劉延 劉青山 何大為

1. 海軍軍醫(yī)大學(xué),上海 200433

2. 上海長(zhǎng)海醫(yī)院脊柱外科,上海 200433

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是我國(guó)一種常見(jiàn)的全身性骨骼疾病,多發(fā)生在老年人,尤其好發(fā)于絕經(jīng)后女性[1]。其最主要的發(fā)病機(jī)制是由于各種原因?qū)е鹿侵厮馨l(fā)生失調(diào),介導(dǎo)骨形成的成骨細(xì)胞和介導(dǎo)骨吸收的破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破,從而導(dǎo)致骨質(zhì)流失過(guò)多以及骨組織微結(jié)構(gòu)被破壞。并且這種疾病具有高度的遺傳性,通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)確定了數(shù)百個(gè)易感位點(diǎn)[2-3]。然而,對(duì)具體的致病基因以及后續(xù)的分子機(jī)制仍然缺少完整的認(rèn)知,目前的研究認(rèn)為骨重塑過(guò)程中的OPG-RANK-RANKL信號(hào)通路是維持骨代謝動(dòng)態(tài)平衡的主要調(diào)控路徑,而當(dāng)其介導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化出現(xiàn)異常,會(huì)直接導(dǎo)致骨密度的下降[4]。

泛素化屬于蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要修飾手段,通過(guò)泛素激活酶(ubiquitin- activating enzyme,E1 )、泛素結(jié)合酶 (ubiquitin-conjugating enzymes,E2) 和泛素連接酶 (ubiquitin ligases,E3)的協(xié)同作用,將泛素蛋白或泛素鏈與底物蛋白以共價(jià)鍵的形式結(jié)合[5]。其中泛素連接酶的主要功能是將泛素轉(zhuǎn)移到其所識(shí)別的特異性底物蛋白上,同時(shí)又根據(jù)其與底物蛋白作用的結(jié)構(gòu)和機(jī)制的不同分為HECT結(jié)構(gòu)域家族、RING結(jié)構(gòu)域家族、U-box結(jié)構(gòu)域家族3種類(lèi)型。NEDD4泛素連接酶家族屬于其中的HECT家族,包含Nedd4/4 l、Wwp1/2、Smurf1/2、NEDL1/2和itch共9個(gè)成員[6]。近年來(lái),隨著對(duì)泛素化過(guò)程以及泛素連接酶研究的深入,越來(lái)越多的證據(jù)表明泛素連接酶在骨重塑過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)作用[7]。本文擬對(duì)NEDD4泛素連接酶家族成員對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響進(jìn)行綜述。

1 泛素連接酶Smurf1

Smurf1是與骨重塑最相關(guān)也是研究最多的泛素連接酶,其主要在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用,也是成骨細(xì)胞分化和骨量積累的主要負(fù)性調(diào)控因子[8]。在成骨細(xì)胞前體中過(guò)表達(dá)Smurf1基因會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化受到抑制,而在動(dòng)物模型中分別過(guò)表達(dá)或者敲除Smurf1基因也都出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的骨質(zhì)疏松癥以及骨硬化癥的表型[9-10]。近期一例因Smurf1基因異常復(fù)制所致的兒童骨質(zhì)疏松癥的病例報(bào)告也體現(xiàn)了Smurf1在人體內(nèi)對(duì)于成骨細(xì)胞的抑制作用[11]。

Smurf1主要通過(guò)兩種途徑抑制成骨細(xì)胞的分化。首先其能夠泛素化降解BMP與受體結(jié)合后激活的Smad1/5/8,從而阻斷成骨細(xì)胞發(fā)育所必須的BMP信號(hào)通路。其次Smurf1還能降解促進(jìn)成骨細(xì)胞活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2,從而導(dǎo)致成骨細(xì)胞的分化、活性以及對(duì)BMP的反應(yīng)受到抑制(圖1)[9,12]。對(duì)于年齡相關(guān)性的老年骨質(zhì)疏松患者進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Smurf1基因表達(dá)量沒(méi)有變化,但Smurf1的活性出現(xiàn)異常上升以及BMP-2水平的下降[9]。據(jù)此進(jìn)行分組研究并建立小鼠模型,在加入靶向成骨細(xì)胞的 (DSS)6以及Smurf1的抑制劑查耳酮衍生物(chalcone derivative)的復(fù)合物 (DSS)6-chalcone derivative后,能夠促進(jìn)年齡相關(guān)的骨質(zhì)疏松小鼠模型的全身骨形成,這對(duì)于藥物治療年齡相關(guān)性的骨質(zhì)疏松癥患者具有重要的指導(dǎo)意義[9]。單純的給予促進(jìn)骨形成的藥物如重組人BMPs(rhBMPs)而未考慮如Smurf1等影響因素的作用,其臨床療效就會(huì)類(lèi)似rhBMPs一樣出現(xiàn)巨大的個(gè)體間差異,從而減小了其臨床應(yīng)用的適用范圍。利用一系列Smurf1的抑制劑來(lái)促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的恢復(fù)具有較好的臨床應(yīng)用前景[9,12-13]。

圖1 Smurf1調(diào)控成骨細(xì)胞分化的主要途徑Fig.1 The osteoblast differentiation pathways are regulated by Smurf1

2 泛素連接酶Smurf2

Smurf2與Smurf1具有高度的氨基酸序列相似性,也均由成骨細(xì)胞和增殖軟骨細(xì)胞表達(dá),兩者在構(gòu)成上的不同在于Smurf1中少了一個(gè)WW1結(jié)構(gòu)域[14]。同時(shí),Smurf2也是一種骨形成抑制分子,能夠泛素化Smad1/5進(jìn)行蛋白酶體降解,從而負(fù)調(diào)控BMP信號(hào)通路(圖2)[15]。Smurf2-/-與Smurf1-/-的成骨細(xì)胞均表現(xiàn)為分化增強(qiáng)[15-16]。值得關(guān)注的是不同于Smurf1-/-小鼠的類(lèi)似人骨硬化癥的表型,Smurf2-/-小鼠出現(xiàn)了類(lèi)似骨質(zhì)疏松患者的表型,而且這種低骨量表型伴隨著破骨細(xì)胞數(shù)量的顯著增加[16]。進(jìn)一步研究表明缺乏Smurf2的破骨細(xì)胞并沒(méi)有改變其內(nèi)在活性,而是因?yàn)镾murf2-/-成骨細(xì)胞分泌了過(guò)多的破骨細(xì)胞分化因子RANKL,導(dǎo)致破骨細(xì)胞的分化增多[16]。對(duì)于骨重塑的過(guò)程而言,Smurf2既有骨形成抑制因子的作用,又能夠抑制骨吸收作用。

圖2 Smurf2調(diào)控成骨細(xì)胞分化以及破骨細(xì)胞分化的主要途徑Fig.2 The osteoblast and osteoclast differentiation pathways are regulated by Smurf2

圖3 利用GEO2R對(duì)GSE56815中的40例樣本進(jìn)行分析Fig.3 GEO2R is used to analyze 40 samples in GSE56815

Smurf2作用于成骨細(xì)胞從而抑制破骨細(xì)胞分化因子RANKL表達(dá)的具體過(guò)程已經(jīng)被揭示[16]。在正常人體內(nèi)的Smurf2能夠介導(dǎo)Smad3發(fā)生K-48位的泛素化,繼而被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體識(shí)別后降解,抑制了Smad3與維生素D受體(VDR)之間的結(jié)合,從而抑制VDR與RANKL啟動(dòng)子的結(jié)合,減少了RANKL的表達(dá)。并且利用1,25-(OH)2D3不能提高Smurf2-/-成骨細(xì)胞分泌的RANKL,這可能為治療內(nèi)分泌紊亂介導(dǎo)的骨破壞增加提供新的治療靶點(diǎn)[16]。同時(shí),這個(gè)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了Smurf2與Smurf1在骨代謝過(guò)程中功能的差異。利用這個(gè)機(jī)制以及對(duì)體內(nèi)針對(duì)Smurf2調(diào)控因子的研究,如TRAF4[17]、MicroRNA-130a[18]、lncRNA CCAT1[19],有望為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的方向。值得關(guān)注的是,Smurf2對(duì)于骨重塑作用的雙面性仍然不能忽視。

3 泛素連接酶Wwp1

Wwp1在體內(nèi)也屬于一種成骨細(xì)胞分化抑制因子,主要作用機(jī)制是泛素化降解成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2,而最近的研究多關(guān)注在利用富集在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體中的MicroRNA抑制Wwp1從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化以及骨折后的修復(fù)[20-21]。在相對(duì)應(yīng)的Wwp1-/-小鼠模型中,出現(xiàn)骨量增加的表型,并且小鼠的成骨細(xì)胞遷移和分化增強(qiáng),表明Wwp1也能通過(guò)影響成骨細(xì)胞的遷移和分化來(lái)負(fù)性調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能[22]。

對(duì)于慢性炎癥性疾病導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥患者,如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者常常伴有骨質(zhì)疏松癥,這種骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的主要原因是患者體內(nèi)的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)增多,從而導(dǎo)致TNF誘導(dǎo)的骨吸收增加和骨形成減少[23]。而Wwp1也在其中起著關(guān)鍵的作用,TNF通過(guò)Wwp1抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。其具體作用機(jī)制為Wwp1促進(jìn)了促成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子JunB的泛素化降解,在間充質(zhì)干細(xì)胞中抑制其表達(dá)有望成為一種新的治療方式[24]。而最近的一項(xiàng)研究則提出了利用核酸適配體(aptamer)特異性的抑制Wwp1介導(dǎo)的蛋白酶體泛素化作為一種新的骨質(zhì)疏松治療策略[25]。

同時(shí),筆者利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)創(chuàng)建的基因表達(dá)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)所提供的在線分析工具GEO2R對(duì)GSE56815(高或低骨密度的絕經(jīng)前后女性血單核細(xì)胞的基因表達(dá)研究)進(jìn)行分析[26]。該數(shù)據(jù)集包括了80例樣本,其中絕經(jīng)前后女性各40例,同時(shí)又根據(jù)骨密度高低可分為4組。在其中20例絕經(jīng)后高骨密度對(duì)比絕經(jīng)后20例低骨密度的單核細(xì)胞基因表達(dá)量來(lái)看,Wwp1的表達(dá)量呈現(xiàn)有意義的降低。

4 泛素連接酶Wwp2

Wwp2主要在軟骨細(xì)胞中表達(dá),同時(shí)在顱面骨的發(fā)育過(guò)程中起到了重要的作用,Wwp2-/-的小鼠出現(xiàn)典型的顱面部骨骼發(fā)育畸形[27]。一項(xiàng)研究認(rèn)為Wwp2能夠以非蛋白水解單泛素化的方式增強(qiáng)RUNX2的激活,并且在間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞中敲除Wwp2基因會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞的顯著缺陷,包括礦物質(zhì)沉積減少和成骨標(biāo)記基因的下調(diào),Wwp2是一種成骨的正向調(diào)節(jié)因子[28]。而另外一項(xiàng)研究認(rèn)為Wwp2通過(guò)Runx2多泛素化和降解抑制Runx2誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎重要發(fā)病因素血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5(Adamts5),以保護(hù)骨關(guān)節(jié)炎中的軟骨細(xì)胞[29]。

5 泛素連接酶Itch

Itch對(duì)于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都具有抑制作用。首先Itch通過(guò)對(duì)破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號(hào)分子TRAF6的去泛素化來(lái)抑制破骨細(xì)胞分化[30],其次Itch還能促進(jìn)成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的蛋白酶體降解而負(fù)性調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能[31-32]。在Itch-/-小鼠中分離出的骨折愈合組織中表達(dá)了更高水平的成骨細(xì)胞相關(guān)基因,如Runx2等[31]。一項(xiàng)針對(duì)服用抗抑郁藥克羅米帕明(CLP)患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)其骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)大幅增加,進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)CLP抑制了Itch,從而導(dǎo)致破骨細(xì)胞的分化失控,而唑來(lái)膦酸能夠抑制這種破骨細(xì)胞的分化增強(qiáng)[33]。這表明,Itch有潛力成為破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增強(qiáng)類(lèi)疾病的治療靶點(diǎn)。

6 小結(jié)

成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡是維持人骨量健康的重要因素,各種原因?qū)е碌墓侵厮芪蓙y都會(huì)誘導(dǎo)疾病的發(fā)生。成骨細(xì)胞主要由人間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái),而破骨細(xì)胞的分化則需要成骨細(xì)胞分泌的RANKL與巨噬細(xì)胞上的RANK受體結(jié)合,招募TRAF6,繼而激活下游NF-κB、MARK等信號(hào)通路[34-35]。各項(xiàng)研究證據(jù)都表明泛素連接酶能夠積極參與骨重塑過(guò)程,并且在其中扮演著重要的角色(圖4)。明確這些泛素連接酶的具體作用機(jī)制能夠?yàn)槲覀冎委熑绻琴|(zhì)疏松癥一類(lèi)疾病提供新的方向。

圖4 Nedd4泛素連接酶家族成員對(duì)骨重塑過(guò)程的影響Fig.4 Effects of NEDD4 ubiquitin ligase family members on bone remodeling