陳偉堅 姜濤 周宜 楊吉勇 劉煒年 王海彬 梁篤 劉文剛*

1. 廣州中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院,廣東 廣州 510095

2. 廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院),廣東 廣州 510095

3. 廣州市正骨醫(yī)院,廣東 廣州 510045

4. 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨科,廣東 廣州 510405

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(primary osteoporosis, POP)是一種以骨強度下降、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨骼疾病,是骨形成與骨吸收呈負平衡導致骨重建失衡[1]。POP的防治目標在于通過藥物干預(yù)和康復(fù)治療維持骨量,減少骨量丟失,并降低骨折風險[2],中藥在防治POP中發(fā)揮了重要作用[3-4]。

POP歸屬于中醫(yī)學“骨萎”的范疇,與脾腎二臟關(guān)系最為相關(guān)?！皡④甙仔g(shù)散”記載于《太平惠民合劑局方》一書中,由“人參、茯苓、白術(shù)、白扁豆、桔梗、蓮子、砂仁、山藥、薏苡仁、甘草”組成,是益氣健脾的中醫(yī)經(jīng)典名方。現(xiàn)代藥理學發(fā)現(xiàn)其中藥具有調(diào)節(jié)骨免疫、改善骨密度、抗氧化、抗炎等作用[5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),其能夠改善POP患者骨代謝平衡,但其具體分子機制尚不明確[6-7]。

本研究運用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)鑒定參苓白術(shù)散的化學成分,通過單細胞轉(zhuǎn)錄譜及WGCNA分析篩選POP的細胞亞群及核心靶點,并運用虛擬分子對接驗證成分與核心靶點間的活性,挖掘參苓白術(shù)散治療POP的成分及作用機制。

1 材料和方法

1.1 LC-MS鑒定參苓白術(shù)散化學成分

1.1.1參苓白術(shù)散溶液制備[8]:稱取黨參 20 g、茯苓 20 g、白術(shù) 30 g、白扁豆 10 g、桔梗 10 g、蓮子 10 g、砂仁 10 g、山藥 10 g、薏苡仁 10 g、甘草 10 g,加水煎煮2次,濃縮并定容至250 mL,用正丁醇萃取中藥煎液并減壓濃縮,取2 mL樣品加入甲醇溶液,振蕩混勻后離心10 min,取上清液用于后續(xù)LC-MS檢測。

1.1.2色譜條件[9]:采用Thermo Vanquish超高效液相系統(tǒng),色譜柱:ACQUITY UPLC?HSS T3,設(shè)定流速:0.25 mL/min,柱溫:40 ℃。正離子模式:流動相為 0.1 %甲酸乙腈和甲酸。負離子模式:流動相為乙腈和5 mmol/L甲酸銨水,并進行梯度洗脫。

1.1.3質(zhì)譜條件[10]:采用Thermo Q Exactive質(zhì)譜檢測器,分別設(shè)定正、負離子噴霧電壓為3.50 kV和-2.50 kV,采集信號前10離子進行二級裂解,同時采用動態(tài)排除雜亂無關(guān)的MS/MS信息。

1.1.4化學成分鑒定:根據(jù)分子量誤差≤30 ppm對鑒定物進行篩選,結(jié)合人類代謝組數(shù)據(jù)庫(human metabolome database, HMDB)、METLIN、Massbank、LipidMaps以及mzClound數(shù)據(jù)庫確認注釋獲得參苓白術(shù)散的化學成分[11]。

1.2 參苓白術(shù)散潛在作用靶點篩選

從PubChem數(shù)據(jù)庫獲取參苓白術(shù)散化學成分結(jié)構(gòu)式,并導入Swiss Target Prediction得到潛在作用靶點。

1.3 POP靶點獲取

在GEO數(shù)據(jù)庫中下載與POP相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù),利用bioconductor R軟件進行背景矯正、歸一化和表達值計算,并利用limma R軟件計算兩組間的差異表達基因,設(shè)定調(diào)整后P值<0.05,表達變化幅度≥2倍(∣log2FC∣≥1.00)為篩選DEGs的標準。

1.4 加權(quán)基因共表達(WGCNA)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將POP-DEGs表達矩陣數(shù)據(jù)利用WGCNA R軟件構(gòu)建POP-WGCNA網(wǎng)絡(luò)。通過無標度網(wǎng)絡(luò)計算出最佳的軟閾值β,之后通過β次冪運算構(gòu)建鄰接矩陣。隨后建立拓撲重疊矩陣(topological overlap matrix,TOM)為基本元素構(gòu)造層次聚類樹。采用動態(tài)混合切割法進行模塊劃分、合并以及繪制基因樹狀圖。模塊劃分后,計算每個模塊的特征向量 (module eigengene,ME),關(guān)聯(lián)POP患者及正常人的臨床性狀,使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)計算ME與樣本臨床性狀的相關(guān)程度,將與POP相關(guān)程度最高的模塊定義為樞紐模塊。

1.5 POP單細胞測序數(shù)據(jù)分析

1.5.1單細胞測序數(shù)據(jù)預(yù)處理:在GEO數(shù)據(jù)庫下載與POP相關(guān)的單細胞測序數(shù)據(jù),利用Limma、Seurat、Dplyr和Magrittr R軟件過濾低豐度數(shù)據(jù)。設(shè)定Seurat對質(zhì)量控制的篩選條件為:基因表達>3個細胞,基因數(shù)200 ～10 000細胞,線粒體基因百分比<20 %。

1.5.2細胞注釋和標記基因篩選:對數(shù)據(jù)進行主成分(PCA)分析,取前16個PCs進行tSNE以及UMAP聚類分析,設(shè)定分辨率為0.2。根據(jù)標記基因表達情況注釋細胞簇群,并使用DESeq2和wilcox計算各細胞簇群間的DEGs。

1.6 參苓白術(shù)散治療靶點在POP細胞簇群中的分布

借助Venn R軟件將藥物作用靶點與POP-DEGs以及WGCNA-樞紐基因進行交互映射,輸出共表達VENN圖,并利用Seurat軟件對共同基因在不同細胞簇中的表達進行展示。應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建共同靶點互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI),進行拓撲分析以篩選關(guān)鍵靶點。

1.7 GO/KEGG富集分析

利用Bioconductor、clusterProfiler R軟件對核心靶點進行基因本體論(gene ontology, GO)和 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路分析,進一步探討核心靶點的潛在作用機制。

1.8 分子對接虛擬篩選

從Pubchem數(shù)據(jù)庫下載藥物化學成分,并從PDB數(shù)據(jù)庫下載核心蛋白結(jié)構(gòu)域。借助Discovery Studio 2019的Libdock模塊來完成虛擬篩選。根據(jù)虛擬對接結(jié)果選擇LibDockScore值最大的化合物分別與核心蛋白結(jié)構(gòu)域進行半柔性分子對接,運行AutoDock-Vina進行結(jié)合能計算以及分子對接結(jié)果展示,以評價生物信息分析預(yù)測的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 參苓白術(shù)散化學成分鑒定及作用靶點篩選

根據(jù)LC-MS正、負離子模式中化合物的質(zhì)核比,保留時間及峰面積等,結(jié)合化合物質(zhì)譜圖,最終鑒定得到148個化合物,聯(lián)合文獻檢索結(jié)果,共篩選得到10個參苓白術(shù)散化學成分,見表1,并預(yù)測得到潛在作用靶點414個。

表1 參苓白術(shù)散10個化學物的LC-MS測量參數(shù)Table 1 LC-MS parameters of 10 components of Shenling Baizhu San

2.2 POP差異表達基因

得到與POP相關(guān)的轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)集GSE35958,包括POP患者5例和健康成人4例,篩選得到843個DEGs,其中包括581個上調(diào)DEGs及262個下調(diào)DEGs。

2.3 WGCNA分析

WGCNA分析發(fā)現(xiàn),最佳軟閾值(β)為9,尺度獨立性為0.9(圖1A),構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)分層聚類樹和共表達模塊(圖1B、C)。并將所有基因劃分成25個模塊,其中MEbrown共表達模塊與POP顯著負相關(guān)(r=-0.97,P<0.05),包含1 976個潛在基因,說明MEbrown共表達模塊中可能存在POP樞紐基因。最后,構(gòu)建樞紐基因在各模塊中的表達變化熱圖(圖1D)。

注:A:最佳軟閾值;B:差異表達基因聚類樹;C:25大模塊與POP相互關(guān)系;D:基因在各模塊中的表達變化熱圖。圖1 WGCNA分析Fig.1 WGCNA analysis

2.4 POP單細胞轉(zhuǎn)錄譜異質(zhì)性分析

選取POP-scRNA-seq數(shù)據(jù)集(GSE147287)為研究對象,其中包括1例POP患者和1例骨性關(guān)節(jié)炎患者的骨髓細胞,共獲得21 464個細胞以及12 002個相關(guān)基因(圖2A)。設(shè)定PC=16,以及分辨率為0.20后(圖2B),分別進行TSNE以及UMAP降維聚類分群后,將整合后的細胞分為14個cluster (圖2C、D)。并根據(jù)已知的人類細胞標記基因進行細胞注釋,發(fā)現(xiàn)POP中骨髓血樣本中包括骨髓細胞、組織干細胞、巨噬細胞、BM細胞、紅細胞、單核細胞、T細胞、B細胞、前CD34-B細胞、前CD34+B細胞(圖3 A、B)。

注:A:細胞分布情況;B:分辨率篩選;C:TSNE聚類分群分布;D:UMAP聚類分群分布。圖2 POP單細胞測序數(shù)據(jù)預(yù)處理Fig.2 Single-cell sequencing data pre-processing of POP

注:A:細胞注釋后的tSNE圖;B:細胞注釋后的UMAP圖。圖3 POP單細胞注釋分群Fig.3 Single-cell annotation clustering of POP

2.5 參苓白術(shù)散治療POP核心交集基因分布

聯(lián)合414個藥物作用靶點以及843個POP-DEGs和1 976個WGCNA-樞紐基因分析,共得到52個藥物治療POP的靶點(圖4A),以P<0.05,∣log2FC∣≥0.50為篩選標準得到37個DEGs,根據(jù)度值大小得到19個核心基因(圖4B)。

注:A:參苓白術(shù)散-POP-WGCNA交集基因韋恩圖;B:核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。圖4 參苓白術(shù)散- POP -WGCNA交集基因分布Fig.4 The distribution of Shenling Baizhu San-POP-WGCNA intersection gene

2.6 核心基因的富集分析

對19個POP核心靶點進行富集分析發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)其GO主要富集在細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、衰老、細胞對非生物刺激的反應(yīng)等。而KEGG主要富集在細胞衰老、內(nèi)分泌抵抗、凋亡、破骨細胞分化、MAPK等。

2.7 虛擬分子對接驗證

核心蛋白選擇度值前4位以及2個共同靶點,即TP53、AKT1、JUN、BCL2L1、BAX、RPL27A,與鑒定得到的藥物成分進行虛擬對接發(fā)現(xiàn),TP53、JUN、BCL2L1、BAX與α-倒捻子素,AKT1與芹菜素,RPL27A與姜黃醇結(jié)合最好(圖5)。并進一步發(fā)現(xiàn)JUN、BAX與α-倒捻子素,AKT1與芹菜素,RPL27A與姜黃醇形成的對接復(fù)合體結(jié)合能均<-6.7 kcal/mol,RMSD值均<2.00,說明以上復(fù)合體能夠形成穩(wěn)定的對接模型。見表2,圖6。

圖5 虛擬分子對接篩選Fig.5 Virtual molecule docking screening

圖6 分子對接模型Fig.6 Molecular docking models

表2 分子對接結(jié)果Table 2 The results of molecular docking

3 討論

目前對POP的治療主要以抑制骨吸收為主,能有效穩(wěn)定骨微結(jié)構(gòu)、降低骨折發(fā)生率,但不能逆轉(zhuǎn)已破壞的骨微結(jié)構(gòu)[12]。中醫(yī)從腎虛論治骨質(zhì)疏松癥較多,然而腎主骨的功能強弱依賴于脾的后天滋養(yǎng)[13]。參苓白術(shù)散是益氣健脾的經(jīng)典名方,能影響內(nèi)分泌調(diào)節(jié)骨代謝和免疫功能,并能通過腸-微生物-內(nèi)分泌-骨軸影響鈣磷吸收[14-15]。

本研究中借助LC-MS鑒定得到10種參苓白術(shù)散的化學成分,包括了α-倒捻子素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III等。目前多項研究發(fā)現(xiàn),以上成分能通過NF-κB和MAPK信號傳導抑制炎癥性骨吸收,且能激活Wnt/β-catenin信號傳導促進成骨分化改善骨形成,調(diào)節(jié)骨代謝穩(wěn)態(tài)延緩POP的發(fā)展[16-20]。

聯(lián)合參苓白術(shù)散成分靶點,POP-DEGs以及WGCNA-樞紐基因分析得到19個核心靶點,包括TP53、AKT1、JUN、BCL2L1、BAX和RPL27A等。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn),AKT1激活能促進間充質(zhì)干細胞成骨分化;BCL2L1是抗凋亡基因,能抑制成骨細胞凋亡并增加骨體積和強度[22];促凋亡蛋白Bax能促進成骨細胞凋亡,加速骨破壞[23]。此外,發(fā)現(xiàn)以上靶點可能參與了細胞衰老、細胞凋亡、破骨細胞分化等信號通路。細胞衰老在骨微環(huán)境中不斷積累并分泌促炎衰老相關(guān)分泌表型[24],作用于成骨細胞抑制骨形成,作用于破骨細胞促進骨吸收,作用于間充質(zhì)干細胞使其向脂肪細胞分化[25]。此外,破骨細胞分化及活性是造成OP骨量丟失和骨破壞的重要因素[26]。本研究發(fā)現(xiàn)POP中存在多種免疫細胞,包括巨噬細胞、單核細胞、T細胞、B細胞等,研究表明免疫細胞可通過直接細胞-細胞接觸或旁分泌機制,影響骨質(zhì)流失和骨修復(fù)[27]。因此,參苓白術(shù)散可能通過調(diào)控免疫細胞與骨細胞的相互作用治療POP。

綜上所述,參苓白術(shù)散可從多成分、多靶點及多細胞水平治療POP,為參苓白術(shù)散治療POP提供了理論依據(jù)。然而,本研究并沒有開展相應(yīng)化學成分的實驗驗證,后期將進一步開展基礎(chǔ)實驗進行探索。