魯林 方虹

1. 武漢市中醫(yī)醫(yī)院,湖北 武漢 430000

2. 湖北省中醫(yī)院,湖北 武漢 430000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種與雌激素缺乏相關(guān)的退行性疾病,其典型特征是骨量吸收增加,骨量減少和骨強度不足[1]。PMOP通常發(fā)生在絕經(jīng)后的10到15年內(nèi)[2]。PMOP的主要并發(fā)癥是增加脆性骨折的可能性[3]。雌激素替代療法對PMOP是有效的,但容易引起多種疾病,效果并不理想[4]。因此,尋找新的治療PMOP的藥物迫在眉睫。

骨碎補總黃酮(total flavonoids of rhizoma drynariae,TFRD)是骨碎補根莖中的主要成分,常用于治療老年性骨質(zhì)疏松[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn),TFRD能夠通過提高骨密度和改善骨結(jié)構(gòu)等方式來治療卵巢切除所致的骨質(zhì)疏松[6-7],但其機制仍不清楚。氧化應(yīng)激能夠促進成骨細胞凋亡和破骨細胞的增殖和分化等,在骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用。研究表明,Notch信號通路參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié),且Notch信號通路及其與ROS相關(guān)的信號串擾與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。前人研究發(fā)現(xiàn),TRFD可以調(diào)控Notch1及其下游靶點發(fā)狀分裂相關(guān)增強子1(hairy and enhancer of split 1,Hes1)的表達來改善骨質(zhì)疏松,而高水平的ROS能夠上調(diào)Notch1[10]。因此,本研究假設(shè)TRFD可能通過Notch1介導的抗氧化反應(yīng)和ROS介導的氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松的作用。為驗證上述假設(shè),本研究通過構(gòu)建去卵巢(ovariectomized,OVX)骨質(zhì)疏松大鼠模型,并使用TRFD干預(yù)治療,研究Notch1通路表達水平和氧化應(yīng)激水平的變化,明確TRFD對OVX骨質(zhì)疏松的作用機制,為其臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SPF級7周齡雌性SD大鼠,共36只,來源于湖南斯萊克景達。于SPF級條件下飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度22～26 ℃,相對濕度50 %～60 %,明暗人工光照各12 h。實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0104,本研究經(jīng)武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司倫理審查委員會批準(HLK-20220821-001)。

1.1.2試劑:骨碎補黃酮(Z20030007)購于北京岐黃醫(yī)藥股份有限公司,補佳樂(戊酸雌二醇片)(523A)購于拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,HE染色試劑盒(G1120)、DAB顯色試劑盒(DA1010)購于北京Solarbio公司,SOD(A001-3-1)和MDA(A003-1-1)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所,ROS檢測試劑盒(BB-475015)購自上海貝博生物,OPG(PAB33195)、BMP-2(PAB30060)、Notch1(PAB35376)、Hes1(PAB37469)、Prdx1(PAB40094)和GAPDH一抗(PAB36269)及HRP標記的山羊抗兔二抗(SAB43714)購于武漢Bioswamp公司,免疫組化試劑(63707)購于美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1卵巢摘除術(shù)致骨質(zhì)疏松大鼠模型構(gòu)建:大鼠麻醉后,將四肢和頭部仰臥固定于手術(shù)臺上,用剪刀腹部正中切口,暴露卵巢,進行雙側(cè)卵巢摘除術(shù),手術(shù)結(jié)束后,按照4萬U/d的劑量向大腿肌肉中注射青霉素鈉,連續(xù)注射3 d。繼續(xù)飼養(yǎng)8周后成模。假手術(shù)組僅切除腹部與卵巢等重量的脂肪。

1.2.2實驗分組及處理:將36只SD大鼠隨機分成假手術(shù)組(Sham)、去卵巢組(OVX)、骨碎補總黃酮組(TFRD)和補佳樂組(BJL)。Sham組切除腹部與卵巢等重量的脂肪;OVX組卵巢摘除術(shù)造模;TFRD組卵巢摘除術(shù)術(shù)后第7 d開始給藥,每天上午按108 mg/(kg·d)的劑量灌胃1次骨碎補總黃酮,連續(xù)12周[11];BJL組卵巢摘除術(shù)術(shù)后第7 d開始給藥,每天上午按0.21 mg/(kg·d)的劑量灌胃1次補佳樂,連續(xù)12周[12]。結(jié)束后,稱重,收集血清,處死大鼠,截斷股骨,用刮匙刮取斷面處骨組織進行病理檢測,其他約取0.5 g儲存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3HE染色觀察股骨組織形態(tài)學變化:4 %多聚甲醛固定股骨組織,脫鈣后進行石蠟包埋,切取厚度約3 μm的切片,按照HE染色步驟進行染色,顯微鏡下觀察并拍照。采用Luo等[13]的方法進行病理評分。

1.2.4免疫組織化學染色檢測股骨組織中OPG和BMP-2的表達:將大鼠股骨組織切片脫蠟至水,進行抗原修復(fù)18 min,3 % H2O2孵育10 min,滴加OPG(1∶100)、BMP-2(1∶50)一抗,4 ℃孵育過夜,加入二抗(1∶100),37 ℃孵育60 min,DAB染色,有顏色變化后停止染色,蘇木精復(fù)染,染色時控制染色程度,梯度酒精脫水,置于二甲苯中透明3 min×2次,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察OPG和BMP-2的陽性表達,并拍照。

1.2.5生化試劑盒檢測血清中SOD、MDA和ROS的水平:取上清液,嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作,檢測各組大鼠血清中SOD、MDA和ROS水平變化。

1.2.6Westernblot檢測股骨組織中Notch1、Hes1、Prdx1蛋白的表達:股骨組織用裂解液充分裂解,離心取上清,進行蛋白質(zhì)定量,SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,5 %脫脂奶粉室溫封閉過夜,加入Notch1、Hes1、Prdx1和GAPDH(均1∶1 000)抗體,室溫孵育1 h,洗膜3次后,加入二抗(1∶20 000),室溫孵育1 h,ECL顯影,TANON GIS軟件讀取條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 骨碎補總黃酮對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠體重的影響

各組大鼠給藥結(jié)束后體重結(jié)果見圖1。與Sham組相比,OVX組大鼠體重顯著升高(P<0.01);與OVX組相比,TFRD組和BJL組大鼠體重均顯著降低(P<0.01)。

注:與Sham組比較,**P<0.01;與OVX組比較,##P<0.01。圖1 各組大鼠體重的比較Fig.1 Comparison of body weight of rats in each group

2.2 骨碎補總黃酮對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)學的影響

HE染色結(jié)果見圖2。Sham組大鼠股骨形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,骨小梁間隙較小且無斷裂現(xiàn)象;而OVX組大鼠股骨形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整,骨小梁丟失、斷裂嚴重,骨小梁間距增大,與Sham組比較病理評分顯著升高(P<0.01);與OVX組相比,TFRD組和BJL組大鼠骨小梁間距減小,斷裂現(xiàn)象也減少,病理評分均顯著降低(P<0.01)。

注:與Sham組比較,**P<0.01;與OVX組比較,##P<0.01。圖2 各組大鼠股骨組織HE染色結(jié)果(200×)Fig.2 HE staining results of femur tissue of rats in each group(200×)

2.3 骨碎補總黃酮對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中OPG和BMP-2表達的影響

免疫組化檢測結(jié)果見圖3。與Sham組相比,OVX組股骨組織中OPG和BMP-2的陽性表達顯著降低(P<0.01);與OVX組相比,TFRD組和BJL組股骨組織中OPG和BMP-2的陽性表達均顯著升高(P<0.01)。

注:與Sham組比較,**P<0.01;與OVX組比較,##P<0.01。圖3 各組大鼠股骨組織中BMP-2(A)和OPG(B)表達情況的比較Fig.3 Comparison of the expression of BMP-2 (A) and OPG (B) in femur tissue of rats in each group

2.4 骨碎補總黃酮對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清中MDA、SOD和ROS水平的影響

生化試劑盒檢測結(jié)果見圖4。與Sham組相比,OVX組大鼠血清中MDA和ROS水平顯著升高(P<0.01),SOD水平顯著降低(P<0.01);與OVX組相比,TFRD組和BJL組大鼠血清中MDA和ROS水平均明顯降低(P<0.01),SOD水平均明顯升高(P<0.01)。

注:與Sham組比較,**P<0.01;與OVX組比較,##P<0.01。圖4 各組大鼠血清中MDA、SOD和ROS水平的比較Fig.4 Comparison of serum levels of MDA, SOD and ROS in each group

2.5 骨碎補總黃酮對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中Notch1-Hes1-Prdx1通路相關(guān)因子表達的影響

Western blot檢測結(jié)果見圖5。與Sham組相比,OVX組大鼠股骨組織中Notch1、Hes1、Prdx1蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01);與OVX組相比,TFRD組和BJL組大鼠股骨組織中Notch1、Hes1、Prdx1蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)。

注:與Sham組比較,**P<0.01;與OVX組比較,##P<0.01。圖5 各組大鼠股骨組織中Notch1、Hes1和Prdx1蛋白表達水平的比較Fig.5 Comparison of protein expression levels of Notch1, Hes1 and Prdx1 in femur tissues of rats in each group

3 討論

現(xiàn)有的抗骨質(zhì)疏松藥物會導致如股骨非典型骨折、頜骨壞死等的并發(fā)癥,這限制了其在臨床上的應(yīng)用。而大量中草藥提取物表現(xiàn)出了良好的抗骨質(zhì)疏松作用[14]。本研究結(jié)果顯示,TFRD干預(yù)后,OVX小鼠體重減輕,股骨組織損傷也有所減輕,骨小梁間距減小,斷裂現(xiàn)象也減少,這表明TFRD具有抗骨質(zhì)疏松的作用,與前期研究結(jié)果一致[6]。

破骨細胞過度活化導致骨質(zhì)疏松,因此,靶向破骨細胞是抗骨質(zhì)疏松癥治療的重要策略[15]。破骨細胞的生成受到多種細胞因子的調(diào)節(jié)。OPG能夠抑制破骨細胞的生成,從而影響骨吸收過程[16]。BMP-2是調(diào)控成骨的關(guān)鍵因子,能夠誘導骨形成[17]。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)OVX大鼠OPG和BMP-2水平降低,而經(jīng)過治療后OPG和BMP-2水平均顯著升高。本研究中,灌胃給予OVX大鼠補佳樂和TFRD治療后,大鼠股骨組織中OPG和BMP-2的表達均上調(diào),且兩組OPG和BMP-2的表達水平接近,提示TFRD能夠通過調(diào)控OPG和BMP-2的表達來調(diào)控骨形成和骨吸收穩(wěn)態(tài)。

細胞內(nèi)ROS是調(diào)節(jié)破骨細胞形成的關(guān)鍵信號因子。有報道稱,增加破骨細胞中ROS的水平可能會促進破骨細胞的形成和激活[19]。此外,ROS產(chǎn)生的增加與雌激素缺乏和炎癥性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的病理性骨吸收有關(guān)[20]。本研究檢測了TFRD對OVX大鼠ROS水平及氧化應(yīng)激相關(guān)指標MDA和SOD的影響,其中MDA是一種過氧化產(chǎn)物;而SOD是一種抗氧化金屬酶,能夠促進氧和過氧化氫的形成。結(jié)果顯示,給予補佳樂和TFRD治療后,ROS和MDA水平降低,SOD水平升高,提示TFRD能夠通過抑制ROS介導的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解OVX骨質(zhì)疏松。

Notch信號通路在細胞分化、增殖、凋亡、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成和遷移等一系列生理和病理過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[21]。研究表明,Notch通路對成骨細胞分化至關(guān)重要,而成骨細胞分化又會影響骨質(zhì)疏松的進程。多項研究證實TFRD參與Notch信號通路激活的調(diào)節(jié),Hes1是受Notch信號通路調(diào)節(jié)的主要轉(zhuǎn)錄下游靶點[22]。郭松等[23]發(fā)現(xiàn)TFRD能夠通過抑制Notch1和Hes1的表達來促進成骨細胞增殖。黃翔宇等[10]也發(fā)現(xiàn)TFRD可通過抑制Notch通路改善骨質(zhì)疏松臨床癥狀。但關(guān)于TFRD通過激活Notch通路緩解氧化應(yīng)激損傷的研究較少。本研究結(jié)果顯示,TFRD和補佳樂均能夠抑制Notch1和Hes1的表達,且TFRD的抑制效果更好,提示TFRD可能通過抑制Notch信號通路緩解OVX骨質(zhì)疏松,與前期研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn),Notch通路與ROS的相互串擾對骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要[24]。Prdx1是一種過氧化物酶,參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS的動態(tài)平衡。Du等[25]發(fā)現(xiàn),Prdx1在OVX小鼠成骨細胞中上調(diào)。本研究結(jié)果顯示,TFRD能夠抑制OVX大鼠股骨組織中Prdx1的表達,表明TFRD可通過Notch1/Hes1通路調(diào)控Prdx1介導的抗氧化反應(yīng)緩解OVX骨質(zhì)疏松。

綜上所述,TFRD可抑制OVX大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng),調(diào)控骨穩(wěn)態(tài),其發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用可能與抑制Notch1/Hes1/Prdx1通路有關(guān)。但由于骨質(zhì)疏松機制復(fù)雜,后續(xù)可以進一步通過細胞實驗深入探究TFRD的作用機制,為TFRD防治PMOP提供新思路。