譚佳穎 王璐 黃雍 龍瓊 黃莉 肖望重 龍群賡 朱茜茜 戴冰

湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥( postmenopausal osteoporosis,PMOP ) 是由于絕經(jīng)后婦女卵巢功能衰退,體內(nèi)雌激素波動性下降,成骨細胞(osteoblast,OB)增殖分化能力降低,使骨代謝紊亂、骨量丟失、骨密度(bone mineral density,BMD)下降、骨骼脆性增加所致[1]。中醫(yī)將PMOP歸屬“骨痿”范疇,中醫(yī)藥治療以補腎為主[2],經(jīng)典補腎名方六味地黃湯臨床防治PMOP取得較好療效[3],這可能與升高絕經(jīng)女性E2水平[4],或抑制骨吸收[5],提升骨密度[6]相關。本課題組前期發(fā)現(xiàn)該湯能升高血清雌二酮(E2)水平[7-9],調(diào)控MAPK通路中 p38 及 ERK1/2 兩個蛋白,進而升高BMD,干預PMOP,但二者是否通過蛋白磷酸化發(fā)揮信號傳遞作用尚不明確。

因此,本研究通過研究山茱萸酒制前后配方入六味地黃湯對PMOP模型大鼠術(shù)后30、60、90 d股骨MAPK信號通路中p38及ERK1/2磷酸化蛋白(p-p38及p-ERK1/2)及mRNA表達的影響,探討山茱萸酒制前后配方入該湯對MAPK通路的動態(tài)干預作用,旨在了解MAPK通路中p38及ERK1/2蛋白發(fā)生磷酸化后干預PMOP的生物學功能和機理,以及六味地黃湯干預前后對其磷酸化水平變化規(guī)律的影響;以期進一步從分子水平上解析PMOP的發(fā)生發(fā)展規(guī)律,為臨床上應用明確六味地黃湯防治PMOP提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物:6～8 月齡未孕雌性 SD 大鼠(SPF 級)90只,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(湘)2019-004,分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心。本實驗經(jīng)過湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準且符合指導原則,倫理編號LLBH-202110290002。

1.1.2試藥:熟地黃、山藥、山茱萸、丹皮、澤瀉、茯苓均購于湖南春可回中藥飲片有限公司,由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院張裕民教授鑒定,阿侖膦酸鈉片購于云南萬裕藥業(yè)有限公司,國藥準字號:J20130085。

1.1.3儀器:電泳儀(美國Bio-Rad);超靈敏多色熒光成像分析系統(tǒng)(美國protein simple公司);高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技);制冰機(常熟市學科電器有限公司);核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop);CFX-connect 96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad);搖擺式脫色搖床(杭州佑寧儀器有限公司);超低溫冰箱(賽默飛世爾科技);超純水機(埃爾格)。

1.1.4試劑:蛋白酶抑制劑(康為世紀,批號:DU2200S);磷酸酶抑制劑(康為世紀,批號:CW2383S);p-p38一抗(Proteintech,批號:28796-1-AP);p-ERK1/2一抗(Proteintech,批號:28733-1-AP);β-actin(Proteintech,批號:66009-1-lg);二抗(成都正能生物有限公司,批號:KK1028);0.45 μm PVDF膜(Biosharp 批號:BS-PVDF-45);超純總RNA提取試劑盒(批號:20211153);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:05227808);NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus(批號:05256502)。

1.2 方法

1.2.1試藥的制備:①酒制山茱萸[10]:取適量生山茱萸飲片,用16 % 黃酒拌勻,悶潤 30 min后,隔水蒸 360 min,取出,室溫干燥后即得紫黑色或者黑色酒茱萸飲片。②六味地黃湯的制備:取熟地黃 24 g,酒茱萸或生茱萸、山藥各 12 g,牡丹皮、澤瀉、茯苓各 9 g,用 6 倍量純凈水浸泡 30 min后,煎煮兩次,每次30 min,過濾合并后濃縮,得到生藥濃度為 1.125 g/mL的藥液,放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2分組及造模:所有大鼠編號、稱重后用隨機數(shù)字表法隨機分為 5 組,即假手術(shù)組,模型組,陽性藥物組(阿侖膦酸鈉片),六味地黃湯生茱萸[六(生)]組和六味地黃湯酒茱萸[六(酒)]組。適應性喂養(yǎng)7 d,禁食不禁水 24 h,行切除雙側(cè)卵巢術(shù),麻醉大鼠,于雙側(cè)肋后緣切縱形切口,摘除雙側(cè)梅花狀卵巢。假手術(shù)組僅切除卵巢周圍的部分脂肪組織。術(shù)后連續(xù) 3 d 肌肉注射 10 萬單位青霉素鉀。術(shù)后 24 h,大鼠恢復正常飲食。

1.2.3給藥:于術(shù)后第 5 d 開始給藥,陽性藥物組(6.3 mg/kg),六(生)組(6.75 g/kg)和六(酒)組(6.75 g/kg)分別灌胃給藥相應的劑量藥物,假手術(shù)組及模型組大鼠給予等體積水灌胃(煎藥用水),每日1次,連續(xù) 90 d。給藥后每周測量一次體重,并根據(jù)各組大鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

1.2.4取材:5 個實驗組分別于術(shù)后 30、60、90 d 分批隨機取大鼠 6 只,禁食不禁水24 h,稱重后麻醉,用碘附消毒手術(shù)部位,脫毛開腹,剝離大鼠兩側(cè)股骨(保留骨膜)。

1.2.5指標檢測:①PMOP 模型大鼠BMD 值測定:取PMOP模型大鼠左側(cè)股骨,用紗布完全包裹好后放置于離心管中,由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨密度室測量。②Western blot 檢測PMOP 模型大鼠股骨組織 p-p38和p-ERK1/2蛋白表達:取大鼠骨組織碎片,加入冷藏保存的組織蛋白裂解液,充分勻漿后冰上裂解 30 min,4 ℃、14 000 r/min 離心15 min,取上清,檢測總蛋白含量。配制上樣緩沖液后,100 ℃加熱 10 min后上樣。10 % SDS-PAGE凝膠60V電泳30 min,隨后80V電泳至溴酚藍跑到凝膠底部即停,200 mA冰上轉(zhuǎn)膜1 h后,5 % 脫脂奶粉室溫封閉 70 min,放置4 ℃冰箱孵育一抗[p-p38 (1∶4 000稀釋),p-ERK1/2 (1∶5 000稀釋),β-actin (1∶7 000稀釋)]過夜,室溫孵育二抗[羊抗兔(p-p38 、p-ERK1/2)或羊抗鼠(β-actin),均為1∶5 000稀釋] 1 h,顯影。膠片經(jīng)Image Lab掃描儀掃描后獲得圖像。用Image J軟件計算各蛋白條帶的灰度比值(p)。③RT-qPCR 檢測PMOP 模型大鼠股骨組織中p38 mRNA、ERK1/2 mRNA 表達:取出凍存股骨,低溫下研磨,按試劑盒說明提取總 RNA,檢測各組總 RNA 純度和濃度后,濃度調(diào)至一致。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒擴增為 cDNA(反轉(zhuǎn)錄條件:75 ℃ 30 min,55 ℃ 15 min)。各基因引物序列見表 1。RT-qPCR擴增體系為20 μL:cDNA 5 μL,上下游引物各0.3 μL,SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL,加RNase-free dd H2O至 20 μL。擴增程序為:預變性:95 ℃ 60 s,變性:95 ℃ 20 s,退火:55 ℃ 20 s,延伸:72 ℃ 30 s,40 個循環(huán)。擴增反應在Bio-Rad CFX PCR儀上執(zhí)行。以 β-actin 為內(nèi)參,通過 2-ΔΔCt法計算各組 p38 mRNA和ERK1/2 mRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

表1 各基因序列引物Table 1 Primers for Each Gene Sequence

2 結(jié)果

2.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的評價

與假手術(shù)組比較,模型組術(shù)后60、90 d的 BMD 值降低(P<0.01),提示術(shù)后60、90 d后模型大鼠BMD 值與假手術(shù)組比較,骨量降低,表明術(shù)后60、90 d后造模成功。見表2。

表2 PMOP 模型大鼠術(shù)后30、60、90 d BMD值

2.2 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術(shù)后 30、60、90 d 股骨中 p38 mRNA、p-p38蛋白表達的影響

與模型組比較,六(生)組和六(酒)組大鼠術(shù)后90 d股骨中 p38 mRNA,p-p38蛋白表達升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01);六(酒)組大鼠術(shù)后30、60 d股骨中 p38 mRNA 表達升高及術(shù)后60 d股骨中p-p38蛋白表達升高差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示六(生)和六(酒)均可上調(diào)術(shù)后90 d模型大鼠股骨p38 mRNA、p-p38蛋白表達,六(酒)還可上調(diào)術(shù)后30、60 d模型大鼠股骨中 p38 mRNA 表達及術(shù)后60 d股骨中p-p38蛋白表達。表明六(生)和六(酒)均可在上調(diào)絕經(jīng)晚期PMOP模型大鼠股骨中p38 mRNA、p-p38蛋白表達,調(diào)節(jié)BMD,改善PMOP,且后者在絕經(jīng)早、中期上調(diào)p38 mRNA及絕經(jīng)中期上調(diào)p-p38蛋白表達。見表3、圖1。

注:K:假手術(shù)組;M:模型組;Y:陽性藥物組;LS:六(生)組;LJ:六(酒)組。圖1 六味地黃湯干預PMOP模型大鼠術(shù)后30、60、90 d股骨中p-p38及p-ERK1/2的蛋白表達的影響Fig.1 Effect of Liuwei Dihuang Tang on the protein expression of p-p38 and p-ERK1/2 in the femur of PMOP model rats at 30, 60, and 90 days after surgery

表3 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術(shù)后 30、60、90 d 股骨中 p38 mRNA、p-p38蛋白表達的影響

2.3 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術(shù)后 30、60、90 d 股骨中ERK1/2 mRNA、p-ERK1/2 蛋白表達的影響

與模型組比較,六(生)組和六(酒)組模型大鼠術(shù)后90 d股骨中ERK1/2 mRNA、p-ERK1/2蛋白及術(shù)后30、60 d模型股骨中p-ERK1/2蛋白升高且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),六(酒)組大鼠術(shù)后30、60 d股骨中ERK1/2 mRNA表達量明顯增加(P<0.05,P<0.01)。提示六(生)和六(酒)均可上調(diào)術(shù)后9 0 d模型大鼠股骨p-ERK1/2、ERK1/2 mRNA表達及術(shù)后30、60 d模型大鼠股骨ERK1/2 mRNA表達,后者還可上調(diào)術(shù)后30、60 d模型大鼠股骨p-ERK1/2蛋白表達。表明六(生)和六(酒)均可在絕經(jīng)晚期上調(diào)p-ERK1/2和ERK1/2 mRNA表達及絕經(jīng)早、中期ERK1/2 mRNA表達,后者還可上調(diào)p-ERK1/2蛋白表達,從而調(diào)節(jié)BMD,改善PMOP。見表4、圖1。

表4 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術(shù)后 30、60、90 d 股骨中ERK1/2 mRNA、p-ERK1/2 蛋白表達的影響

3 討論

PMOP模型常采用切除動物雙側(cè)卵巢法(去卵巢法)造模[11-12],SD大鼠因其去卵巢后雌激素水平下降及骨代謝等與臨床上PMOP癥狀極為相似[13],且因其穩(wěn)定性和重復性較好,為建立PMOP模型的常用動物之一[14]。較多學者僅選擇PMOP術(shù)后90 d這一個時間點為其造模周期進行研究[15,17-18],而部分學者也僅選擇術(shù)后30 d或60 d中一個時間點[19-22]造模。究竟何種造模周期為佳?目前尚未規(guī)范。本實驗通過研究PMOP模型大鼠術(shù)后30、60、90 d的骨密度值,發(fā)現(xiàn)術(shù)后60、90 d 的骨密度值顯著下降,可見該大鼠術(shù)后60、90 d均可成模,此發(fā)現(xiàn)可為PMOP大鼠模型的造模周期規(guī)范化提供一定的實驗依據(jù),尤其是術(shù)后60 d的造模時間可縮短造模周期并節(jié)約實驗成本。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路(MAPK通路)密切相關[23]。MAPK通路有3個亞族:p38 MAPK ( p38)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、c-Jun N-末端激酶 (JNK),其中 p38 和 ERK1/2 均通過蛋白的磷酸化修飾(蛋白磷酸化)即mRNA被翻譯成蛋白后,對其氨基酸殘基進行的磷酸化修飾,變成能發(fā)揮生物活性的成熟蛋白[24-25],從而激活經(jīng)典三級激酶模式,激活成骨相關因子如Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)實現(xiàn)信號的傳遞,從而調(diào)控OB生長、增殖、凋亡等過程[26-27],調(diào)節(jié)BMD,干預PMOP。本研究發(fā)現(xiàn)六味地黃湯通過調(diào)控MAPK通路中 p38 及 ERK1/2 兩個蛋白,使其均發(fā)生蛋白磷酸化,從而激活成骨相關因子,干預PMOP。但是否還通過激活該通路中的JNK蛋白還有待進一步研究。

山茱萸為六味地黃湯中臣藥,含有改善PMOP藥效物質(zhì)成分[28-30],然山茱萸炮制品較多,最早記載六味地黃方的《小兒藥證直決》中以生茱萸入方,2010—2020 共計3版的《中國藥典》卻均以酒茱萸入方。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[31-32],不同炮制山茱萸入方的六味地黃湯作用效果不盡相同,以酒茱萸、蒸茱萸為佳。本研究發(fā)現(xiàn),六(酒)可上調(diào)PMOP術(shù)后 30、60、90 d模型大鼠股骨中 p-p38、p-ERK1/2及ERK1/2 mRNA表達以及術(shù)后 60、90 d 模型大鼠股骨p38 mRNA表達,而六(生)僅能調(diào)整術(shù)后 90 d 模型大鼠股骨中p-p38及p-ERK1/2及 mRNA 表達及術(shù)后 30、60 d 模型大鼠股骨中 p-ERK1/2 表達。研究[32-35]發(fā)現(xiàn),PMOP模型大鼠術(shù)后30、60、90 d的骨密度變化與女性絕經(jīng)早、中、晚期具有一定的相似性;故山茱萸、酒茱萸分別入方的六味地黃湯均可有效延緩PMOP的發(fā)生發(fā)展,其中六(酒)從絕經(jīng)早、中期便開始起效,并穩(wěn)定至絕經(jīng)晚期,而六(生)則主要在絕經(jīng)晚期發(fā)揮作用,六(酒)作用較優(yōu)于六(生)可能與本課題組前期研究[9]發(fā)現(xiàn)六(酒)中5-羥甲基糠醛、沒食子酸含量增加有關。該研究可為六味地黃湯多靶點干預PMOP發(fā)生發(fā)展以及2020版《中國藥典》選用酒茱萸配方入六味地黃湯提供一定的實驗和理論依據(jù)。