趙曉鑫 黃爍淇 譚文勃 興 旺 劉大麗,*

甜菜HIPPs基因家族鑒定與鎘脅迫下的表達(dá)分析

趙曉鑫1,2黃爍淇1,2譚文勃1,2興 旺1,2劉大麗1,2,*

1黑龍江大學(xué)國(guó)家甜菜種質(zhì)中期庫(kù), 黑龍江哈爾濱 150080;2黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150080

鎘離子平衡和解毒調(diào)控是探索甜菜鎘脅迫耐受機(jī)制的核心, 也是利用甜菜進(jìn)行重金屬生物修復(fù)的基礎(chǔ)。重金屬相關(guān)的異戊二烯植物蛋白(HIPPs)是一類多功能金屬伴侶蛋白, 在鎘離子吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及區(qū)隔化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。前期甜菜響應(yīng)鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜研究中, 發(fā)現(xiàn)存在差異表達(dá)?；诖? 本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法全基因組鑒定了BvHIPPs基因家族成員, 并對(duì)其理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件、染色體定位及在鎘脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性進(jìn)行了深入的分析。結(jié)果表明, 甜菜基因組中共有23個(gè)BvHIPPs家族成員, 均含有HMA結(jié)構(gòu)域和異戊二烯化基序, 其中16個(gè)BvHIPPs被定位于細(xì)胞核。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)BvHIPPs可參與多種生物與非生物脅迫響應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明23個(gè)BvHIPPs均不同程度的參與到甜菜對(duì)鎘脅迫的應(yīng)答過(guò)程, 并且進(jìn)一步的qRT-PCR分析驗(yàn)證了應(yīng)答鎘脅迫的調(diào)控特點(diǎn)。結(jié)果表明,可能在甜菜適應(yīng)鎘脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用, 研究結(jié)果為甜菜在重金屬污染生物修復(fù)的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

甜菜; HIPPs; 鎘脅迫; 基因家族鑒定; 轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性

近幾十年來(lái), 由于工業(yè)的快速發(fā)展和農(nóng)藥的使用, 導(dǎo)致重金屬在土壤中過(guò)度積累, 環(huán)境中的重金屬污染增加[1-2]。重金屬會(huì)在植物體內(nèi)產(chǎn)生毒性作用, 使植物萎黃, 抑制其生長(zhǎng)和生物量積累, 限制光合作用、養(yǎng)分同化, 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分失衡以及衰老, 甚至植物死亡[3]。鎘(Cadmium, Cd)是一種對(duì)植物危害非常大的重金屬, 它可以影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多過(guò)程[4]。研究表明, 極低濃度的Cd即會(huì)顯著影響植物的種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)[5]。不同濃度的Cd也會(huì)影響植物的根系生長(zhǎng)[6]。植物的光合指數(shù), 如光合速率(n)和胞間CO2濃度(i)在Cd應(yīng)激下會(huì)受到嚴(yán)重抑制[7]。為了在含有重金屬的環(huán)境中生存, 植物必須制定一系列策略來(lái)應(yīng)對(duì)重金屬毒害[8]。已有研究表明, ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC), 鋅/鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ZRT, IRT-like protein, ZIP), 重金屬ATP酶(HMA3), 陽(yáng)離子擴(kuò)散促進(jìn)劑(Cation diffusion facilitator family, CDF)和重金屬相關(guān)的異戊二烯化植物蛋白(HIPP)[9]等蛋白質(zhì)家族均可參與到植物的重金屬解毒。

HIPP是一類特殊的金屬伴侶蛋白, 其含有1個(gè)或2個(gè)HMA (Heavy metal-associated domain)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)異戊二烯化基序CaaX (C代表半胱氨酸; a代表脂肪族氨基酸; X通常代表甲硫氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸)[10]。異戊二烯化, 也被稱為法尼?；? 是一種翻譯后的蛋白質(zhì)修飾, 指翻譯后的脂質(zhì)修飾, 其中15碳法尼基或20碳香葉酰香葉酰異戊二烯可通過(guò)硫醚鍵與特定半胱氨酸殘基連接, 這實(shí)際上是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-膜的相互作用[11]。盡管HMA結(jié)構(gòu)域和異戊二烯化過(guò)程廣泛存在于許多生物中, 但僅在植物的HIPPs中同時(shí)存在這兩種結(jié)構(gòu)。1999年, Dykema等發(fā)現(xiàn)HIPPs具有結(jié)合Cu2+、Ni2+和Zn2+的能力, 它們可以通過(guò)HMA結(jié)構(gòu)域的CXXC核心基序結(jié)合Cd2+、Hg2+和Pb2+ [12], 但不能結(jié)合Ca2+、Mn2+或Co2+ [13]。水稻、和分別表達(dá)于釀酒酵母突變體、、和中, 它們均表現(xiàn)出對(duì)Mn、Cu、Cd和Zn毒性的敏感[14]。過(guò)量表達(dá)可以提高水稻植株對(duì)Cd的耐受性, 而缺失突變體對(duì)Cd表現(xiàn)的極為敏感[15]。在過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻和敲除突變系中均驗(yàn)證了介導(dǎo)的Cd離子排毒和積累特性; 此外, 缺失突變體在Cd脅迫下雖然表現(xiàn)出較低的生長(zhǎng)勢(shì), 但在水稻秸稈特別是籽粒中卻發(fā)現(xiàn)Cd的積累水平顯著降低[16]。在對(duì)擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn), HIPPs可能在Cd的解毒以及其他生物和非生物脅迫中發(fā)揮作用。擬南芥突變體對(duì)Cd敏感, Cd的積累量比野生型少, 這表明HIPPs可以通過(guò)結(jié)合Cd在重金屬穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用[13]。擬南芥AtHIPP3是一種核鋅結(jié)合蛋白, 它的表達(dá)受干旱和脫落酸(ABA)的抑制。的過(guò)量表達(dá)會(huì)直接或間接影響400個(gè)基因的調(diào)控, 這些基因中的大多數(shù)都參與水楊酸途徑中的病原體反應(yīng); 還有部分基因參與非生物脅迫反應(yīng)和種子發(fā)育[17]。的功能喪失會(huì)降低植株對(duì)囊線蟲(chóng)侵染的易感性, 且不會(huì)對(duì)植物表型產(chǎn)生負(fù)面影響[18]。Zhang等[19]利用VIGS技術(shù)沉默表達(dá)來(lái)驗(yàn)證對(duì)小麥條銹病的功能發(fā)現(xiàn),在Pst易感性中起重要作用。在煙草中降低的表達(dá)可以抑制病毒的長(zhǎng)距離移動(dòng); 此外, 干旱和馬鈴薯帚頂病毒(potato mop-top virus, PMTV)侵染會(huì)上調(diào)基因的表達(dá)[20]。目前, HIPPs基因家族已在擬南芥(45)[21]、水稻(74)[14]、小麥(114)[22]、楊樹(shù)(14)[23]、甘藍(lán)型油菜(104)[24]等物種中得到了鑒定, 但在甜菜等能源作物中還未見(jiàn)報(bào)道。

甜菜(L.)是一類新興的能源作物, 對(duì)環(huán)境具有廣泛的適應(yīng)性, 且塊根含糖量高, 是生產(chǎn)乙醇的最佳原料[25]。因此, 利用甜菜進(jìn)行重金屬污染生物修復(fù)的研究具有能源生產(chǎn)和土壤修復(fù)的雙重意義。在我們前期對(duì)甜菜在鎘脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn), BvHIPPs的差異表達(dá)在基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜中十分顯著, 猜測(cè)它們可能作為重要的金屬伴侶蛋白在甜菜體內(nèi)發(fā)揮功能。因此, 本研究通過(guò)對(duì)23個(gè)BvHIPPs家族成員的全基因組鑒定, 從系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、蛋白理化性質(zhì)、順式作用元件等方面進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè), 通過(guò)RNA-seq及qRT-PCR進(jìn)一步研究它們對(duì)鎘脅迫的應(yīng)答特性。為進(jìn)一步解析BvHIPPs的生物學(xué)功能及其金屬離子解毒機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗(yàn)選用的甜菜種質(zhì)為塊根產(chǎn)量、蔗糖含量及蔗糖產(chǎn)量等指標(biāo)均表現(xiàn)良好的‘780016B/12優(yōu)’ (國(guó)家甜菜種質(zhì)中期庫(kù), 哈爾濱)。蛭石萌發(fā)至2片子葉展開(kāi)后, 將甜菜幼苗培養(yǎng)于Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中, 培養(yǎng)至4片真葉期。用濃度為0.5 mmol L–1的CdCl2溶液灌根處理甜菜幼苗3 h、6 h、12 h及24 h, 以正常條件下生長(zhǎng)的甜菜幼苗為對(duì)照, 每個(gè)處理重復(fù)3次, 分別取甜菜地上部及地下部組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及qRT-PCR分析。

1.2 BvHIPPs基因家族成員的鑒定與特征分析

在Ensemble網(wǎng)站(https://plants.ensembl.org/ index.html)下載甜菜、擬南芥全基因組序列、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)及基因組注釋文件。從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// pfam.Xfam.org/)下載HMA的隱馬爾可夫模型(PF00403)對(duì)甜菜蛋白進(jìn)行篩選[26]。以擬南芥HIPPs基因家族的氨基酸序列作為基礎(chǔ), 通過(guò)TBtools (https://github.com/CJ-Chen/TBtools) BLAST獲取甜菜的同源基因[27]。將上述2種結(jié)果進(jìn)行合并取重復(fù)值, 最后通過(guò)檢測(cè)其C端是否含有異戊二烯化基序, 進(jìn)一步篩選甜菜基因組中的BvHIPPs候選基因。

利用在線網(wǎng)站分析工具ExPASy網(wǎng)站(https:// web.expasy.org/protparam)對(duì)BvHIPPs進(jìn)行蛋白理化特性分析, 利用在線網(wǎng)站Cell-PLoc 2.0 (http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對(duì)BvHIPPs進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 HIPPs系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

利用MEGA X[28]軟件對(duì)23個(gè)BvHIPPs和45個(gè)AtHIPPs的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì), 采用鄰近法(Neighbour-Joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 其中Bootstrap method值設(shè)定為1000, 其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值[29]。

1.4 BvHIPPs基因家族染色體定位分析

使用TBtools[27]軟件從甜菜基因組gff文件中提取BvHIPPs基因家族成員的染色體位置信息, 并進(jìn)行繪圖可視化。

1.5 BvHIPPs蛋白結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、Motif及順式作用元件分析

利用在線軟件MEME[30](https://meme-suite.org/ meme/tools/meme)對(duì)初步鑒定得到的BvHIPPs蛋白全長(zhǎng)序列進(jìn)行保守序列和重要功能位點(diǎn)及motif分析,參數(shù)為默認(rèn)值; 利用Pfam (http://pfam.Xfam.org/)和TBtools對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析; 利用TBtools軟件對(duì)BvHIPPs基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析[31]。利用TBtools軟件提取BvHIPPs基因家族成員的上游2000 bp的序列, 通過(guò)Plant CARE[32](http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線軟件進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)。

1.6 鎘脅迫下BvHIPPs基因家族的差異表達(dá)分析

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)定的甜菜應(yīng)答鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 采用FPKM (Fragments per Kilobase Million)法計(jì)算BvHIPPs家族基因在鎘脅迫下的表達(dá)量并進(jìn)行差異表達(dá)分析, 利用TBtools軟件進(jìn)行聚類表示。

1.7 qRT-PCR熒光定量分析

利用TRIzol[33]提取0.5 mmol L–1的CdCl2處理3 h、6 h、12 h、24 h及對(duì)照的甜菜葉片和根系的總RNA, 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)目的基因序列。分別設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1), 使用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR, 檢測(cè)每份樣品的目的基因和內(nèi)參基因Ct值, 3次重復(fù)。利用2–ΔΔCt法[34]進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析, 并使用Origin (版本2021)作圖軟件計(jì)算并作圖。

表1 熒光定量引物及序列

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與分析

2.1 BvHIPPs基因家族成員的鑒定與特征分析

在Pfam網(wǎng)站中利用序列號(hào)(PF00403)鑒定BvHIPPs基因。在Ensemble網(wǎng)站中下載甜菜全基因組蛋白序列。通過(guò)隱馬爾科夫模型(PF000403)搜索甜菜蛋白質(zhì)組中的HIPPs蛋白序列。鑒定出23個(gè)蛋白質(zhì)的氨基端(N端)含有重金屬結(jié)構(gòu)域(HMA)以及羧基端(C端)含有CaaX異戊二烯化位點(diǎn)的基因。

由表2可知, BvHIPPs蛋白序列長(zhǎng)度范圍在101～562 aa, 平均長(zhǎng)度為238 aa; 相對(duì)分子質(zhì)量從12.70 kD (BVRB_3g053310)到55.91 kD (BVRB_ 3g069170), 平均相對(duì)分子質(zhì)量為25.78 kD; 平均等電點(diǎn)為8.1, 大部分的BvHIPPs為堿性蛋白; 所有的BvHIPPs蛋白均表現(xiàn)為親水性(平均疏水指數(shù)范圍在–1.301至–0.149); 通過(guò)在線網(wǎng)站CeLL-PLoc 2.0對(duì)BvHIPPs進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè), 16個(gè)BvHIPPs定位在細(xì)胞核, 1個(gè)BvHIPP定位于線粒體(BVRB_ 1g021330), 3個(gè)BvHIPPs定位于多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu): 如線粒體和細(xì)胞核(BVRB_9g214040)、葉綠體和細(xì)胞核(BVRB_6g142690), 葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(BVRB_3g053310); BVRB_6g129220、BVRB_ 6g135550及BVRB_3g055490未預(yù)測(cè)到其亞細(xì)胞定位, 可能是由于其缺少經(jīng)典的信號(hào)肽。

表2 BvHIPPs基因家族的基本信息

Table 2 Basic information of BvHIPPsgene family in Beta vulgaris L.

(續(xù)表2)

2.2 BvHIPPs家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了探究BvHIPPs家族成員的親緣進(jìn)化關(guān)系, 利用MEGA X軟件將BvHIPPs和已確定的45個(gè)擬南芥AtHIPPs共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。從進(jìn)化樹(shù)看出, BvHIPPs被分為4個(gè)亞族。其中第4個(gè)亞族成員最多共有33個(gè)成員(12個(gè)BvHIPPs和21個(gè)AtHIPPs), 推測(cè)第4亞族的基因在重金屬穩(wěn)態(tài)方面行駛著更為重要的功能。而HIPPs基因在甜菜中數(shù)量較少的原因可能與缺乏片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)有關(guān)。

2.3 BvHIPPs基因的染色體定位

23個(gè)BvHIPPs基因中, 20個(gè)基因分布在甜菜的9條染色體上(圖2)。3號(hào)染色體包含的基因最多, 有6個(gè), 并且出現(xiàn)了一處串聯(lián)重復(fù); 其次是Chr 6上分布了3個(gè)基因; Chr. 1、Chr. 8、Chr. 9上均分布了1個(gè)家族成員; Chr. 2、Chr. 4、Chr. 5、Chr. 7上均分布了2個(gè); 其余的3個(gè)基因定位在scaffold上, 未定位在染色體上。

2.4 BvHIPPs基因家族成員的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

由圖3可知, 從基因結(jié)構(gòu)可以看出, 所有均含有外顯子和內(nèi)含子, 但其數(shù)量和位置不同。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)所有的基因序列均含有HMA結(jié)構(gòu)域, 其中_7g161540、_ 3g050800、_5g126430、_8g184430含有2個(gè)HMA結(jié)構(gòu)域, 其余均含有1個(gè)HMA結(jié)構(gòu)域。此外,_3g048110含有PRK10163超家族結(jié)構(gòu)域。

在基因中共發(fā)現(xiàn)6個(gè)motif, 基因家族中的每個(gè)成員分別含有2～5個(gè)motif。motif 2存在于所有的BvHIPPs基因家族成員中, 大部分基因含有motif 3和motif 5。只有不含motif 1, 但含有2個(gè)motif 6。通過(guò)motif氨基酸序列分析結(jié)果可知, motif 1和motif 6含有重金屬結(jié)構(gòu)域, motif 2含有異戊二烯化基序, 說(shuō)明這3個(gè)基序可能是基因的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生的基本構(gòu)件。

2.5 BvHIPPs基因家族順式作用元件分析

由圖4可知, 大部分s基因均含有光響應(yīng)的相關(guān)調(diào)控元件(light responsiveness)、脫落酸響應(yīng)的順式作用元件(abscisic acid responsiveness, ABRE)、厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件(anaerobic induction, ARE)、生長(zhǎng)素類響應(yīng)元件(auxin-respon-sive element, TGAE)、富含TC逆境和防御響應(yīng)順式作用元件(defense and stress responsiveness)、低溫應(yīng)答元件(low-temperature responsiveness)、CGTCA- motif響應(yīng)元件(MeJA-responsiveness)、MYB結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的的順式作用元件及水楊酸應(yīng)答元件(Salicylic acid responsiveness)等。其中、、、含有富含AT的DNA結(jié)合蛋白(ATBP-1)的結(jié)合位點(diǎn)(binding site of AT-rich DNA binding protein (ATBP-1))。含有以上順式元件的數(shù)目最多, 共有33個(gè);只含2個(gè)上述順式元件。其中厭氧誘導(dǎo)元件、逆境和防御響應(yīng)元件等均與非生物脅迫相關(guān)。BvHIPPs含有多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), 這些轉(zhuǎn)錄因子可能參與非生物逆境脅迫下的BvHIPPs的調(diào)控。

圖1 甜菜及擬南芥的HIPPs家族進(jìn)化分析

紅色星號(hào)代表, 藍(lán)色圓形代表。The red asterisk represents theand the blue circle represents the.

圖2 BvHIPPs基因家族染色體分布

藍(lán)色和黃色線段代表染色體密度。Both blue and yellow lines represent chromosome density.

A: motif; B: 蛋白結(jié)構(gòu)域; C: 基因結(jié)構(gòu); D: motif氨基酸序列。

A: motif; B: protein domain; C: genetic structure; D: motif amino acid sequence.

圖4 甜菜BvHIPPs基因家族順式元件分析

2.6 鎘脅迫下BvHIPPs基因家族的差異表達(dá)分析

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室前期研究成果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了鎘脅迫下BvHIPPs基因家族的表達(dá)譜(圖5)。23個(gè)均不同程度的受到鎘脅迫的調(diào)控。葉中, 有5個(gè)基因(、、、、) (|log2(Fold Change)|≥1;< 0.05)顯著的受到鎘脅迫的正向調(diào)控, 其中上調(diào)的差異表達(dá)倍數(shù)最大。根中, 10個(gè)BvHIPPs基因(、、、、、、、、、)在鎘脅迫中表達(dá)量顯著上調(diào)。其中,、、在鎘脅迫下的甜菜根和葉中的表達(dá)均受鎘脅迫的誘導(dǎo)。

總體來(lái)講, 在甜菜地下部中共有14個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì), 9個(gè)基因呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。在甜菜地上部共有13個(gè)基因呈上表達(dá)趨勢(shì), 10個(gè)基因呈下表達(dá)趨勢(shì)(圖5)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證BvHIPPs基因家族在鎘脅迫下的表達(dá)特性, 本研究利用qRT-PCR分析了對(duì)不同時(shí)間的鎘脅迫的響應(yīng)。由圖6可知, 在葉中, 共有19個(gè)基因經(jīng)鎘脅迫后轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)。其中,和在鎘脅迫3 h時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)量最高; 鎘脅迫6 h后,、、、、、、和的轉(zhuǎn)錄表達(dá)達(dá)到最大值; 分別有5個(gè)基因(、、、和)和4個(gè)基因(、、和)的轉(zhuǎn)錄本在鎘脅迫12 h或24 h后達(dá)到峰值;、、和表現(xiàn)為鎘脅迫后的下調(diào)轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖5 甜菜BvHIPPs家族基因在鎘脅迫下的差異表達(dá)分析

CV_L和CV_R分別代表正常生長(zhǎng)條件下基因在葉部和根部的表達(dá)量; Cd_L和Cd_R分別代表0.5 mmol L–1的CdCl2處理6 h條件下基因在葉部和根部的表達(dá)量。

CV_L and CV_R represent the relative expression levels ofgenes in leaves and roots under normal growth conditions, respectively. Cd_L and Cd_R represent the relative expression levels ofgenes in leaves and roots after 6 h treatment with 0.5 mmol L–1CdCl2, respectively.

圖6 鎘脅迫下BvHIPPs基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

不同大寫(xiě)字母表示不同時(shí)間下各組之間的顯著性差異(< 0.05); 不同小寫(xiě)字母表示同一時(shí)間下根和葉之間的顯著性差異(< 0.05)。

Different uppercase letters indicate significant differences between groups in different times at< 0.05; Different lowercase letters indicate significant differences between roots and leaves in the same time at< 0.05.

在根中, 總體上共有17個(gè)基因經(jīng)鎘脅迫后轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)。其中,在鎘脅迫3 h時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)量最高; 共有10個(gè)基因(、、、、、、、、和)的轉(zhuǎn)錄本在鎘脅迫6 h后達(dá)到最大值; 鎘脅迫下, 分別有3個(gè)(、和)和3個(gè)(、和)基因在12 h或24 h表現(xiàn)出最大誘導(dǎo)量; 而、、、、和這6個(gè)基因經(jīng)鎘脅迫后轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)。綜上所述, BvHIPPs基因家族成員均不同程度的受到了鎘脅迫的調(diào)控。

3 討論

鎘是當(dāng)今世界上公認(rèn)的最具毒性的重金屬之一,它不能自然降解, 并且對(duì)植物有非常嚴(yán)重的危害[35]。當(dāng)植物受到重金屬脅迫和金屬毒性時(shí), 除了激活抗氧化系統(tǒng)外[36], 金屬離子會(huì)在進(jìn)入細(xì)胞后與蛋白質(zhì)和小分子配體螯合, 形成的螯合物會(huì)被金屬伴侶蛋白運(yùn)輸[37], 以降低毒害作用。金屬伴侶蛋白通常是細(xì)胞內(nèi)的可溶性蛋白, 它們能緊密地結(jié)合金屬離子, 保護(hù)其他細(xì)胞成分免受毒害反應(yīng), 并可安全地將金屬離子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi), 將金屬螯合在液泡中[38]。HIPPs作為金屬伴侶蛋白家族成員之一, 可以結(jié)合金屬離子, 積累或降低植物體內(nèi)的重金屬毒害。此類蛋白一般含有一個(gè)或多個(gè)HMA結(jié)構(gòu)域和C端含有一個(gè)異戊二烯化基序。目前已在擬南芥、小麥、水稻等多種物種中鑒定出了基因, 并且被證明可直接參與重金屬穩(wěn)態(tài)[14]。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)手段, 共鑒定出23個(gè)BvHIPPs家族成員, 其基因家族成員數(shù)量遠(yuǎn)低于擬南芥、小麥和水稻等植物[22-23], 這說(shuō)明了該基因在不同物種間具有多樣性, 推測(cè)基因在植物進(jìn)化過(guò)程中存在基因復(fù)制和功能分化的現(xiàn)象[10]。結(jié)合AtHIPPs蛋白家族構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)可知, 所有的BvHIPPs被分為4個(gè)亞族, 與前人研究過(guò)的HIPPs劃分類別不一致[22], 可能是由于基因在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了功能分化的現(xiàn)象, 所以導(dǎo)致部分BvHIPPs蛋白與AtHIPPs蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 出現(xiàn)了有些分支上沒(méi)有基因的現(xiàn)象。已有研究表明, 擬南芥AT4G38580蛋白可以提高酵母突變體的鎘耐受性, AT5G17450可以結(jié)合鎘離子, 在鎘解毒過(guò)程中發(fā)揮作用[13]。AT5G63530能夠有效的與Cu2+、Ni2+和Zn2+結(jié)合, 對(duì)平衡植物體內(nèi)有毒離子的穩(wěn)態(tài)起著非常重要的作用[13]。通過(guò)HMA重金屬結(jié)合域調(diào)控鋅指轉(zhuǎn)錄因子[39]。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析第3亞族中和親緣關(guān)系較近。第4亞族中和、和、和親緣關(guān)系較近, 我們可以推測(cè)此以上基因在進(jìn)化方向上有著很強(qiáng)的相似性, 在金屬穩(wěn)態(tài)方面行駛著重要的功能。通過(guò)亞細(xì)胞預(yù)測(cè), 可知16個(gè)BvHIPPs位于細(xì)胞核, 1個(gè)BvHIPP位于線粒體、3個(gè)BvHIPPs定位于多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu), 說(shuō)明它們?cè)趨⑴c生物過(guò)程中具有不同的功能, 這與一些關(guān)于HIPPs蛋白定位的研究結(jié)果一致。例如, 小麥核定位的TaHIPP1蛋白在酵母中過(guò)量表達(dá)明顯增加了細(xì)胞在銅脅迫下的生長(zhǎng)率[19]。Khan等[16]通過(guò)亞細(xì)胞定位證實(shí)了OsHIPP42定位于細(xì)胞核和質(zhì)膜, 它具有與Cd排毒和積累有關(guān)的功能。OsHIPP33定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì), 并在整個(gè)發(fā)育階段的不同器官中表達(dá), 參與了Zn和Fe在根和莖組織之間通過(guò)維管束的長(zhǎng)距離運(yùn)輸[40]。小白菜質(zhì)膜定位蛋白BcHIPP16促進(jìn)了植物對(duì)Cu和Cd的吸收[41]。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)Chr. 3上的s基因最多, 并且在Chr. 3上發(fā)現(xiàn)了一處串聯(lián)基因, 具有串聯(lián)復(fù)制的基因復(fù)制活動(dòng)在基因組重組和擴(kuò)展中可能起著關(guān)鍵作用[42]。在外顯子-內(nèi)含子的數(shù)量上存在差異, 表明基因結(jié)構(gòu)具有多樣性, 這可能導(dǎo)致基因功能的多樣性。

為了解BvHIPPs基因家族成員在鎘脅迫下的表達(dá)特性, 對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的基因表達(dá)水平進(jìn)行了差異顯著性分析, 并發(fā)現(xiàn)所有BvHIPPs基因家族成員的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均受到鎘脅迫不同程度的調(diào)控。qRT-PCR分析基因?qū)︽k脅迫的響應(yīng)發(fā)現(xiàn),在不同時(shí)間處理的表達(dá)量不同, 且主要起正向調(diào)控作用。研究表明, 經(jīng)鎘處理后水稻幼苗中的、和均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì), 證明了基因響應(yīng)水稻幼苗中鎘的脅迫[10]。本研究中各家族成員的表達(dá)既有上調(diào), 又有下調(diào), 這與水稻的HIPPs基因家族在鎘脅迫下的表達(dá)既有上調(diào)又有下調(diào)的結(jié)果一致, 并且基因在水稻中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式, 通過(guò)酵母的互補(bǔ)分析得以證明, 其中,、和的表達(dá)增強(qiáng)了酵母細(xì)胞對(duì)鎘脅迫的耐受性[14]。綜合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR結(jié)果分析, 在鎘處理6 h時(shí),、在甜菜的葉中和根中顯著上調(diào), 這與小麥基因在鎘脅迫下的表達(dá)一致,在鎘的誘導(dǎo)下, 在麥穗的根、莖和葉中表達(dá)上調(diào),的過(guò)表達(dá)可以提高小麥對(duì)鎘的耐受性[22]。在本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,和親緣關(guān)系較近,在受到鎘脅迫后表達(dá)量下調(diào), 這與在受到鎘脅迫后表達(dá)量下調(diào)的表達(dá)一致[43]。

金屬伴侶蛋白的概念來(lái)源于對(duì)細(xì)菌CopZ蛋白和酵母抗氧化蛋白1 (ATX1)的研究, 典型的金屬伴侶蛋白包含一個(gè)重金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HMA)和一個(gè)高度保守的Cys-XX-Cys (X: 任意氨基酸)基序, 用于結(jié)合重金屬[44]。例如, 擬南芥CdI19蛋白定位于質(zhì)膜, 通過(guò)與質(zhì)膜之間的互作關(guān)系, 可防止游離的重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞, 在維持重金屬穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[21]。AtATX1具有銅結(jié)合基序MXCXXC, 可參與細(xì)胞中銅離子的轉(zhuǎn)運(yùn), 在細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。在水稻中的功能是將Cu運(yùn)輸?shù)礁囊号葜? 限制Cu在籽粒中的積累[45]。通過(guò)對(duì)23個(gè)BvHIPPs家族進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析, 發(fā)現(xiàn)所有的家族成員都含有HMA結(jié)構(gòu)域, 這也恰好證明了BvHIPPs作為金屬伴侶蛋白能結(jié)合重金屬的功能。通過(guò)對(duì)BvHIPPs基因家族成員的順式元件功能預(yù)測(cè)可發(fā)現(xiàn), BvHIPPs成員含有響應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育(脫落酸響應(yīng)元件ABRE、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGAE等)、非生物脅迫(低溫響應(yīng)元件LTR、厭氧誘導(dǎo)元件ARE、逆境和防御響應(yīng)元件等)以及MYB等結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的順式作用元件。這些元件大都與重金屬脅迫應(yīng)答相關(guān), 如MYB43可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制HMAs負(fù)向調(diào)控?cái)M南芥的鎘耐受性[46]; 擬南芥過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植株開(kāi)花延遲[11]; 水稻為真菌感染的易感因子, 可以減緩植物對(duì)特定病原體的防御反應(yīng)[47]。這些研究證實(shí)了可廣泛參與到植物的生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和非生物脅迫等響應(yīng)過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法從基因進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和基因表達(dá)模式等多個(gè)方面對(duì)甜菜中鑒定到的23個(gè)基因進(jìn)行了系統(tǒng)的研究, 表明BvHIPPs基因家族均具有HMA結(jié)構(gòu)域和異戊二烯化基序, 成員之間高度同源且在進(jìn)化過(guò)程中非常保守。它們主要在細(xì)胞核以及線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及qRT-PCR分析均表明, BvHIPPs家族成員均受到了鎘脅迫的調(diào)控, 但在不同的時(shí)間及部位的表達(dá)量不同, 推測(cè)BvHIPPs家族成員在甜菜的金屬離子穩(wěn)態(tài)和解毒機(jī)制中可能發(fā)揮的作用不同。綜上可知, BvHIPPs基因家族參與了甜菜的鎘脅迫響應(yīng)調(diào)控, 這為全面系統(tǒng)地研究基因?qū)饘倜{迫的反應(yīng)機(jī)制提供了一定的理論支撐。

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Identification and relative expression profile of HIPPs gene family cadmium stress in sugar beet

ZHAO Xiao-Xin1,2, HUANG Shuo-Qi1,2, TAN Wen-Bo1,2, XING Wang1,2, and LIU Da-Li1,2,*

1National Beet Germplasm Mid-term Bank, Heilongjiang University, Harbin 150080, Heilongjiang, China;2Key Laboratory of Beet Genetics and Breeding / College of Modern Agriculture and Ecological Environment, Heilongjiang University, Harbin 150080, Heilongjiang, China

Cadmium (Cd) ion balance and detoxification regulation are the cores of exploring cadmium tolerance mechanism in sugar beet, and the basis of heavy metal bioremediation using sugar beet. Heavy metal-associated isoprene plant proteins (HIPPs) are a class of multifunctional metal chaperone proteins, which may play a key role in absorption, transport, and compartmentalization of Cd ions. In the transcriptome expression profile of sugar beet responding to cadmium stress,were found to be differentially expressed. Based on the above results, the whole BvHIPPs gene family members in beet genome was identified by bioinformatics method, and their physicochemical properties, evolutionary relationships, gene structure, cis-acting elements, chromosome localization, transcription, and expression characteristics under cadmium stress were analyzed. The results showed that there were 23 BvHIPPs family members in the beet genome, all of which contained HMA domains and isoprenylation motif, and 16 BvHIPPs were predicted to be located in the nucleus. According to-acting element analysis, beet BvHIPPs can participate in a variety of biological and abiotic stress responses. Transcriptomic analysis showed that all 23 BvHIPPs differentially participated in sugar beet in response to Cd, and qRT-PCR analysis verified furtherly the regulatory characteristics of thecorrelated with Cd response.might play an essential role in the adaptation of sugar beet to cadmium stress. The results suggest thatmay play an important role in the process of beet adaptation to cadmium stress, and the results will lay a foundation for the molecular mechanism of beet bioremediation in heavy metal pollution.

sugar beet; HIPPs; cadmium stress; gene family identification; transcriptional expression characteristics

2023-05-24;

2023-06-16.

10.3724/SP.J.1006.2023.34010

通信作者(Corresponding author): 劉大麗, E-mail: daliliu_hlju@163.com

E-mail: 953511214@qq.com

2023-01-13;

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31606229), 黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LH2019C057), 財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(糖料, CARS-170102), 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部項(xiàng)目(19221878, 19211031, 19210911)和黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(UNPYSCT-2020014)資助。

This study was supported by the Youth Program of National Natural Science Foundation of China (31601229), the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (LH2019C057), the China Agriculture Research System of MOF and MARA (Sugar, CARS-170102), the Ministry of Agriculture and Rural Affairs Project (19221878, 19211031, 19210911), and the Innovative Training Plan for Young Talents in Heilongjiang Ordinary Undergraduate Colleges and Universities (UNPYSCT-2020).

URL: https://kns.cnki.net/kcms2/detail/11.1809.S.20230615.1201.002.html

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