn/EdnrB、WNT/β-catenin、αMSH/MC1R、SCF/Kit、腺苷酸環(huán)化酶/cAMP 和酪氨酸激酶信號(hào)通路參與黑色素的生成調(diào)控， 在黑色素生成過程中起直接或間接的作用［18-20］。 該研究為了挖掘與淅川烏骨雞黑色素生成有關(guān)的基因， 通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析挖掘調(diào)控淅川烏骨雞烏色性狀相關(guān)的候選基因， 采用GO 和KEGG 富集方法分析了調(diào)控黑色素生成的相關(guān)基因， 大量差異基因富集于多種信號(hào)通路，因此，具體何種信號(hào)通路主要調(diào)控黑色素性狀仍需深入研究， 為進(jìn)一步研究黑色素調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。 差異表達(dá)基因主要參與免疫系統(tǒng)、解毒、代謝過程等生物學(xué)過程，富集于Notch信號(hào)通路［21］、丙酮酸代謝、代謝途徑等信號(hào)通路，推測這些差異基因可能與機(jī)體的免疫與代謝相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)。

該試驗(yàn)結(jié)果可為解析淅川烏骨雞胸肌生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)， 為進(jìn)一步鑒定調(diào)控目的性狀的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)， 也為淅川烏骨雞的靶向選育和遺傳改良提供參考。

4 結(jié)論

mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA 作為淅川烏骨雞基因轉(zhuǎn)錄組的重要組成部分， 在淅川烏骨雞的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。 該研究結(jié)果為解析淅川烏骨雞胸肌生長發(fā)育過程的基因調(diào)控機(jī)制提供了參考。