張逸寧 張艷菲 汪 敏 王景一 李 龍 李超男 楊德龍 毛新國(guó),* 景蕊蓮

小麥轉(zhuǎn)錄因子基因參與調(diào)控每穗小穗數(shù)

張逸寧1,2張艷菲2汪 敏2王景一2李 龍2李超男2楊德龍1,*毛新國(guó)1,2,*景蕊蓮2

1省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 甘肅蘭州 730070;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081

利用水分高效基因資源創(chuàng)制新型小麥品種是應(yīng)對(duì)氣候變化和人口高速增長(zhǎng)的有效途徑。MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育, 生物和非生物脅迫。本研究在和中分別鑒定出19個(gè)和15個(gè)SNP, 基于這些多態(tài)性位點(diǎn)開(kāi)發(fā)了分子標(biāo)記。關(guān)聯(lián)分析表明,-4B-I是小穗數(shù)多的優(yōu)異單倍型。通過(guò)創(chuàng)制兩個(gè)回交導(dǎo)入系群體, 進(jìn)一步證實(shí)-4B-I有利于改善小麥穗部性狀。的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)-4B-I單倍型幼穗中的表達(dá)水平均高于-4B-II單倍型。此外,在水稻中的異源表達(dá)導(dǎo)致穗分支變多, 也證實(shí)參與調(diào)控每穗小穗數(shù)。小麥育成品種的時(shí)空分布分析發(fā)現(xiàn)盡管-4B-II在我國(guó)現(xiàn)代育成品種中占比最多, 但隨小麥育種時(shí)間的推進(jìn),-4B-I的占比在逐漸增多?？傊?是小麥每穗小穗數(shù)的正調(diào)節(jié)因子。因此, 本研究開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記可作為小麥標(biāo)記輔助選擇和遺傳改良的重要來(lái)源。

小麥; MYB轉(zhuǎn)錄因子; 農(nóng)藝性狀; KASP標(biāo)記; 關(guān)聯(lián)分析

小麥()是世界上最重要的谷類(lèi)作物之一, 占世界糧食總產(chǎn)量的三分之一[1]。在氣候變化和人口快速增長(zhǎng)的條件下, 小麥的生產(chǎn)面臨巨大挑戰(zhàn), 在小麥育種中探索和利用資源高效基因則是解決這一問(wèn)題的有效途徑[2]。小麥的產(chǎn)量由單位面積穗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重這三要素構(gòu)成。因此, 小麥的穗部結(jié)構(gòu)是一個(gè)關(guān)鍵性狀, 并直接決定了其產(chǎn)量, 而且每穗小穗數(shù)與每穗粒數(shù)密切相關(guān)[3-6]。

MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。MYB轉(zhuǎn)錄因子具有多種生物學(xué)功能, 參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、初生代謝及次生代謝[7-11]。目前, 已在水稻()[12]、擬南芥()[12]、小麥[13]中分別鑒定了155、197、393個(gè)MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)擬南芥細(xì)胞周期及根的生長(zhǎng)[14]; MYB轉(zhuǎn)錄因子、、、和等多個(gè)成員共同調(diào)控?cái)M南芥花藥的發(fā)育和功能[15-16];和過(guò)表達(dá)促進(jìn)木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的合成[17-18];不僅參與植物外種皮細(xì)胞的分化, 還具有毛狀體調(diào)控的作用[19]; 擬南芥MYB-relate類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子中的()、(C)和()是重要的光周期調(diào)節(jié)蛋白, 參與調(diào)節(jié)擬南芥開(kāi)花[20-21]; 玉米中MYB-relate類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子絨毛白蠟smh1端粒結(jié)合蛋白, 對(duì)維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄有重要的作用[22]。MYB轉(zhuǎn)錄因子同樣響應(yīng)干旱、高鹽、極端溫度、營(yíng)養(yǎng)缺乏等多種非生物脅迫和多種生物脅迫[23-30]。例如,是一個(gè)受干旱、ABA及鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因, 它可能通過(guò)參與調(diào)控表皮的合成及細(xì)胞增殖來(lái)響應(yīng)各種逆境脅迫[31-32]。擬南芥中的受到病原菌侵染時(shí)可以對(duì)細(xì)胞的死亡進(jìn)行調(diào)控[33]。

MYB家族MYB-CC亞族PHR (Phosphate Starvation Response)類(lèi)蛋白是磷信號(hào)通路中重要的中心調(diào)控因子, 其C端含有MYB結(jié)構(gòu)域和CC結(jié)構(gòu)域(Coiled-Coil domain)。其中, MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA結(jié)合域, CC結(jié)構(gòu)域有助于MYB結(jié)構(gòu)域與順式作用元件的準(zhǔn)確結(jié)合。PHR1的N端含有DNA激活結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)PHR1以二聚體的形態(tài)結(jié)合在靶基因的P1BS (PHR1 Binding Sequence)順式作用元件上, 從而調(diào)控下游基因的表達(dá)[34-36]。在小麥中的研究發(fā)現(xiàn), 過(guò)表達(dá)使小麥穗粒數(shù)增加從而增加產(chǎn)量[37]; 此外,在水稻中異位表達(dá)導(dǎo)致生物量、穗粒數(shù)和穗分支的增加[38]。

本研究通過(guò)發(fā)掘小麥、、基因上的多態(tài)性位點(diǎn), 開(kāi)發(fā)功能分子標(biāo)記, 通過(guò)關(guān)聯(lián)分析解釋多態(tài)性位點(diǎn)與農(nóng)藝性狀的關(guān)系, 發(fā)掘優(yōu)異單倍型, 為小麥分子育種提供分子標(biāo)記和優(yōu)異基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件

試驗(yàn)中使用了3個(gè)小麥自然群體(NPs)分析農(nóng)藝性狀, 采用主要分布在我國(guó)北方冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)[39]的323份材料組成的NP1進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。NP2主要來(lái)自中國(guó)小麥迷你核心種質(zhì)[40], 由157份農(nóng)家品種組成; NP3主要來(lái)源于中國(guó)小麥核心種質(zhì)[40], 由348份現(xiàn)代育成品種組成, 用于鑒定的單倍型及地理分布。

2015—2017年在北京順義(40°230′N(xiāo), 116°560′E)和北京昌平(40°130′N(xiāo), 116°130′E)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所田間試驗(yàn)站種植了NP1。田間水分管理分為雨水灌溉(干旱脅迫, DS)和正常灌溉(WW)兩種情況。DS是指在小麥的整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)不給予任何人工灌溉, 完全由雨水澆灌。WW是指在越冬前、拔節(jié)期、開(kāi)花期和灌漿期各階段澆水750 m3hm–2(75 mm)。此外, 還通過(guò)覆蓋塑料膜創(chuàng)造高溫脅迫環(huán)境對(duì)開(kāi)花后1周的小麥行熱處理(HS)。2015、2016和2017年生長(zhǎng)季的總降水量分別為161、173和127 mm。在所有不同條件下, 每份材料均勻點(diǎn)播在長(zhǎng)2.0 m間距0.3 m的4行小區(qū)內(nèi), 每行播種40粒。收獲時(shí)在每個(gè)小區(qū)中隨機(jī)選取5株測(cè)定株高(PH)、穗長(zhǎng)(SL)、花序梗長(zhǎng)(PLE)、倒二節(jié)長(zhǎng)(LPN)、每穗小穗數(shù)(NCS)、每穗粒數(shù)(NGS)和千粒重(TGW)等農(nóng)藝性狀, 獲得了16個(gè)環(huán)境下的小麥表型數(shù)據(jù)。

利用有顯著耐旱性的小麥品種旱選10號(hào)進(jìn)行基因序列的克隆和基因組序列分離。使用水稻品種Kitaake作為轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的受體。選擇具有不同表達(dá)水平的的3個(gè)T3純合轉(zhuǎn)基因水稻系進(jìn)行表型分析。

1.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TaPHR1的表達(dá)

為了確定小麥不同單倍型中的表達(dá)水平, 將小麥均勻點(diǎn)播在長(zhǎng)1 m間距0.15 m的4行小區(qū)內(nèi), 每行播種20粒。待小麥度過(guò)越冬期生長(zhǎng)到葉鞘直立期時(shí), 取出發(fā)育完整的幼穗, 檢測(cè)在小麥幼穗中的表達(dá)水平。取轉(zhuǎn)基因水稻的葉片檢測(cè)在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)量。

使用RNA Easy Fast Plant Tissue Kit (ThermoFisher Scientific, 中國(guó)香港)試劑盒提取穗和葉中的總RNA; 并使用試劑盒中的DNase I消除基因組DNA的潛在污染。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū), 使用TIANScript cDNA First-Strand Synthesis Kit (Tiangen,中國(guó)北京)將RNA (2?μg)合成cDNA的第一鏈。使用ABI PRISM 7900分析儀(Roche, 瑞士), SYBR Green PCR Master Mix (TaKaRa Biotechnology, 日本)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)。利用小麥微管蛋白(TaActin)和水稻肌動(dòng)蛋白(OsTubulin)作內(nèi)參基因, 標(biāo)定小麥和水稻中的相對(duì)表達(dá)水平(表1)。

PCR反應(yīng)條件包括95℃反應(yīng)2 min, 然后95℃ 10 s, 60℃ 30 s循環(huán)45次, 最后72℃時(shí)延長(zhǎng)10 min。為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性, 每組試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。使用2–ΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[41]。

1.3 TaPHR1序列多態(tài)性分析

使用的cDNA序列進(jìn)行BLAST (https:// urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.php)查詢, 獲得小麥中國(guó)春的基因組序列作為參考。利用小麥基因組變異聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)(http://wheat.cau.edu.cn/WheatUnion/)對(duì)進(jìn)行序列多態(tài)性分析, 尋找(Gene ID: TraesCS4A02G131700)、(Gene ID: TraesCS4B02G172900)、(Gene ID: TraesCS4D02G175000)的基因組序列及其啟動(dòng)子上的SNP位點(diǎn)。利用聚類(lèi)分析篩選、、的單倍型。其中本研究中使用的所有基因組DNA均使用CTAB法從小麥中提取[42]。

1.4 標(biāo)記開(kāi)發(fā)和關(guān)聯(lián)分析

對(duì)于高通量基因分型, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)KASP指南(http://www.lgcgenomics.com/)開(kāi)發(fā)KASP引物。對(duì)于TaPHR1-SNPA1和TaPHR1-SNPB1, 設(shè)計(jì)了2個(gè)正向引物(帶有特異尾部序列)和一個(gè)普通反向引物。然后使用KASP標(biāo)記應(yīng)用于NP1、NP2、NP3和回交導(dǎo)入系群體, PCR反應(yīng)體系所用引物由2個(gè)18 μL的正向引物(100 mmol L–1)、45 μL的反向引物(100 μmol L–1)和49 μL ddH2O組成。使用384PCR微孔板(LGC, 英國(guó))進(jìn)行分析, 在3 μL的混合體系中進(jìn)行反應(yīng), 該體系包括20 ng μL–1的模板DNA 1.5 μL, 1.5 μL KASP Mix (LGC Genomic, 384,Standard content ROX, 英國(guó)), 0.042 μL引物混合物和1.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件包括3步: 第1步: 94℃ 15 min, 94℃ 20 s, 第2步: 61～55℃10個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)遞減0.6℃, 第3步: 94℃ 20 s, 55℃ 60 s, 26個(gè)循環(huán), 于高通量水浴鍋PCR儀(Hydrocycle 64, LGC Genomic)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。利用Pherastar熒光掃描儀采集原始熒光信號(hào)。利用Kraken (V163.16.16288)軟件進(jìn)行基因分型, 使用SNPviwer2軟件分析分型結(jié)果。

運(yùn)用TASSEL (version 5.2.51)軟件的一般線性模型GLM (General Liner Model), 把群體結(jié)構(gòu)(Q)作為協(xié)變量, 將、的基因型和表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 當(dāng)<0.05時(shí)認(rèn)為該性狀具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用SPSS (version 16.0)軟件通過(guò)獨(dú)立T檢驗(yàn)檢測(cè)不同基因型/單倍型性狀差異的顯著性。

1.5 轉(zhuǎn)基因水稻的表型

使用旱選10的cDNA和pfu DNA聚合酶擴(kuò)增的全長(zhǎng)ORF序列, 在引物上游和下游分別添加I和I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶切割(表1)位點(diǎn),并在I位點(diǎn)和的起始密碼子之間插入30 bp的MYC標(biāo)簽序列, 然后將其克隆到雙元表達(dá)載體pCAMBIA1391中。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105, 再使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻(Kitaake)。通過(guò)PCR檢測(cè)T0代轉(zhuǎn)基因水稻, 并通過(guò)測(cè)序確定陽(yáng)性植株。

為了篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因株系, 利用0.1%的潮霉素篩選根分離比為3∶1的T2代轉(zhuǎn)基因系。為了鑒定純系轉(zhuǎn)基因水稻, 將T3代的種子用潮霉素篩選, 正常發(fā)芽沒(méi)有分離的株系為純合系。并通過(guò)qRT- PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中靶基因的表達(dá)水平。選擇3個(gè)不同表達(dá)水平的T3純合轉(zhuǎn)基因水稻株系進(jìn)行表型分析。將轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻野生型(WT)種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)站(北京)的水稻田中(39°48′N(xiāo), 116°28′E)。將水稻種子于5月下旬或6月初播種在塑料箱中。發(fā)芽15 d后, 將幼苗移植到水稻田中。在成熟時(shí)測(cè)定株高、分蘗數(shù)、主穗長(zhǎng)、穗分枝數(shù)和每穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀。使用自動(dòng)萬(wàn)深考種儀(SC-G, http://www.wseen.com/)測(cè)量了包括千粒重、粒長(zhǎng)和粒寬在內(nèi)的籽粒性狀。使用SPSS (version 16.0)軟件利用Duncan’s multiple range test進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析。

1.6 順式作用元件預(yù)測(cè)

啟動(dòng)子從起始密碼子上游開(kāi)始, 長(zhǎng)度為3000 bp。并使用PlantCARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子中的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaPHR1的分子表征

在六倍體普通小麥中克隆了的3種基因組序列, 根據(jù)它們的染色體位置, 分別命名為、和。的編碼區(qū)長(zhǎng)度為1473 bp, 編碼由490個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),的編碼區(qū)長(zhǎng)度為1344 bp, 編碼由447個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),的編碼區(qū)長(zhǎng)度為1356 bp, 編碼由451個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。3種基因組序列均包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子(圖1), 所編碼的3種蛋白質(zhì)序列均包含了保守的MYB motif和MYB-CC motif (附圖1)。其中與的氨基酸序列相似性為98.4%,與的氨基酸序列相似性為97.5%,與的氨基酸序列相似性為97.8% (附圖1)。

2.2 TaPHR1s序列多態(tài)性分析和分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

利用小麥基因組變異聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)(http://wheat. cau.edu.cn/WheatUnion/)對(duì)基因組序列和上游啟動(dòng)子序列進(jìn)行序列多態(tài)性分析, 在、、上分別發(fā)現(xiàn)了19、15、0個(gè)SNP位點(diǎn)。聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)有2種單倍型,有2種單倍型(圖1)。

針對(duì)上的SNP位點(diǎn), 在啟動(dòng)子區(qū)2490 bp處開(kāi)發(fā)了一個(gè)KASP標(biāo)記TaPHR1-SNPA1 (表1)以區(qū)分兩種單倍型, KASP分析的散點(diǎn)圖顯示了在X-(FAM)和Y-(HEX)軸上的種質(zhì)聚類(lèi)。強(qiáng)FAM信號(hào)聚集在右下角的藍(lán)點(diǎn), 強(qiáng)烈的HEX信號(hào)聚集在左上角的紅點(diǎn)。對(duì)于TaPHR1-SNPA1, 藍(lán)點(diǎn)的材料具有等位基因T, 紅點(diǎn)的材料具有等位基因C (附圖3)。

針對(duì)的SNP位點(diǎn), 在啟動(dòng)子區(qū)2171 bp處開(kāi)發(fā)了KASP標(biāo)記TaPHR1-SNPB1區(qū)分兩種單倍型。對(duì)于TaPHR1-SNPB1, 藍(lán)點(diǎn)的材料具有等位基因C, 紅點(diǎn)的材料具有等位基因T (圖1-D)。

表1 試驗(yàn)中使用的引物及用途

圖1 TaPHR1的核苷酸多態(tài)性和KASP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

圖A、B、C分別為標(biāo)注了、和的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn); 圖D: NP1中SNP-2171 bp的KASP標(biāo)記(附表1), 其中藍(lán)點(diǎn)代表FAM型等位基因C, 紅點(diǎn)代表HEX型等位基因T; 黑點(diǎn)為對(duì)照。

Fig. 1-A, B, and C indicate the SNP with,, and, respectively. Fig. 1-D: KASP assays for SNP-2171 bp in the accessions in NP1 (Table S1). The blue circles represent accessions that have the FAM-type allele and the red circles represent the HEX-type allele; the black squares are the non-template control. Allele ‘C’ in FAM and ‘T’ in HEX cluster.

2.3 TaPHR1-4B分子標(biāo)記與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

在NP1中鑒定了的2種單倍型, 但未與任何農(nóng)藝性狀存在顯著關(guān)聯(lián)。在NP1中鑒定了的兩種單倍型。其中,-4B-I在NP1中占6%,-4B-II在NP1中占94% (附表1)。表型分析結(jié)果顯示TaPHR1-SNPB1與每穗小穗數(shù)有顯著關(guān)聯(lián)(表2)。在16個(gè)環(huán)境中的13種環(huán)境下,-4B-I每穗小穗數(shù)(NCS)的平均值顯著多于-4B-II (圖2), 而在只有旱處理和正常灌溉條件下, 差異依然顯著, 說(shuō)明由多態(tài)性位點(diǎn)變異引起的每穗小穗數(shù)增加受環(huán)境影響較弱。TaPHR1-SNPB1與其他農(nóng)藝性狀, 如粒長(zhǎng)、粒寬、粒重、穗粒數(shù)等, 均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。說(shuō)明主要參與小麥小穗數(shù)發(fā)育。

表2 利用一般線性模型分析NP1中TaPHR1-4B單倍型與農(nóng)藝性狀相關(guān)性

SY: 順義; CP: 昌平; DS: 旱處理; HS: 熱處理; WW: 正常灌溉; NCS: 每穗小穗數(shù)。-value為0.05的概率顯著水平;*、**分別表示在0.05、0.01概率水平差異顯著。

Environments are Shunyi (SY) and Changping (CP) under well-watered (WW), drought-stressed (DS), heat-stressed (HS) conditions in 2015, 2016, and 2017. NCS: spikelet number per spike. Significant associations were determined using Duncan’s multi-range test in SPSS v.16.0.*:< 0.05;**:< 0.01.

2.4 回交群體材料TaPHR1-4B基因不同單倍型每穗小穗數(shù)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果, 創(chuàng)制了2個(gè)回交導(dǎo)入系群體, 豫麥8-魯麥14 (BC3F3)和洛陽(yáng)8628-晉麥47 (BC3F5), 來(lái)驗(yàn)證不同單倍型的作用。使用TaPHR1-SNPB1掃描2個(gè)回交群體和鑒定親本單倍型。對(duì)于豫麥8-魯麥14, 其供體親本豫麥8的基因型為-4B-I, 受體親本魯麥14的基因型為-4B-II, 與受體親本相比, 供體親本具有更高的NCS (圖3-A, B)。在豫麥8-魯麥14中有4個(gè)導(dǎo)入系(L1-L4)被鑒定為-4B-I。對(duì)于洛陽(yáng)8628-晉麥47, 其供體親本洛陽(yáng)8628的基因型為-4B-I, 受體親本晉麥47的基因型為-4B-II, 與受體親本相比, 供體親本具有更高的NCS。在洛陽(yáng)8628-晉麥47中只有一個(gè)導(dǎo)入系(L5)被鑒定為-4B-I。親本和被導(dǎo)入材料的NCS統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明, L1、L2、L3和L4的NCS都顯著高于受體親本魯麥14, L5的NCS也顯著高于受體親本晉麥47 (圖3-C, D)。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)參與小麥小穗數(shù)發(fā)育, 且-4B-I可能為其優(yōu)異單倍型。

圖2 16種環(huán)境下TaPHR1-4B兩種單倍型每穗小穗數(shù)比較

E: 環(huán)境, E1: 15-SY-WW; E2: 15-SY-WW-HS; E3: 15-SY-DS; E4: 15-SY-DS-HS; E5: 16-SY-WW; E6: 16-SY-WW-DS; E7: 16-SY-DS; E8: 16-SY-DS-HS; E9: 16-CP-WW; E10: 16-CP-DS; E11: 17-SY-WW; E12: 17-SY-WW-HS; E13: 17-SY-DS; E14: 17-SY-DS-HS; E15: 17-CP-WW; E16: 17-CP-DS。*、**、***分別表示在 0.05、0.01、0.001 概率水平差異顯著。誤差值: ±SE。

E: environment; E1: 15-SY-WW; E2: 15-SY-WW-HS; E3: 15-SY-DS; E4: 15-SY-DS-HS; E5: 16-SY-WW; E6: 16-SY-WW-DS; E7: 16-SY-DS; E8: 16-SY-DS-HS; E9: 16-CP-WW; E10: 16-CP-DS; E11: 17-SY-WW; E12: 17-SY-WW-HS; E13: 17-SY-DS; E14: 17-SY-DS-HS; E15: 17-CP-WW; E16: 17-CP-DS. *, **, and *** represent significant difference in the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively. Error bar: ±SE.

圖3 回交導(dǎo)入系群體中不同單倍型小麥每穗小穗數(shù)比較

回交導(dǎo)入系群體豫麥8-魯麥14 (A, B)和洛陽(yáng)8628-晉麥47 (C, D)中輪回親本與導(dǎo)入系(L1～L5)的比較。*、**、***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。誤差值: ±SE。

Comparison of recurrent parents with introgression lines (L1–L5) in donor parent Yumai 8-Lumai 14 (A, B) and Luoyang 8628-Jinmai 47 (C, D). *, **, and *** represent significant difference in the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively. Error bar: ±SE.

2.5 Hap-4B-I在幼穗中具有較高的轉(zhuǎn)錄水平

為研究不同單倍型的SNP與表達(dá)水平之間的關(guān)系, 在NP1中篩選相應(yīng)單倍型的材料, 每個(gè)單倍型的5份材料(包括2個(gè)回交的親本)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析, qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)各-4B-I材料幼穗中的表達(dá)量普遍高于各-4B-II材料,-4B-I材料的平均表達(dá)量高于-4B-II材料1.57倍(圖4)。

2.6 過(guò)表達(dá)TaPHR1增加水稻的穗分支

為了進(jìn)一步研究目標(biāo)基因的功能, 將轉(zhuǎn)入水稻, 觀察轉(zhuǎn)基因純合體水稻的形態(tài)和農(nóng)藝性狀。選擇表達(dá)水平不同的過(guò)表達(dá)水稻的3個(gè)純合系(附圖4)進(jìn)行性狀統(tǒng)計(jì)。如圖5和圖6所示, 轉(zhuǎn)基因植株的穗分支和主穗長(zhǎng)都顯著高于野生型(圖5-A和圖6)。進(jìn)一步說(shuō)明基因參與植物穂數(shù)發(fā)育。

2.7 中國(guó)小麥群體中TaPHR1-4B單倍型的地理和時(shí)間分布

根據(jù)地理位置、小麥類(lèi)型、氣候特征以及栽培特點(diǎn)和播種, 中國(guó)小麥生產(chǎn)區(qū)被劃分為10個(gè)主要農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū), 即北部冬麥區(qū)(I)、黃淮冬麥區(qū)(II)、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)(III)、西南冬麥區(qū)(IV)、華南冬麥區(qū)(V)、東北春麥區(qū)(VI)、北部春麥區(qū)(VII)、西北春麥區(qū)(VIII)、青藏春-冬麥區(qū)(IX)和新疆冬-春麥區(qū)(X)[43]。為了確定的優(yōu)異單倍型是否在小麥育種過(guò)程中被正向選擇, 研究了它們?cè)趦蓚€(gè)自然群體中的地理分布。在NP2 (地方品種)中, 除VI外, 所有小麥區(qū)域中-4B-II都是顯性單倍型(圖7-A)。相對(duì)于地方品種, 現(xiàn)代育成品種(NP3)中所有麥區(qū)-4B-II都是顯性單倍型(圖7-B)。在現(xiàn)代育成品種中,-4B-I的頻率在I區(qū)(26.3%～3.6%)、II區(qū)(14.3%～5.1%)、IV區(qū)(13%～0)、VI (33.3%～18.18%)、VII (33.3%～11.1%)、IX (7.69%～0)降低;-4B-I的頻率在III區(qū)(0～12.5%)和V區(qū)(0～1.96%)增加。為了評(píng)估單倍型頻率隨時(shí)間的變化, 將現(xiàn)代育成品種根據(jù)種植時(shí)間分為6個(gè)亞組, 結(jié)果可知-4B-I隨育種時(shí)間占比相對(duì)增多(圖8)。

圖4 TaPHR1在不同單倍型小麥種質(zhì)中的表達(dá)水平

每個(gè)單倍型5份材料, 包括2個(gè)回交群體的親本。誤差值: ±SE。

Five accessions of each haplotype, including the parents of two backcross populations. Error bar: ±SE.

圖5 TaPHR1過(guò)表達(dá)水稻農(nóng)藝性狀與野生型水稻的比較

轉(zhuǎn)基因水稻穗部特征(A)、成熟植株(B)。

Panicle characteristics (A) and mature plants (B) of transgenic rice.

圖6 TaPHR1過(guò)表達(dá)水稻農(nóng)藝性狀與野生型水稻穗分支的比較

轉(zhuǎn)基因水稻(OE-20、OE-26、OE-27)與野生型(WT)穗分枝比較。

Comparison of panicle branch between transgenic rice (OE-20, OE-26, and OE-27) and wild type (WT).

3 討論

MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中分布最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫與非生物脅迫等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[44]。多種MYB轉(zhuǎn)錄因子被證明與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。對(duì)側(cè)芽的發(fā)育有一定的控制作用[45]; 擬南芥中參與植物外種皮細(xì)胞的分化還和毛狀體的調(diào)控[19];對(duì)根毛的形成具有一定的調(diào)控作用[46]。本研究采用關(guān)聯(lián)分析法, 發(fā)現(xiàn)參與控制小麥的每穗小穗數(shù), 并通過(guò)回交導(dǎo)入系群體和轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)一步證明上述結(jié)果, 說(shuō)明在控制重要農(nóng)藝性狀發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。

本研究利用小麥基因組變異聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)、、上游啟動(dòng)子區(qū)和基因編碼區(qū)的基因組序列進(jìn)行序列多態(tài)性分析(圖1-A, B), 發(fā)現(xiàn)TaPHR1-SNPB1在各農(nóng)藝性狀中僅與小麥每穗小穂數(shù)存在顯著關(guān)聯(lián)(圖2和表2)。前人研究發(fā)現(xiàn),在水稻中異位表達(dá)導(dǎo)致穗分支增加[38]。本研究中轉(zhuǎn)基因水稻的表型分析發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)能增加水稻的穗分枝數(shù), 進(jìn)一步證實(shí)PHR類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子參與小穂數(shù)發(fā)育。但轉(zhuǎn)基因水稻的表型分析發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)降低了水稻的千粒重和單株產(chǎn)量(附圖5)。前人研究發(fā)現(xiàn)在水稻中超量表達(dá)PHR類(lèi)基因可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻中的磷過(guò)量積累, 從而抑制生長(zhǎng)導(dǎo)致減產(chǎn)[37,47]。這與本研究結(jié)果類(lèi)似。以上結(jié)果也暗示著基因除了影響小穂數(shù)外, 可能在其他產(chǎn)量相關(guān)性狀中起一定的負(fù)調(diào)控作用。目前, 不少研究發(fā)現(xiàn)影響產(chǎn)量的各要素間, 經(jīng)常存在互相拮抗的作用, 如小穂數(shù)增多, 則常伴隨著穗粒數(shù), 或者千粒重等農(nóng)藝性狀下降, 從而導(dǎo)致產(chǎn)量降低, 這與本研究的結(jié)果類(lèi)似[48-49]。

圖7 TaPHR1-4B兩種單倍型在我國(guó)十大麥區(qū)的地理分部

兩個(gè)單倍型在我國(guó)十大麥區(qū)農(nóng)家品種(A)和育成品種(B)群體中的分布。I: 北方冬麥區(qū); II: 黃淮冬麥區(qū); III: 長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū); IV: 西南冬麥區(qū); V: 南方冬麥區(qū); VI: 東北春麥區(qū); VII: 北方春麥區(qū); VIII: 西北春麥區(qū); IX: 青-藏冬春麥區(qū); X: 新疆冬春麥區(qū)。餅圖的大小與種群中小麥品種的數(shù)量成正比。

Haplotype distributions ofin (A) Chinese landraces and (B)modern cultivars. I: Northern Winter Wheat Zone; II: the Yellow and Huai River Valleys Facultative Wheat Zone; III: the Middle and Low Yangtze Valleys Autumn-Sown Spring Wheat Zone; IV: Southwestern Autumn-Sown Spring Wheat Zone; V: Southern Autumn Sown Spring Wheat Zone; VI: Northeastern Spring Wheat Zone; VII: Northern Spring Wheat Zone; VIII: Northwestern Spring Wheat Zone; IX: Qinghai Tibetan Plateau Spring-Winter Wheat Zone; X: Xinjiang Winter-Spring Wheat Zone. The size of pie chart is directly proportional to the number of wheat accessions in the population.

圖8 TaPHR1-4B兩種單倍型在中國(guó)小麥品種中頻率隨時(shí)間的變化

屬于MYB-CC亞族成員, 其C端含有經(jīng)典的MYB結(jié)構(gòu)域和CC結(jié)構(gòu)域。有研究發(fā)現(xiàn), 水稻MYB轉(zhuǎn)錄因子()通過(guò)調(diào)節(jié)()的表達(dá)控制籽粒的形成, 進(jìn)而調(diào)節(jié)粒數(shù)和穗結(jié)構(gòu)的發(fā)育[50]。MYB蛋白()能夠控制水稻籽粒的發(fā)育[51]。擬南芥R2R3型轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)擬南芥細(xì)胞周期及根的生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究基因表達(dá), 發(fā)現(xiàn)在擬南芥根部大量表達(dá)[52]。水稻()編碼的MYB蛋白可以調(diào)節(jié)小穗的分生組織發(fā)育, 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在幼穗中表達(dá)量最高[53]。本研究發(fā)現(xiàn)的優(yōu)異單倍型-4B-I在幼穗中高表達(dá), 進(jìn)一步表明可能參與小麥幼穗發(fā)育調(diào)控, 最終導(dǎo)致產(chǎn)生了更多的小穂。

從兩種單倍型頻率隨時(shí)間的變化分析可知-4B-I隨育種時(shí)間占比相對(duì)增多, 暗示著-4B-I作為與小穂數(shù)相關(guān)聯(lián)的優(yōu)異單倍型正在得到正向選擇。但從兩種單倍型在我國(guó)十大麥區(qū)的地理分布來(lái)看,-4B-II在現(xiàn)代育成品種中普遍占優(yōu)勢(shì); 考慮到轉(zhuǎn)基因水稻除了穗分枝外, 其他與產(chǎn)量相關(guān)的農(nóng)藝性狀均呈下降趨勢(shì), 因此也可能是每穗小穗數(shù)變少的-4B-II單倍型被正向選擇, 最終提高了小麥產(chǎn)量。

標(biāo)記輔助選擇(MAS)是精確育種的重要工具之一, 是加速小麥育種進(jìn)程的有效方法?；诠δ芑虻牡任换蜃凅w開(kāi)發(fā)的, 可以準(zhǔn)確區(qū)分目標(biāo)基因的等位基因, 是小麥育種中MAS的理想分子標(biāo)記[54]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在多種環(huán)境下,與NCS顯著相關(guān), 并在回交導(dǎo)入系群體和水稻轉(zhuǎn)基因系中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。這些功能標(biāo)記可有效識(shí)別自然群體中的不同等位基因/單倍型, 并可用于小麥育種。

4 結(jié)論

小麥基因在小麥自然群體中都存在2種單倍型, 其中-4B-I是每穗小穗數(shù)多的優(yōu)異單倍型。盡管-4B-II在我國(guó)現(xiàn)代育成品種中占比最多, 但隨小麥育種時(shí)間的推進(jìn),-4B-I的占比在逐漸增多。TaPHR1-SNPB1可以用于改良農(nóng)作物的穗部性狀, 其功能標(biāo)記將有利于小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種。

附表 請(qǐng)見(jiàn)網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中國(guó)知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬(wàn)方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical- zuowxb.aspx。

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Transcription factor geneinvolved in regulation spikelet number per spike in common wheat

ZHANG Yi-Ning1,2, ZHANG Yan-Fei2, WANG Min2, WANG Jing-Yi2, LI Long2, LI Chao-Nan2, YANG De-Long1,*, MAO Xin-Guo1,2,*, and JING Rui-Lian2

1State Key Laboratory of Arid land Crop Science /College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Germplasm and Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081, China

The utilization of water elite genetic resources to develop new wheat varieties is an effective approach to deal with the challenges of climate change and rapid population growth. The MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog) transcription factors are one of the largest families of transcription factors in plants and are involved in plant growth and development and in the regulation of biotic and abiotic stresses. In this study, 19 SNPs and 15 SNPs were identified inand, respectively, and the molecular markers were developed based on these SNPs. Association analysis showed that-4B-I was the elite haplotype with high Total number of spikelet per spike (NCS).-4B-I was further confirmed to be beneficial for improving wheat spike traits by creating two backcross introgression population lines. Fluorescencequantitative polymerase chain reaction ofrevealed that the relative expression level ofgenes in young spikelets of-4B-I haplotype was higher than that of-4B-II haplotype. In addition, the heterologous expression ofin rice resulted in more panicle branches, which also confirmed the involvement ofin the regulation of NCS. The geographic and temporal distribution of wheat modern varieties revealed that although-4B-II accounted for the largest proportion of modern varieties in China, the proportion of-4B-I was gradually increasing as wheat breeding time progressed. In conclusion,was a positive regulator of NCS in wheat. Therefore, the molecular markers developed in this study could be an important source of marker-assisted selection and genetic improvement in wheat.

wheat; MYB transcription factor; agronomic trait; KASP marker; association analysis

2023-05-24;

2023-07-06.

10.3724/SP.J.1006.2023.31008

通信作者(Corresponding author): 楊德龍, E-mail: yangdl@gsau.edu.cn; 毛新國(guó), E-mail: maoxinguo@caas.cn

E-mail: zyn18845111029@163.com

2023-02-03;

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0300707), 甘肅省農(nóng)業(yè)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(21YF5NA089)和甘肅省高等學(xué)校產(chǎn)業(yè)支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2022CYZC-44)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0300707), the Key Research and Development Program of Gansu Province, China (21YF5NA089), and Industrial Support Plan of Colleges and Universities in Gansu Province, China (2022CYZC-44).

URL: https://kns.cnki.net/kcms2/detail/11.1809.S.20230705.1720.002.html

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