賈丁丁, 尹海波, 賈 琳, 王 丹, 賈春雷, 吳 偉, 李博文

(1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院, 遼寧 大連 116000;2.中華人民共和國沈陽海關(guān)沈陽國際旅行衛(wèi)生保健中心, 沈陽 110623)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實,習稱“北五味子”。五味子具有收斂固澀,益氣生津,補腎寧心的功效,用于治療久嗽虛喘,夢遺滑精,遺尿尿頻,久瀉不止,自汗盜汗,津傷口渴,內(nèi)熱消渴,心悸失眠[1]。近年來,因野外生態(tài)變化和人為濫采,野生五味子資源不斷減少,目前,五味子藥材來源主要以栽培為主。

種子種苗的質(zhì)量是保障中藥材品質(zhì)的關(guān)鍵,其分級標準也是藥材規(guī)范化生產(chǎn)的保障[2-3]。目前,五味子種子種苗交易市場較混亂,對五味子種子種苗的定級尚不明確,造成栽培和人力資源的大量浪費。五味子種子種苗分級研究是確保其種子種苗質(zhì)量、提高其藥材質(zhì)量和產(chǎn)量的重要手段,對不同級別的種子種苗進行篩選,優(yōu)選級別較高的種子種苗,促進高質(zhì)量品種的選育,提高藥材安全性和有效性。本研究通過K-均值聚類等分析方法[4-6],對黑龍江、吉林、遼寧三省五味子主產(chǎn)地的種子種苗各指標進行分級,根據(jù)各指標分級結(jié)果優(yōu)選種子種苗,促進中藥材產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展[7]。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)、赤霉素(北京索萊寶科技有限公司)、娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)、濃硫酸95%～98%(錦州古城化學試劑有限公司)。

VD-650型桌上式潔凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),JX-188手提式壓力蒸汽滅菌器(寧波市鎮(zhèn)海金鑫醫(yī)療器械有限公司),PRX-1500B智能人工氣候箱(上海坤誠科學儀器有限公司),SLY-CY液晶自動數(shù)粒機(杭州綠博儀器有限公司),游標卡尺(上海首豐精密儀器有限公司)等。

1.2 種子種苗收集

五味子種子共收集23批次,種苗共收集21批次,產(chǎn)地遍布遼寧、吉林和黑龍江三省,種苗均為一年生種苗,每批不少于100棵,種子每批500 g。種子種苗經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學尹海波教授鑒定為木蘭科五味子屬植物五味子,種子種苗收集信息如表1、表2,圖1。

圖1 五味子種子(a)、種苗(b)實驗樣品

注:a為培養(yǎng)后第5天開始觀察結(jié)果;b～i為每天連續(xù)觀察結(jié)果,i為最終發(fā)芽結(jié)果。

注:a為染色前;b為染色后。

表1 五味子種子信息記錄

表2 五味子種苗信息記錄

1.3 測定方法

參考GB/T 3543.1～3543.7—1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》[8],每批取至少500 g種子送檢。隨機選取種子100粒,3次重復,對種子的外觀及形態(tài)特征進行測量記錄,得種子真實性信息;四分法選取每批50 g,把稱量好的種子置于超凈工作臺上,將種子與雜質(zhì)分離,3次重復,取3次均值得種子凈度;每批種子1 000粒重,3次重復,取3次稱量均值得種子千粒重;稱取每批五味子種子2 g,在130 ℃條件下烘干5 h,直至2次稱重變化在0.003 g以內(nèi),即為烘干結(jié)束,3次重復,取3次測定均值得種子含水量;清水浸透五味子種子每批100粒,在30 ℃的恒溫環(huán)境中暗處理約48 h,用解剖刀沿種子胚中心線將種子縱切為二,使其胚外露,用TTC染色法染色,3次重復,取3次重復均值為種子生活力;挑選潔凈未經(jīng)沙藏的五味子種子150粒,置于40～45 ℃溫水中浸泡后,用濃硫酸(95%～98%)浸泡7 min,致使種子種皮變黑。處理好后將種子用清水沖洗3遍,然后置于500×106的赤霉素中處理24 h,后在發(fā)芽床上放置50粒種子(n=3),置于25 ℃恒溫環(huán)境中,濕度50%,每天自然光照12 h進行培育。

連續(xù)觀察3 d檢查其發(fā)芽情況,無種子發(fā)芽,視為種子發(fā)芽結(jié)束。

取21批各產(chǎn)地種苗100棵,對苗長、莖粗、根長、根粗、芽數(shù)、側(cè)根數(shù)、單株重、每100 g種苗數(shù)等8個指標進行測定,用卷尺測量苗長(從種苗最下端到最上端的長度),游標卡尺測量莖粗(主要莖稈的直徑),利用直尺測量根長(根最頂端到最下端的長度),利用游標卡尺測量根徑(根的中部直徑),芽數(shù)為種苗各分枝存在的芽的數(shù)量,側(cè)根數(shù)為種苗主根旁現(xiàn)存的側(cè)根數(shù)量,單株重為利用電子天平稱取去除雜質(zhì)的單株種苗的重量,每100 g種苗數(shù)為利用電子天平稱取100 g種苗,按比例計算得出的種苗數(shù)。

種子凈度/%=(供檢種子重量-雜質(zhì)總重量)×100%;

發(fā)芽率/%=(發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù))×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS26.0軟件對種子種苗指標進行統(tǒng)計描述與方差分析、相關(guān)性分析、K-均值聚類分析等數(shù)據(jù)處理方法[9]。根據(jù)K-均值聚類結(jié)果按照最低定級原則制定五味子種子種苗質(zhì)量分級標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子種子種苗指標測定結(jié)果

五味子種子呈橢圓狀腎形,表面黃褐色,平滑,有光澤,長3.3～5.8 mm,寬2.8～4.7 mm,厚1.8～3.4 mm,種子大小均一,飽滿度好,種臍位于種子腹側(cè)凹入處,種皮硬而脆;種苗紅褐色或灰褐色,外皮具皺紋,根較細且側(cè)根較多。

對23批五味子種子5種指標進行測定并統(tǒng)計分析,結(jié)果見表3、表5。結(jié)果表明,各批次種子凈度、千粒重、生活力、含水量和發(fā)芽率等5個指標均具有顯著性差異,且F值大小順序依次為:發(fā)芽率、千粒重、含水量、生活力、凈度。對21批五味子種苗8種指標進行測定并進行統(tǒng)計描述與方差分析,結(jié)果見表4、表6。結(jié)果表明,苗長、莖粗、根長、根粗、芽數(shù)、側(cè)根數(shù)、單株重和每100 g種苗數(shù)等8個植株指標均具有顯著性差異,且F值大小順序依次為:莖粗、每100 g種苗數(shù)、苗長、側(cè)根數(shù)、單株重、根長、芽數(shù)、根粗,本實驗所用五味子種子種苗差異性較大,可以作為種苗分級依據(jù)。

表3 各產(chǎn)地五味子種子指標測定結(jié)果

表4 各產(chǎn)地五味子種苗指標

表5 各產(chǎn)地五味子種子信息統(tǒng)計描述與方差分析

表6 各產(chǎn)地五味子種苗信息統(tǒng)計描述與方差分析

2.2 種子種苗分級指標的確定

對不同產(chǎn)地五味子種子種苗各指標數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析,結(jié)果如圖4。五味子種子中千粒重與凈度呈極顯著正相關(guān),與含水量呈顯著正相關(guān)。五味子種苗中苗長與根長、芽數(shù)、側(cè)根數(shù)、單株重呈極顯著正相關(guān),莖粗與根粗呈極顯著正相關(guān),根長與芽數(shù)、單株重呈極顯著正相關(guān),芽數(shù)與側(cè)根數(shù)、單株重呈極顯著正相關(guān),每100 g種苗數(shù)與苗長、根長、芽數(shù)、單株重呈極顯著負相關(guān),側(cè)根數(shù)與根長、單株重呈顯著正相關(guān)。由此可得,五味子種子越重,含水量越高,其種子凈度也越高;五味子種苗苗長越高,根長越長,芽數(shù)、側(cè)根數(shù)越多,單株重越大,每100 g種苗數(shù)越少,而根粗與莖粗則與其他指標無顯著相關(guān)。結(jié)合方差分析可知,采用凈度、千粒重、含水量、生活力及發(fā)芽率等5個指標作為種子分級候選指標;采用苗長、根長、芽數(shù)、單株重、每100 g種苗數(shù)等5個指標作為種苗分級候選指標。

圖4 五味子種子(a)、種苗(b)相關(guān)性熱圖

2.3 五味子種子種苗分級標準制定

對各產(chǎn)地五味子種子的5個指標信息和種苗的8個指標信息進行K-均值聚類分析,分別得到4個聚類中心,結(jié)果如表7、表8。

表7 五味子種子指標聚類中心

表8 五味子種苗指標聚類中心

由方差分析可知,五味子種子各指標中,凈度、千粒重和生活力差異性不顯著,因此,選擇含水量和發(fā)芽率等2個指標作為分級標準首要指標,凈度、千粒重和生活力為分級次要指標;五味子種苗各指標中,莖粗、根粗、側(cè)根數(shù)差異性不顯著,因此,選擇苗長、根長、芽數(shù)、單株重、種苗數(shù)/100g 5個指標作為種苗分級主要指標。見表9～表12。

表9 五味子種子分級指標方差分析

表10 五味子種苗分級指標方差分析

表11 五味子種子最終聚類中心類間距離

表12 五味子種苗最終聚類中心類間距離

在五味子種子聚類中心結(jié)果中,第1類與第2、4類距離較近,與第3類距離較遠。結(jié)合種子質(zhì)量指標信息,以發(fā)芽率、生活力為主要參考指標,可將種子分為3個等級,其中第1類為一級種子,第2、4類為二級種子,第3類為三級種子。種子分級標準見表13。

表13 五味子種子分級標準

在五味子種苗聚類中心結(jié)果中,第1類與第3類距離最近,與第2類次之,與第4類距離最遠。結(jié)合種苗質(zhì)量指標將五味子種苗分為4級,第4類為一級苗指標,第2類為二級苗指標,第3類為三級苗指標,第1類為四級苗指標。種苗分級標準見表14。

表14 五味子種苗分級標準

根據(jù)K-均值聚類結(jié)果,23批五味子種子被分為3個等級,一級種子有3批,占全部樣品的13.04%,二級種苗16批,占全部樣品的69.57%,三級種苗4批,占全部樣品的17.39%;21批五味子種苗被分為4個等級,一級苗有3批,占全部樣品的14.3%;二級苗有6批,占全部種苗的28.6%;三級苗有10批,占全部種苗的47.6%;四級苗有2批,占全部種苗的9.5%。

3 討 論

種子種苗作為中藥材有效性和安全性的重要基礎(chǔ)保障,一直備受關(guān)注。種子種苗規(guī)范的制定是中藥材安全有效應用臨床的前提,目前我國種子種苗標準體系尚不完善,需要不斷更新迭代,為藥用植物資源栽培體系添磚加瓦。目前,五味子種子種苗質(zhì)量良莠不齊,一方面是對五味子種子種苗質(zhì)量的忽視,而另一方面是種子種苗質(zhì)量標準的缺失或長時間未更新[10-11],導致栽培五味子種子種苗成活率和結(jié)果率不高,造成道地藥材五味子產(chǎn)量、質(zhì)量、臨床療效及知名度下降等問題。

本實驗通過收集不同產(chǎn)地23批五味子種子和21批五味子種苗,采用相關(guān)性分析、聚類分析等方法,分別以凈度、千粒重、生活力、含水量和發(fā)芽率等5個指標和苗長、根長、芽數(shù)、單株重、每100 g種苗數(shù)等5個指標為參考確定五味子種子種苗分級標準,種子分為3個等級,其中一級種子標準為凈度≥96%,千粒重>29.08 g,含水量>6.75%,生活力>98.22%,發(fā)芽率>81.33%;二級種子標準為凈度≥96%,千粒重25.89～29.08 g,含水量6.52%～6.75%,生活力72.55%～98.22%,發(fā)芽率11%～81.33%;三級種子(不合格種子)標準為凈度<96%,千粒重<25.89 g,含水量<6.52%,生活力<72.55%,發(fā)芽率<11%。種苗分為4個等級,其中一級種苗標準為苗長>58.177 cm,根長>22.047 cm,芽數(shù)>17個,單株重>7.873 g,每100 g種苗數(shù)<15棵;二級種苗標準為苗長>34.803～≤58.177 cm,根長>15.935～≤22.047 cm,芽數(shù)>12～≤17個,單株重>3.055～≤7.873 g,每100 g種苗數(shù)>15～≤31棵;三級種苗標準為苗長26.453～34.803 cm,根長14.715～15.935 cm,芽數(shù)10～12個,單株重1.442～3.055 g,每100 g種苗數(shù) >31～≤70棵;四級種苗(不合格種苗)標準為苗長<26.453 cm,根長<14.715 cm,芽數(shù)<10個,單株重<1.442 g,每100 g種苗數(shù)>70棵。如一批五味子種子種苗中當不合格數(shù)≤5%時,判該批合格,當不合格數(shù) > 5%時,判該批不合格,則劃為下一級。