于 雷,陳龍媚,趙鳳珠,陳忠楊,李志學(xué)

(齊齊哈爾市第一醫(yī)院1.血管外一科;2.門診部;3.康復(fù)科;4.藥學(xué)部,黑龍江 齊齊哈爾 161000)

腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是比較常見的并且對生命造成威脅的動脈退行性疾病[1]。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),在男性65歲以上死亡的人群中,腹主動脈瘤造成的死亡原因排在第10位,并且呈逐年上升的趨勢[2]。在我國,隨著人口老齡化時代的到來,飲食和生活習(xí)慣的改變,腹主動脈瘤的發(fā)病率呈明顯上升趨勢,已被確定為威脅我國人民健康生活的重要疾病。黏質(zhì)蛋白1(mucolipin 1,MCOLN1或者TRPML1),是瞬時受體電位通道家族成員之一。介于MCOLN1與退行性病變以及血管平滑肌的功能相關(guān),但目前尚無MCOLN1與AAA相關(guān)性及預(yù)后的研究[3～5],本研究項目通過免疫組織化學(xué)法、Western Blot實驗法和RT-PCR 實驗法檢測MCOLN1蛋白在人腹主動脈瘤病變組織和相鄰的非病變組織中的表達情況,探討MCOLN1表達與AAA患者預(yù)后的關(guān)系,為未來臨床推廣應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月至2021年6月齊齊哈爾市第一醫(yī)院收治的腹主動脈瘤患者80例,以腹主動脈瘤組織和臨近的非病變組織標(biāo)本作為研究對象,分為實驗組腹主動脈瘤組織40例和對照組非病變組織40例。實驗組男28例,女12例,年齡40～71歲,平均(58.54±4.13)歲。對照組男26例,女14例,年齡41～72歲,平均(57.02±3.84)歲。兩組患者的一般資料經(jīng)過數(shù)據(jù)統(tǒng)計,無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。參與研究的患者和家屬了解項目內(nèi)容具有知情同意權(quán),經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準項目研究內(nèi)容。

(1)納入標(biāo)準:符合腹主動脈瘤診斷與治療指南[6]診斷標(biāo)準;無腹主動脈瘤病史;無缺血性心臟病、腦血管疾病病史,無外周血管疾病及自身免疫性疾病;腹主動脈形態(tài)為真性動脈瘤、梭形,其直徑>3cm;超聲檢查可見動脈瘤周圍血管表現(xiàn)動脈硬化且多發(fā);患者入組前未經(jīng)過任何治療。(2)排除標(biāo)準:有嚴重精神疾病,存在認知障礙患者;有嚴重感染或自身免疫疾病患者;嚴重心臟病或系統(tǒng)性炎癥性疾病或腫瘤疾病患者;周圍動脈出現(xiàn)狹窄性病變,且表現(xiàn)嚴重患者;囊狀動脈瘤、假性動脈瘤患者;下肢深靜脈血栓形成患者;感染性動脈瘤患者等。

1.2 研究方法

(1)免疫組化實驗:去蠟→雙蒸水和PBS沖洗玻片→高壓熱修復(fù)抗原→滴加3%H2O2阻斷→雙蒸水和PBS沖洗玻片→用血清封閉液→加一抗→加二抗→DAB顯色劑→蘇木精復(fù)染→恒溫箱內(nèi)烤片→中性樹膠封片→顯微鏡下觀察。(2)Western blot實驗:將少量實驗用組織塊放入1～2mL勻漿器,用無菌眼科手術(shù)剪刀將實驗組織塊剪碎,越碎越好。加400μL單去污劑裂解液裂放于勻漿器中,啟動機器,完成勻漿過程。經(jīng)12000r/min離心5min后,用試劑槍取上清液體,再裝入0.5mL的離心管中,放置在-20℃保存待用,再選用10%SDS-PAGE膜,條帶電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%無脂牛奶阻斷2h后,在4℃下用抗PLAGL2的一級抗體處理膜,室溫下與二抗孵育時間為1h,再用ECL檢測試劑盒檢測結(jié)果。(3)RT-PCR實驗:用消毒后的小剪刀將實驗組織剪成小塊后再研磨成粉末狀態(tài),取50～100mg的研磨組織粉末,加入1mL的Trizol液的EP管中,開始充分混勻,提取實驗所需總的RNA。再利用PrimeScriptTM RTMaster Mix軟件系統(tǒng),將提取的相關(guān)RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR與SYBR預(yù)混料上機檢測,以O(shè)D值作為實驗結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 免疫組化實驗方法檢測MCOLN1的表達情況

40例患者的腹主動脈瘤組織標(biāo)本中,發(fā)現(xiàn)MCOLN1的陽性率為 82.5% (33/40),非病變組織標(biāo)本中,發(fā)現(xiàn)MCOLN1的陽性率為 22.5% (9/40)。腹主動脈瘤組織的MCOLN1陽性率顯著高于非病變組織的MCOLN1陽性率,有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.94,P<0.05)。

2.2 Western blot實驗方法檢測MCOLN1在實驗組和對照組表達情況

實驗組的腹主動脈瘤組織中檢測MCOLN1蛋白表達含量為( 5.47±1.22 ),對照組非病變組織中檢測MCOLN1蛋白表達含量為( 2.46±1.03 ),兩組數(shù)據(jù)比較,實驗組數(shù)值顯著高于對照組數(shù)值,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組Western blot和 RT-PCR實驗結(jié)果比較MCOLN1表達情況

2.3 RT-PCR實驗結(jié)果比較MCOLN1在實驗組和對照組的RNA 表達情況

實驗組的腹主動脈瘤組織中檢測MCOLN1 RNA表達為( 3.67±1.06 ), 對照組非病變組織中檢測MCOLN1 RNA表達為( 0.87±0.35),兩者數(shù)據(jù)比較得出實驗組數(shù)值顯著高于對照組數(shù)值,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

3 討論

近幾年腹主動脈瘤疾病已經(jīng)被證實是一種嚴重威脅生命的常見疾病,動脈瘤受到刺激不斷擴張,達到不可控制的程度,最終出現(xiàn)動脈瘤破裂,導(dǎo)致患者死亡[7]。目前大多數(shù)學(xué)者對其腹主動脈瘤的發(fā)病原因還不能明確,具有一定的爭議,主要病因集中在遺傳、解剖學(xué)因素、環(huán)境、免疫炎癥反應(yīng)、平滑肌細胞凋亡、病原微生物等共同作用的結(jié)果,病理學(xué)發(fā)現(xiàn)是動脈壁彈力纖維和膠原纖維的降解與損傷[8,9]。隨著腔內(nèi)技術(shù)的進步,對于符合手術(shù)標(biāo)準的腹主動脈瘤治療不再困難,但是對于腹主動脈瘤的早期診斷和低于手術(shù)標(biāo)準的動脈瘤檢測仍然是臨床難點。AAA主要病理學(xué)特征是血管系統(tǒng)炎癥和主動脈結(jié)構(gòu)的病理性重塑,與年齡、性別、遺傳、吸煙、肥胖、血脂異常和高血壓等因素之間具有強烈的正相關(guān)關(guān)系。目前臨床還沒有研究出能夠完全控制腹主動脈瘤的藥物,不能終止病變發(fā)展[10]。

MCOLN1是黏脂素家族的成員之一,用來編碼粘脂蛋白1(MLN1)。MLN1是人類2號染色體上的兩個基因編碼的另外兩種蛋白-黏脂蛋白2和3的黏脂蛋白家族的一部分。有研究表明MLN1是Ca2+通道蛋白,MLN1可以特異性地介導(dǎo)某些分子的核轉(zhuǎn)運,如與血管平滑肌密切相關(guān)的TFEB蛋白[11]。MCOLN1由密歇根大學(xué)的一項新研究首次提出,證明其是一種抗自由基的強大的保護劑,也是溶酶體膜上一種關(guān)鍵的Ca2+通道,內(nèi)腔的Ca2+由此被釋放到胞液中,而溶酶體的Ca2+釋放被認為是由黏質(zhì)蛋白1調(diào)控的。2020年《Circulation》期刊上的一篇文章證明血管平滑肌細胞(VSMC) 的TFEB在腹主動脈瘤中扮演著重要角色,并將TFEB作為治療腹主動脈瘤的新靶點。另有研究表明,MCOLN1激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶,它結(jié)合并去磷酸化TFEB,從而促進其核易位,調(diào)節(jié)TFEB的活性[12,13]。

本研究顯示,免疫組化實驗結(jié)果中實驗組MCOLN1的陽性率為 82.5% (33/40),對照組MCOLN1的陽性率為 22.5% (9/40)。實驗組明顯高于對照組數(shù)值,有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.94,P<0.05)。 Western blot實驗結(jié)果中實驗組MCOLN1蛋白表達含量為( 5.47±1.22 ),對照組MCOLN1蛋白表達含量為(2.46±1.03),兩組數(shù)據(jù)比較,實驗組數(shù)值顯著高于對照組數(shù)值,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR實驗結(jié)果中實驗組檢測MCOLN1 RNA表達為(3.67±1.06),對照組檢測MCOLN1 RNA表達為(0.87±0.35),兩者比較,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與李大勇[11]研究結(jié)果一致。以上研究說明了MCOLN1在腹主動脈瘤早期診斷方法和干預(yù)手段中起到重要的作用,如果針對MCOLN1進一步研究診療能夠提高患者的生存率,減少患者經(jīng)濟支出。

綜上所述,本研究證實了在主動脈瘤中檢測MCOLN1高表達,提示該因子與腹主動脈瘤的診斷和不良預(yù)后呈正相關(guān)性,MCOLN1極大可能是腹主動脈瘤診療的靶基因,為腹主動脈瘤的治療提供實驗依據(jù)及新的思路。以腹主動脈瘤生物學(xué)標(biāo)記為其發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)和深層資料,使腹主動脈瘤患者早期檢出率得到提高。未來我們將研究的焦點集中在 MCOLN1在腹主動脈瘤發(fā)生過程中的分子機制中,使患者提高生存質(zhì)量、延長生存時間、節(jié)省醫(yī)療資源,具有重大的臨床意義。