,王顯鶴,董 靜,聶 影,王麗敏,楊占雙

(1.佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科,黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus)常見(jiàn)的、也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1],呈慢性[2]、進(jìn)行性發(fā)展態(tài)勢(shì),也是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage kidney disease,ESRD)最主要原因[3],其逐漸增加的發(fā)病率不僅影響了患者的生活質(zhì)量,也給衛(wèi)生醫(yī)療與社會(huì)經(jīng)濟(jì)增加了負(fù)擔(dān)[4]。DN作為糖尿病重要的微血管病變[5],其主要特征是微血管的損傷,包括腎小球高濾過(guò)、白蛋白尿增加,以及腎損傷,最終導(dǎo)致腎小球功能障礙和腎衰竭[6,7]。DN起病隱匿,早期臨床表現(xiàn)不明顯,中晚期病情發(fā)展迅速且對(duì)腎功能產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損害,嚴(yán)格的血糖和血壓控制的標(biāo)準(zhǔn)療法已被證實(shí)無(wú)法阻止DN進(jìn)展到ESRN[8]。因此,在DN形成的早期通過(guò)抗血管生成來(lái)延緩DN的發(fā)展對(duì)未來(lái)預(yù)防及治療DN可能存在一定的意義。

吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamic acid ammonium salt,PDTC)屬二硫代氨基甲酯化合物(dithiocarbamate compound),已有大量的研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種疾病具有潛在治療效果[9]。作為抗血管生成劑通過(guò)抑制依賴kappaB的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(如VEGF)的分泌[10],從而影響新生血管的形成,而血管生成已被證實(shí)是DN早期的潛在治療方向,因此,本實(shí)驗(yàn)在糖尿病小鼠模型建立后給予PDTC,根據(jù)糖尿病腎病小鼠建模后VEGF及PEDF因子表達(dá)的變化及相關(guān)指標(biāo)的檢查來(lái)探討PDTC在早期延緩DN的發(fā)展可能存在的意義并為其作用機(jī)制提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

3周齡SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠36只,體質(zhì)量(21.77±1.15)g,由珠海百事通生物科技有限公司提供,廣州華騰生物動(dòng)物飼養(yǎng)室統(tǒng)一普通飼料飼養(yǎng),鏈脲佐菌素(STZ)、PDTC購(gòu)自Servicebio生物科技公司。VEGF、PEDF抗體購(gòu)自Immunoway。

1.2 方法

36只3周齡雄性BALB/c小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為對(duì)照組,T1DN組,PDTC組,每組12只。將STZ用檸檬酸緩沖液配制為20mg/mL的STZ注射液,以0.1mL/10g對(duì)T1DN組、PDTC組小鼠進(jìn)行一次性腹腔注射制作1型糖尿病模型,一周后連續(xù)72h空腹血糖≥16.7mmol/L,C肽≤0.8ng/mL,伴多飲、多食、多尿,即為1型糖尿病成膜,此模型連續(xù)4周出現(xiàn)微量白蛋白尿,C肽降低,為1型糖尿病腎病模型。1型糖尿病成膜后連續(xù)2周PDTC組隔日一次腹腔注射PDTC 60mg/kg,對(duì)照組、T1DN組同體積生理鹽水腹腔注射。

1.3 體質(zhì)量、血生化指標(biāo)檢測(cè)

4周后,測(cè)量記錄小鼠體質(zhì)量,異氟烷吸入麻醉,拔眼球采血分離血清待行生化檢測(cè),處死小鼠取出胰腺和腎臟常規(guī)脫水,浸蠟,包埋,切片。

1.3.1 腎、胰病理學(xué)檢查:HE 染色,觀察胰腺、腎臟病理形態(tài)改變。

1.3.2 免疫組化染色:使用數(shù)字病理圖像分析軟件Aipathwell進(jìn)行AI掃描分析,計(jì)算3組腎組織VEGF、PEDF陽(yáng)性染色(棕色顆粒)的平均光密度值,使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)及毛發(fā)無(wú)明顯改變,體質(zhì)量未見(jiàn)減低;T1DN組小鼠被毛污穢,毛發(fā)稀疏,行動(dòng)遲緩,活動(dòng)減少,精神萎靡不振、煩躁,多飲多食多尿明顯;PDTC 組小鼠被毛污穢,毛發(fā)稀疏,行動(dòng)及精神狀態(tài)較T1DN組輕微好轉(zhuǎn),多飲多食多尿。

2.2 體質(zhì)量及血糖

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,與對(duì)照組相比,T1DN 組、PDTC 組小鼠體質(zhì)量明顯降低,空腹血糖明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與T1DN組對(duì)比,PDTC組小鼠體質(zhì)量有所增加,空腹血糖降低,仍高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1、表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠空腹血糖的變化

圖1 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠體質(zhì)量變化(×200)

2.3 血生化檢查

與對(duì)照組相比,T1DN組小鼠BUN、Cr、血清胰島素水平及β細(xì)胞功能指數(shù)明顯降低,HbAlc升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與T1DN組相比,PDTC組小鼠BUN、Cr、血清胰島素水平及β細(xì)胞功能指數(shù)升高,HbAlc降低,但仍高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2-3。

表2 各組小鼠血尿素氮、血肌酐、糖化血紅蛋白的變化

表3 各組小鼠空腹胰島素、β細(xì)胞功能指數(shù)對(duì)比

2.4 腎臟、胰腺病理學(xué)改變

對(duì)照組胰腺外分泌部主要由腺泡細(xì)胞構(gòu)成,被薄層結(jié)締組織分隔成多個(gè)小葉,小葉內(nèi)腺泡排列緊密,腺泡細(xì)胞頂部嗜酸性,基部嗜堿性,形態(tài)正常,胰島數(shù)量豐富,形狀規(guī)則,近似圓形或橢圓形,胰島細(xì)胞排列緊密,胞漿豐富,形態(tài)正常,組織未見(jiàn)明顯異常;T1DN組與對(duì)照組相比,胰腺萎縮,小葉截面普遍變小,胰島數(shù)量明顯減少,伴胰島萎縮,體積變小,胰島細(xì)胞排列疏松,胞漿減少,或疏松淡染或呈空泡狀,間隙增大,小葉間質(zhì)廣泛見(jiàn)少量或無(wú)炎性細(xì)胞散在浸潤(rùn);PDTC組病理改變程度介于上述兩組之間。對(duì)照組腎小管排列緊密,腎小管上皮細(xì)胞著色均勻,胞質(zhì)豐富,形態(tài)正常,腎小球毛細(xì)血管叢清晰,組織未見(jiàn)明顯異常;T1DN組腎小管排列緊密,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,胞漿疏松淡染,管腔可見(jiàn)嗜酸性碎片,腎小管上皮細(xì)胞核腫大,腎小球毛細(xì)血管叢清晰,腎小動(dòng)脈周?chē)仔约?xì)胞灶性浸潤(rùn);PDTC 組病理改變程度介于上述兩組之間,見(jiàn)圖2。

A:對(duì)照組;B:T1DN 組;C:PDTC 組;1:胰腺 2:腎臟

2.5 VEGF、PEDF因子的表達(dá)

與對(duì)照組相比,T1DN 組、PDTC組小鼠的腎組織中VEGF平均光密度值表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與T1DN組相比,PDTC組腎組織中 VEGF的平均光密度值表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組相比,T1DN組和PDTC組腎組織中PEDF平均光密度值表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與T1DN組對(duì)比,PDTC組腎組織中PEDF平均光密度值表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠VEGF、PEDF平均光密度值對(duì)比

3 討論

3.1 在本研究中,4周后T1DN組、PDTC組小鼠體質(zhì)量下降、BUN、Cr、血清胰島素水平及β細(xì)胞功能指數(shù)明顯降低,空腹血糖及HbAlc增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與T1DN組比較,PDTC組小鼠體質(zhì)量相對(duì)增加,BUN、Cr、血清胰島素水平及β細(xì)胞功能指數(shù)升高,空腹血糖及HbAlc降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與既往文獻(xiàn)相符[11,12]。T1DN組胰島萎縮,胰島數(shù)量明顯減少,體積變小,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,胞漿疏松淡染,腎小管上皮細(xì)胞核腫大,腎小球毛細(xì)血管叢清晰,PDTC改變輕于T1DN組。T1DN組VEGF平均光密度值升高,PEDF下降;而PDTC組VEGF平均光密度值下降,PEDF表達(dá)升高,提示在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,PDTC改變了VEGF、PEDF因子平均光密度值的表達(dá),從而改變了胰腺和腎臟的病理結(jié)構(gòu),這對(duì)延緩糖尿病腎病的發(fā)展可能有一定的影響。

3.2 考慮本研究因條件有限,導(dǎo)致研究樣本量以及考察指標(biāo)有限,以一個(gè)單一的小鼠模型來(lái)概括1型糖尿病腎病所有的特性是一個(gè)有待研究的方向。PDTC是否在糖尿病早期應(yīng)用來(lái)延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展,以及其副作用所帶來(lái)的其他臟器的損傷,仍有待大量樣本研究實(shí)驗(yàn)。接下來(lái)有必要將小鼠種類(lèi)、特征、檢測(cè)指標(biāo)如血脂,胱抑素C等更多的因素考慮到研究中去,并從基因?qū)用孢M(jìn)一步驗(yàn)證PDTC的作用機(jī)制。

3.3 目前為止PDTC在各方面都有應(yīng)用[13],包括醫(yī)學(xué)、合成、農(nóng)業(yè)等方面。其中,在醫(yī)學(xué)中的使用就被調(diào)查了數(shù)年。PDTC作為一種具有抗炎、抗氧化特性的二硫代氨基甲酯化合物(dithiocarbamate compound),其在溶液中生理pH值的穩(wěn)定性及穿透細(xì)胞膜的能力,且PDTC可以干擾促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,抑制核因子kappa B從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)的表達(dá),在這次實(shí)驗(yàn)中也得到了相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持。此外很多證據(jù)表明PDTC在抗癌、抗病毒,尤其用來(lái)改變登革熱病毒細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制及治療艾滋病毒、修復(fù)肺部損傷的方面取得了相應(yīng)的進(jìn)展,在未來(lái)的應(yīng)用中前景較好。

3.4 根據(jù)本研究的結(jié)果表明,PDTC通過(guò)改變VEGF、PEDF因子的表達(dá)情況,對(duì)糖尿病腎臟進(jìn)一步的損傷可能起到了一定的保護(hù)作用,從而延緩了腎病并發(fā)癥的發(fā)展,但PDTC在糖尿病腎病中發(fā)揮作用的機(jī)制及其副作用帶來(lái)的損傷,未來(lái)對(duì)效果的評(píng)估仍需進(jìn)一步的探究。在實(shí)驗(yàn)中值得注意的是,隨著小鼠周齡的增長(zhǎng)及發(fā)育的成熟,不同階段的血生化等相關(guān)的檢查指標(biāo)可能存在一定的差異,但目前尚未得到有效報(bào)道。