張向歌, 宋萬獻(xiàn), 朱雅婧, 于美琴, 宋雯栩, 王樹峰, 李居政, 王會(huì)偉

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 鄭州 450002)

油莎豆(CyperusesculentusL.)又名虎堅(jiān)果、油莎草和鐵荸薺等,是一年生塊莖類植物,其地下莖塊呈圓形或橢圓形豆?fàn)?可稱之為莖豆,富含油脂、淀粉、糖、蛋白質(zhì)、膳食纖維以及多種維生素,應(yīng)用于糧、油、牧、飼等多個(gè)方面,開發(fā)潛力巨大[1-3]。目前,油莎豆主要依賴于莖豆進(jìn)行無性繁殖,其莖豆即為油莎豆繁育的種源。因而,保證油莎豆莖豆發(fā)芽率對(duì)油莎豆大面積推廣種植十分關(guān)鍵,開展油莎豆莖豆休眠與萌發(fā)相關(guān)的研究具有重要意義。

在種子的休眠與萌發(fā)過程中,植物內(nèi)源激素起著非常重要的調(diào)控作用[4]。目前,內(nèi)源激素脫落酸(ABA)和赤霉素(GAs)在種子休眠與萌發(fā)中的作用得到充分研究[5-6]。ABA和GAs作為主要的內(nèi)源調(diào)控因子,以拮抗的方式調(diào)控種子的休眠和萌發(fā);其中,ABA促進(jìn)種子休眠并抑制萌發(fā),而GAs則解除種子休眠并觸發(fā)萌發(fā)[7-8]。此外,近年來很多研究發(fā)現(xiàn),其他內(nèi)源激素如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、乙烯等對(duì)植物種子休眠與萌發(fā)均至關(guān)重要[9-11]。同樣,在無性繁殖植物中(如馬鈴薯、山藥等),其塊莖的休眠與萌發(fā)也受到各種內(nèi)源激素的調(diào)控[12-13]。植物種子或莖豆從休眠到萌發(fā)的轉(zhuǎn)變過程不只是單一激素影響的結(jié)果,而與多種激素的共同作用密切相關(guān)。

種子萌發(fā)是指種子從吸脹作用開始的一系列有序的生理過程和形態(tài)發(fā)生過程。吸脹是種子萌發(fā)過程中極其重要的階段,隨著種子充分吸水,休眠性逐漸解除,其內(nèi)源激素的含量也隨之呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化[14-15]。了解油莎豆莖豆在充分吸水前后內(nèi)源激素含量的變化規(guī)律,有助于提高對(duì)油莎豆莖豆休眠與萌發(fā)的認(rèn)識(shí)。本研究對(duì)油莎豆莖豆萌發(fā)過程中干莖豆、吸脹莖豆、初發(fā)芽莖豆進(jìn)行內(nèi)源激素GAs(GA1、GA3和GA4)、ABA、IAA、玉米素核苷(ZR)、水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)含量的測(cè)定,以明確油莎豆莖豆萌發(fā)過程中激素含量的變化規(guī)律,為油莎豆莖豆休眠與萌發(fā)調(diào)控機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為河南省油莎豆認(rèn)定品種(2020年):圓粒型豫油莎2號(hào),由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所選育。

1.2 萌發(fā)試驗(yàn)

選取大小均勻一致的莖豆,用10%次氯酸鈉溶液消毒5 min,放入無菌水中進(jìn)行浸種(3 d),每天更換一次無菌水。3 d后將吸脹的莖豆轉(zhuǎn)移至沙土育苗盤中進(jìn)行發(fā)芽,設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)100粒,每天噴灑一次足量的無菌水。觀察莖豆萌發(fā)情況,統(tǒng)計(jì)莖豆發(fā)芽率。以上試驗(yàn)均于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人工氣候室進(jìn)行,培養(yǎng)條件為光照14 h,30 ℃;黑暗10 h,28 ℃。

1.3 內(nèi)源激素含量測(cè)定

選取干莖豆、浸種3 d莖豆、初發(fā)芽莖豆(芽長(zhǎng)約0.5 cm),以芽眼為中心切取莖豆塊(約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm),設(shè)置3個(gè)重復(fù),利用高效液相色譜法分別檢測(cè)以上各樣品中GAs、ABA、IAA、ZR、SA及JA等內(nèi)源激素的含量。

內(nèi)源激素的提取和純化參照相關(guān)研究并適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整[16-17]。將樣品在液氮中研磨成粉末后準(zhǔn)確稱取0.2 g(精確至0.001 g)于10 mL離心管中,加入2 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的80%(體積比)甲醇提取液(含0.5%甲酸),超聲萃取30 min,靜止過夜;在4 ℃條件下,12 000 r/min離心15 min,吸取上清液;再向殘?jiān)屑尤? mL甲醇提取液,超聲萃取30 min,重復(fù)提取2次,合并3次上清液;在38 ℃恒溫水浴中旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)至水相,置-20 ℃冰箱中冷凍30 min;隨后取出解凍,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清液于凈化管,劇烈振蕩30 s,4 000 r/min離心5 min,取上清液,用氮吹儀濃縮至干燥,加入1.0 mL乙腈溶液復(fù)溶,超聲30 s,0.22 μm微孔濾膜過濾,濾液用于高效液相色譜儀檢測(cè)。以1%甲酸-甲醇為流動(dòng)相溶劑系統(tǒng),設(shè)定上樣量為10 μL,流速為0.5 mL/min,柱溫為30 ℃,依照梯度洗脫程序(表1)進(jìn)行以上內(nèi)源激素含量的測(cè)定。

表1 高效液相色譜梯度洗脫程序

1.4 外源激素處理

依據(jù)內(nèi)源激素含量測(cè)定結(jié)果,選擇一些油莎豆莖豆萌發(fā)過程中出現(xiàn)明顯變化的激素,進(jìn)行外源激素處理,以檢驗(yàn)其對(duì)莖豆萌發(fā)的影響。將莖豆分別放入不同外源激素及對(duì)照(水)處理中浸種3 d,激素濃度參照萌發(fā)過程中最高檢測(cè)含量,每天更換一次相應(yīng)的處理溶液;3 d后,將吸脹的莖豆轉(zhuǎn)移至沙土育苗盤中進(jìn)行發(fā)芽,每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)100粒,從莖豆發(fā)芽破土開始,每天觀察各處理中莖豆發(fā)芽情況,統(tǒng)計(jì)莖豆發(fā)芽個(gè)數(shù)并計(jì)算發(fā)芽率。

發(fā)芽率/%=(發(fā)芽個(gè)數(shù)/總莖豆數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆莖豆萌發(fā)觀察及發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)分析

油莎豆干莖豆浸種3 d后,莖豆充分吸水膨脹。將吸脹的莖豆放入沙土培養(yǎng)3 d后,莖豆開始逐漸發(fā)芽;沙土培養(yǎng)7 d后,幾乎所有莖豆發(fā)芽完成,而發(fā)芽較早的莖豆產(chǎn)生許多根系,葉片即將展開(圖1A)。通過統(tǒng)計(jì)分析,沙培7 d時(shí)莖豆的發(fā)芽率高達(dá)98.33%(圖1B),表明豫油莎2號(hào)莖豆芽點(diǎn)的活力較高,適合用于油莎豆莖豆萌發(fā)過程中內(nèi)源激素含量的變化分析。

圖1 油莎豆莖豆萌發(fā)情況

2.2 內(nèi)源激素GAs和ABA含量變化分析

在植物中,最常見的有生物活性的GAs是GA1、GA3和GA4。油莎豆莖豆萌發(fā)過程中(干莖豆-浸種3 d莖豆-初發(fā)芽莖豆)內(nèi)源激素GA1、GA3和GA4的含量均出現(xiàn)了明顯變化,其中,GA1和GA4呈現(xiàn)逐漸上升,而GA3呈先上升后下降的變化趨勢(shì)(圖2)。在干莖豆中,GAs的含量均較低,GA1、GA3、GA4的含量分別為11.84 ng/g,3.87 ng/g,2.34 ng/g;在浸種3 d莖豆中,GAs的含量明顯上升,尤其是GA3的含量急劇上升至564.31 ng/g(約上升245倍);在初發(fā)芽莖豆中,GA1的含量進(jìn)一步小幅度上升,而GA4的含量大幅度上升,達(dá)到169.70 ng/g;相反,GA3的含量急劇下降(圖2),表明GAs(尤其是GA3)的含量與油莎豆莖豆萌發(fā)呈密切正相關(guān),而GA4可能在發(fā)芽后的生理變化中發(fā)揮著重要作用。相比之下,ABA的含量在休眠干莖豆中較高(364.59 ng/g),浸種3 d后急劇下降(11.72 ng/g),而在初發(fā)芽莖豆中又小幅度上升,即在莖豆萌發(fā)過程中呈先降后升的變化趨勢(shì)(圖2),與GA3恰好相反,表明ABA和GA3拮抗調(diào)控油莎豆莖豆的休眠和萌發(fā)進(jìn)程。

圖2 油莎豆莖豆萌發(fā)過程中內(nèi)源激素GAs和ABA含量的變化

2.3 內(nèi)源激素IAA、ZR、SA和JA含量變化分析

IAA、ZR、SA和JA均是植物體內(nèi)普遍存在的內(nèi)源激素,參與多種生理過程調(diào)控。在油莎豆莖豆萌發(fā)過程中,IAA和JA的含量均呈先降后升的變化趨勢(shì)(圖3),與ABA的含量相似,在休眠的干莖豆中處于較高水平(分別為208.41 ng/g和332.40 ng/g),吸脹后急劇下降,莖豆解除休眠而開啟萌發(fā)進(jìn)程;相反,ZR的含量則呈先急劇上升而后下降的趨勢(shì)(圖3),與GA3的一致,在干莖豆吸脹后達(dá)高水平狀態(tài)(218.04 ng/g),促進(jìn)萌發(fā)進(jìn)程;而SA的含量雖然呈逐漸下降的變化趨勢(shì),但整體變化幅度較小且整體水平較低(圖3),可能不參與油莎豆莖豆萌發(fā)的調(diào)控。

圖3 油莎豆莖豆萌發(fā)過程中內(nèi)源激素IAA、ZR、SA和JA含量的變化

2.4 外源激素處理對(duì)油莎豆莖豆萌發(fā)的影響

由上述分析可知,在油莎豆莖豆萌發(fā)過程中,從干莖豆到浸種3 d莖豆,GA3、ABA、IAA、ZR和JA的含量出現(xiàn)急劇變化。設(shè)置此5種激素濃度,GA3(564.31 ng/g)、ABA(364.59 ng/g)、IAA(208.41 ng/g)、ZR(218.04 ng/g)、JA(332.40 ng/g),對(duì)豫油莎2號(hào)莖豆進(jìn)行外源激素處理,以檢驗(yàn)其對(duì)莖豆萌發(fā)的影響。沙培4 d時(shí),部分莖豆芽開始破土,ck處理?xiàng)l件下莖豆的發(fā)芽率為30.33%;相比之下,GA3和ZR處理?xiàng)l件下其發(fā)芽率增加,分別為41.33%和35.67%;而ABA、IAA和JA處理?xiàng)l件下其發(fā)芽率降低,分別為12.67%和16.67%(圖4)。同樣,沙培5 d時(shí),與ck相比,GA3和ZR處理?xiàng)l件下發(fā)芽率增加而ABA、IAA和JA處理?xiàng)l件下發(fā)芽率降低(圖4)。沙培6 d時(shí),GA3、ZR處理?xiàng)l件下所有莖豆發(fā)芽完成,發(fā)芽率達(dá)100%,ck達(dá)92.33%,而ABA、IAA和JA處理?xiàng)l件下莖豆發(fā)芽率分別為79.33%和80.00%(圖4)。由此表明,GA3和ZR能夠加快油莎豆莖豆的萌發(fā)速度,具有促進(jìn)作用;而ABA、IAA和JA則相反,具有抑制作用。

圖4 外源激素處理下油莎豆莖豆發(fā)芽率的變化

3 結(jié)論與討論

植物種子或塊莖經(jīng)過吸脹作用后,內(nèi)源激素含量呈不同的變化趨勢(shì),協(xié)同調(diào)控種子或塊莖的萌發(fā)與生長(zhǎng)。大量研究表明,ABA和GAs是調(diào)控休眠與萌發(fā)的主導(dǎo)內(nèi)源激素[5-8]。本研究發(fā)現(xiàn),油莎豆干莖豆中ABA的含量較高,而GAs的含量較低;隨著莖豆充分吸水,ABA的含量急劇下降,而GA3的含量急劇上升;隨后,莖豆逐漸開始發(fā)芽,在初發(fā)芽莖豆中,ABA的含量出現(xiàn)小幅度上升,GA3的含量出現(xiàn)下降?？梢钥闯?在油莎豆莖豆萌發(fā)過程中ABA和GA3出現(xiàn)了相反的變化趨勢(shì),而且ABA含量的下降和GA3含量的上升促進(jìn)了莖豆萌發(fā)。同時(shí),外源激素處理結(jié)果顯示,GA3能夠加快油莎豆莖豆的萌發(fā)速度,而ABA則恰好相反。因此,與眾多研究一致,ABA和GA3以拮抗的方式分別抑制和促進(jìn)油莎豆莖豆的萌發(fā)。另外,與GA3相比,GA1和GA4的含量同樣在油莎豆莖豆萌發(fā)過程中出現(xiàn)上升的趨勢(shì),但GA1在干莖豆中的含量相對(duì)較高且在整個(gè)過程中呈現(xiàn)小幅度的變化,可能主要作用是維持莖豆的生命活力;而GA4在初發(fā)芽莖豆中的含量急劇上升,可能主要參與莖豆發(fā)芽后的生理變化調(diào)控。

本研究中,除了ABA和GAs之外,IAA、ZR、SA、JA含量也出現(xiàn)了變化。其中,IAA和JA含量的變化與ABA的一致,呈先降低后上升的趨勢(shì)。有研究發(fā)現(xiàn),高濃度的IAA對(duì)種子的萌發(fā)具有抑制作用[18-20],而JA通過干擾過氧化酶的β氧化過程來抑制種子萌發(fā)[21-22]。另外,Liu等[23]發(fā)現(xiàn),IAA通過激活A(yù)BA信號(hào)途徑促進(jìn)擬南芥種子休眠而抑制萌發(fā);Wang等[24]發(fā)現(xiàn),ABA通過促進(jìn)JA的生物合成來協(xié)同抑制水稻種子萌發(fā)。因而,可以看出IAA、JA和ABA一起協(xié)同抑制油莎豆莖豆的萌發(fā)。ZR是植物體內(nèi)天然存在活性最強(qiáng)的細(xì)胞分裂素,能促進(jìn)植物細(xì)胞分裂,保持細(xì)胞活力。Wang等[25]發(fā)現(xiàn),細(xì)胞分裂素能夠下調(diào)ABA信號(hào)途徑中ABI5因子的基因表達(dá),減弱ABA的抑制作用,從而使GA能夠促進(jìn)擬南芥種子的萌發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn),ZR含量的變化與GA3的一致,呈先上升后降低的趨勢(shì),表明ZR和GA3一起協(xié)同促進(jìn)油莎豆莖豆的萌發(fā)。另外,SA是一種調(diào)節(jié)植物滲透能力的應(yīng)激性激素,可以誘導(dǎo)植物抵抗生物和非生物脅迫[26-27]。大量研究發(fā)現(xiàn),SA對(duì)鹽脅迫條件下草本植物種子萌發(fā)具有一定促進(jìn)作用[28]。本研究中,SA含量較小,并且在整個(gè)莖豆萌發(fā)過程中出現(xiàn)小幅度下降的趨勢(shì),表明SA對(duì)莖豆萌發(fā)過程影響較小。因而,在正常條件下,SA可能沒有參與萌發(fā)調(diào)控;而在一些脅迫條件下,SA可能被大量誘導(dǎo)合成,進(jìn)而促進(jìn)植物種子或塊莖的萌發(fā)。

綜上所述,油莎豆莖豆的萌發(fā)主要是ABA、GA3、IAA、ZR、JA等多種激素共同調(diào)控的結(jié)果,其中IAA、JA和ABA可以被稱為萌發(fā)抑制類激素,協(xié)同抑制莖豆萌發(fā);而GA3和ZR可以被稱為萌發(fā)促進(jìn)類激素,協(xié)同促進(jìn)莖豆萌發(fā)。兩類激素之間的動(dòng)態(tài)平衡,決定了莖豆的休眠與萌發(fā),進(jìn)一步深入探討各種激素之間的具體協(xié)同途徑,將有助于油莎豆莖豆休眠與萌發(fā)的調(diào)控機(jī)制解析。