陳天青, 李紅艷, 王 偉, 隋建樞, 羅永露, 吳文強(qiáng), 程 斌, 何慶才

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所, 貴陽 550006; 2.貴州醫(yī)科大學(xué), 貴陽 550025)

條銹病(Stripe rust,SR)和赤霉病(Fusarium head blight,FHB)分別是由條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)和禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)引起的小麥病害[1-2]。條銹病會破壞葉片的表皮組織,使植株葉面積指數(shù)減少,光合作用降低,導(dǎo)致小麥生長發(fā)育受阻、產(chǎn)量降低[3]。赤霉病主要為害穗部,影響籽粒儲藏物質(zhì)的合成,籽粒被侵染后產(chǎn)生的真菌毒素會嚴(yán)重危害人畜安全[4]。貴州省因氣候潮濕多雨,一直是小麥多種病害(條銹病、白粉病、葉銹病)重發(fā)區(qū),近年來小麥赤霉病由我國長江中下游冬麥區(qū)、華南冬麥區(qū)西擴(kuò),已上升為貴州省小麥的主要病害[5]。

抗病基因的發(fā)掘和抗病育種是防治小麥病害的有效方法。國內(nèi)外眾多學(xué)者長期從事于抗病基因發(fā)掘工作。目前,國際上已正式命名了83個抗條銹病基因(Yr1～Yr83)[6],7個赤霉病抗病基因(Fhb1～Fhb7)[7-12]。

由于許多條銹病抗病基因具有小種?；?隨著新的條銹菌強(qiáng)毒性小種條中34的出現(xiàn),很多已知的條銹病抗病基因的抗性正在喪失[13]。貴協(xié)2號是貴州大學(xué)張慶勤教授通過野生二粒小麥與光稃野燕麥遠(yuǎn)緣雜交、普通小麥回交等方法選育而成的小麥新品系,經(jīng)田間成株期抗性鑒定對條銹病免疫至高抗水平,目前抗病基因雖不明確,但仍作為貴州主要的小麥條銹病抗源使用。

小麥赤霉病抗性是多基因控制的數(shù)量性狀,容易受環(huán)境的影響,目前已命名的主效基因中,Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5為報道較多、且較為穩(wěn)定的主效基因,而Fhb1又是其中效應(yīng)最大、抗性最穩(wěn)定、并在國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的抗病基因[14]。目前,貴州省對赤霉病的研究僅限于材料的抗性鑒定和篩選,鮮有赤霉病抗性改良和聚合育種的報道。NMAS22是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)馬正強(qiáng)教授團(tuán)隊以山東背景材料PH691為受體,赤霉病抗病品種望水白為供體,經(jīng)雜交、不斷與PH691回交,分子標(biāo)記輔助選育而成的新品系,對赤霉病表現(xiàn)為高抗,擺脫了望水白的不利農(nóng)藝性狀,且攜帶有Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5等4個赤霉病抗病基因。

本研究將條銹病新抗源貴協(xié)2號和赤霉病新抗源NMAS22雜交,并構(gòu)建了F2代臨時分離群體,采用田間鑒定與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法,篩選條銹病與赤霉病兼抗的植株,為新種質(zhì)創(chuàng)制提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥材料為貴協(xié)2號、NMAS22及以其構(gòu)建的F2代臨時群體;禾谷鐮刀菌菌株(PH-1、F0609、F0980)由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所陳文博士惠贈。

1.2 試驗設(shè)計

將貴協(xié)2號和NMAS22雜交獲得的F2代的籽粒播種,試驗采用單行區(qū),行長2 m,行距0.3 m,點播,每5 cm播種1粒,每行播種40粒,播種20行。在小區(qū)的四周種植條銹病誘發(fā)材料SY95-71。

1.3 小麥條銹病田間鑒定

采用自然誘發(fā)鑒定,在自然發(fā)病的情況下對F2代群體進(jìn)行成株期調(diào)查,待SY95-71充分發(fā)病后,觀察記錄群體植株對條銹病的反應(yīng)型?？箺l銹性評價分級參考0～4級判定標(biāo)準(zhǔn)[15]。

1.4 小麥赤霉病田間鑒定

在小麥揚(yáng)花初期,采用單花滴注法接種小麥赤霉病致病菌。將禾谷鐮刀菌菌株分生孢子液(105個/mL)滴入中選單株麥穗中部小穗的單側(cè)小花中。小麥黃熟前(接種后約21 d)調(diào)查接種穗的病小穗率和病害發(fā)生等級,計算平均嚴(yán)重度[16]。根據(jù)劃分標(biāo)準(zhǔn)劃分為免疫(I)、高抗(HR)、中抗(MR)、中感(MS)、高感(HS)[17]。

平均嚴(yán)重度(S)=∑(各病級穗數(shù)×相應(yīng)病級數(shù))/總調(diào)查總穗數(shù)。

1.5 分子標(biāo)記檢測

取具有條銹病抗性植株的葉片裝入離心管,經(jīng)液氮冷凍后用植物組織研磨儀研磨成粉末,CTAB法[18]提取DNA。采用與Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5連鎖的標(biāo)記(表1)對中選植株進(jìn)行赤霉病抗病基因分子檢測。PCR擴(kuò)增采用10 μL體系,即2×TaqMaster Mix 5 μL,5 μmol/L正反向引物各0.2 μL,DNA模板(35 ng/μL) 2 μL,加ddH2O 2.6 μL補(bǔ)足10 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,退火1 min(退火溫度根據(jù)引物設(shè)置),72 ℃延伸2 min,共35個循環(huán),72 ℃終延伸10 min,4 ℃保存。

表1 抗赤霉病基因檢測標(biāo)記信息

采用1.5%瓊脂糖凝膠或8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。把F2代群體的帶型與親本NMAS22、貴協(xié)2號的帶型相比較,與NMAS22帶型相同記錄為R,與貴協(xié)2號帶型相同記錄為S,雜合型記錄為H,未有效擴(kuò)增記為N。對于單標(biāo)記檢測的基因(Fhb2和Fhb4),帶型為R、H的單株,認(rèn)為其攜帶有抗病基因;對于雙標(biāo)記檢測的抗病基因(Fhb1和Fhb5),兩個標(biāo)記的帶型為R/R、H/H或R/H的單株,認(rèn)為其攜帶有抗病基因,其中R/R為基因純合型,H/H和R/H為基因雜合型。

數(shù)據(jù)分析方法:一般統(tǒng)計分析采用Excel2013軟件進(jìn)行,赤霉病抗病基因型與田間抗性的相關(guān)分析采用SPSS version20軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥群體赤霉病與條銹病田間抗性表現(xiàn)

采用自然誘發(fā)法對732個NMAS22×貴協(xié)2號F2代單株進(jìn)行條銹病抗性鑒定,結(jié)果顯示,在該群體中有349株表現(xiàn)為抗病(0～2級),有383株表現(xiàn)為感病(3～4級)。

采用單花滴注法完成了對F2代群體中685個單株的赤霉病抗性鑒定,結(jié)果表明,332個植株表現(xiàn)為高抗赤霉病,占群體總數(shù)的48.4%,135個植株表現(xiàn)為中抗赤霉病,占群體總數(shù)的19.6%,46個植株表現(xiàn)為中感赤霉病,占群體總數(shù)的6.7%,172個植株表現(xiàn)為高感赤霉病,占群體總數(shù)的25.1%。

2.2 赤霉病抗病基因的分子標(biāo)記檢測及遺傳分析

用與抗赤霉病基因Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5相關(guān)的6對分子標(biāo)記,對挑選出的具有條銹病抗性的植株樣本進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖1和表2所示。經(jīng)對雙標(biāo)記檢測基因的合并分析,在349份被檢測植株中,檢測到攜帶Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5的單株分別為201,245,248,194株,占被檢測植株的57.6%,70.2%,71.1%,55.6%,其中純合基因型植株分別為48,104,92,57株,占被檢測植株的13.8%,29.8%,26.4%,16.3%。

注:紅色箭頭指示抗病基因條帶;M為Marker;N為NMAS22;G為貴協(xié)2號;1～24號為F2代群體的部分單株。

表2 抗赤霉病分子標(biāo)記檢測結(jié)果

對以上標(biāo)記不同基因型統(tǒng)計結(jié)果分別進(jìn)行分離比的適合度測驗,結(jié)果(表3)顯示,Fhb1基因位點的TaHRC標(biāo)記和Xgwm533標(biāo)記、Fhb2基因位點的WGRB682標(biāo)記、Fhb4基因位點的MAG9436標(biāo)記、Fhb5基因位點的WGRB02659標(biāo)記和WGRB0850標(biāo)記的卡方值分別為3.85,2.66,5.57,2.50,5.65,2.36,均小于p=0.05水平的卡方值,F2代群體各單株基因型符合預(yù)期的1∶2∶1的分離比,表明其結(jié)果遵循孟德爾遺傳定律,即在F2代群體中對條銹病抗性單株的篩選不會引發(fā)Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因位點偏分離。

表3 卡方測驗分析結(jié)果

2.3 赤霉病抗病基因組合類型分析

由表4可見,三基因組合類型的單株最多,占被檢測單株的40.1%,其次為四基因組合和雙基因組合,分別占被檢測單株的24.4%和22.6%,而只攜帶1個抗病基因或不攜帶抗病基因的單株較少,僅占被檢測單株的10.6%和2.3%。

表4 赤霉病抗病基因組合分析

2.4 抗性相關(guān)性分析

將田間性狀鑒定結(jié)果與分子標(biāo)記檢測結(jié)果做相關(guān)性分析,結(jié)果(表5)顯示,Fhb1基因位點的TaHRC標(biāo)記和Xgwm533標(biāo)記與病小穗率相關(guān)性為-0.261與-0.180,呈顯著負(fù)相關(guān),Fhb2、Fhb4、Fhb5基因位點標(biāo)記與病小穗率相關(guān)性均不顯著。

表5 相關(guān)性分析結(jié)果

2.5 四基因組合中純合基因數(shù)量分析

由表6可見,85份四基因組合型單株中,有25份攜帶1個純合的抗赤霉病基因,37份攜帶2個純合的抗赤霉病基因,20份攜帶3個純合的抗赤霉病基因,僅3份攜帶4個純合的抗赤霉病基因。

表6 四基因組合類型中純合基因數(shù)量

4 討 論

小麥赤霉病和小麥條銹病的危害逐年加重,除氣候和環(huán)境變化影響外,抗病品種缺乏也是重要原因之一。

小麥赤霉病抗性是由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀,其抗性鑒定結(jié)果易受到環(huán)境影響,田間表型鑒定效果差,不利于育種后代的選擇[19-20]。要篩選抗赤霉病的育種材料,需要建立適宜的抗性鑒定技術(shù)和創(chuàng)造小麥發(fā)病有利條件,如氣候、溫度、濕度等。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可以從基因型方面進(jìn)行直接選擇,具有不受外界環(huán)境影響的優(yōu)點,便于對表型鑒定困難、遺傳力低、隱性等性狀進(jìn)行選擇,可使品種選育進(jìn)程效率增加,目前已在多種作物的性狀改良上得到成功應(yīng)用[21-23]。

目前,很多與赤霉病抗性有關(guān)的QTL被定位,但是只有少部分QTL位點能發(fā)揮較強(qiáng)的效果,如Fhb1,絕大多數(shù)的QTL位點效應(yīng)比較小,容易受環(huán)境和遺傳背景的影響[20],阻礙了分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在赤霉病抗病育種上廣泛應(yīng)用。目前,正式命名的7個抗病基因(Fhb1～Fhb7)中,Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5來自于普通小麥,分別被定位在普通小麥的3BS、6BS、4B、5A 染色體上[7-11]。江蘇溧陽小麥地方品種望水白高抗赤霉病,且同時攜帶了Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)馬正強(qiáng)教授團(tuán)隊已經(jīng)開發(fā)了這4個基因位點的相關(guān)標(biāo)記,并轉(zhuǎn)育了攜帶4個基因的育種材料NMAS22。

本研究利用條銹病新抗源貴協(xié)2號與NMAS22雜交,獲得F2分離群體,并對群體進(jìn)行條銹病自然鑒定和赤霉病接種鑒定,獲得了349份具有條銹病抗性的植株、467份具有赤霉病抗性的植株。利用Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5等4個基因位點標(biāo)記對349份條銹病抗病株進(jìn)行檢測,最終篩選出85株攜帶4個抗赤霉病基因(基因型純合或雜合)的單株。

抗侵染、抗擴(kuò)展均是小麥對赤霉病抗性的表現(xiàn)形式,本研究中的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,Fhb1基因位點上的兩對標(biāo)記均與病小穗率呈極顯著相關(guān),而Fhb2、Fhb4、Fhb5這3個基因位點與病小穗率的相關(guān)性較低。Fhb1是公認(rèn)的效應(yīng)值高、抗性比較穩(wěn)定、受遺傳背景影響較小的抗病基因,在本研究中得到了進(jìn)一步的證明,可廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種,而Fhb2對赤霉病抗擴(kuò)展效應(yīng)值低于Fhb1,在本研究中可能受到遺傳背景和環(huán)境的影響,表現(xiàn)為與赤霉病抗性相關(guān)性不大,故Fhb2不宜作為單一利用的基因應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種。Fhb4和Fhb5在本研究中表現(xiàn)為與赤霉病抗性不相關(guān)。Fhb4和Fhb5是抗侵染類型的基因[24],本課題采用單花滴注接種法進(jìn)行赤霉病抗性鑒定,單花滴注接種鑒定反映的是植株被侵染后的抗擴(kuò)展能力,卻無法反映植株的抗侵染能力[19]。Fhb4和Fhb5在降低實際生產(chǎn)中小麥品種赤霉病發(fā)病率上具有重要意義,今后需同樣重視該類型基因的應(yīng)用。本研究已篩選出在Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5等4個基因位點均攜帶赤霉病抗性基因的植株,為今后選育聚合4個抗病基因品種奠定了基礎(chǔ),但這些植株中有些基因位點基因型為雜合型,后續(xù)研究需進(jìn)一步對中選單株后代進(jìn)行赤霉病抗病基因的追蹤與分析。