王俊杰 郭中華* 史棟梁 丁琳琳

1. 河南省中醫(yī)院骨病一科,河南 鄭州 450053 2. 金水區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科,河南 鄭州 450008

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種慢性炎癥性關(guān)節(jié)退行性疾病,多發(fā)于中老年人,臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)畸形或功能障礙,具有較高的致殘率,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。KOA病理機(jī)制復(fù)雜,與炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷、自身免疫反應(yīng)等多種因素有關(guān),其病理變化最初發(fā)生于關(guān)節(jié)軟骨組織,炎癥因子刺激可誘導(dǎo)骨細(xì)胞外基質(zhì)降解,破壞關(guān)節(jié)軟骨,加重KOA的進(jìn)展,抑制膝關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng),可延緩關(guān)節(jié)病理進(jìn)展[2-3]。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)可維持細(xì)胞內(nèi)能量平衡,通過調(diào)節(jié)下游靶分子如核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的轉(zhuǎn)錄,介導(dǎo)炎癥損傷,與多種炎癥性疾病密切相關(guān),在關(guān)節(jié)炎疾病中,AMPK活性下降時(shí)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退行性變[4],激活A(yù)MPK可提高軟骨細(xì)胞的抗應(yīng)激能力,修復(fù)軟骨細(xì)胞線粒體功能,延緩實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[5]。麻黃堿(Ephedrine)是從麻黃屬植物中提取的生物堿,具有擴(kuò)展支氣管、升高血壓的作用,最新研究顯示,麻黃堿具有調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)的作用,可降低促炎細(xì)胞因子表現(xiàn)出抗關(guān)節(jié)炎作用[6-7]。麻黃堿對(duì)KOA的作用機(jī)制尚不清楚,本研究探討麻黃堿對(duì)KOA的影響及可能的影響機(jī)制,為KOA的治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物:SPF級(jí)SD雄性大鼠,6～8周齡,210～230 g,購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(許可證號(hào):SCXK(京)2021-0004),動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度為(22±2)℃,濕度約55 %,12 h/12 h 晝夜交替的環(huán)境中。本實(shí)驗(yàn)按照河南省中醫(yī)院倫理委員會(huì)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用的原則進(jìn)行,并審核通過(倫理號(hào):HNSZYY202210012)。

1.1.2主要試劑:鹽酸麻黃堿片(國(guó)藥準(zhǔn)字H36020897,規(guī)格:30 mg)購(gòu)自江西制藥有限責(zé)任公司;AMPK抑制劑Compound C(P5499,HPLC≥98 %)購(gòu)自Sigma公司;改良番紅O-固綠軟骨染色試劑盒(G1371)、MMP-13(K002867P)、IL-1β(K009661P)、p-AMPK(K009990P)、AMPK(K200063M)抗體購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;大鼠TNF-α(PT516)、IL-1β(PI303)ELISA試劑盒及p-NF-κB p65(AF5881)、NF-κB p65(AF0246)、β-actin(AF5003)抗體購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。大鼠環(huán)氧化酶-2(COX-2)ELISA試劑盒(SP13477)購(gòu)自武漢賽培生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備:根據(jù)參考文獻(xiàn),采用Hulth法[8]制備KOA模型,大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,腹腔注射2 %戊巴比妥鈉麻醉大鼠,打開右膝關(guān)節(jié)腔,髕骨向外側(cè)推,切斷前交叉和內(nèi)側(cè)副韌帶與內(nèi)側(cè)半月板切除,術(shù)后臀大肌注射40萬(wàn)U青霉素3 d預(yù)防感染,假手術(shù)組(Sham組)經(jīng)切開皮膚后進(jìn)行縫合。術(shù)后自由活動(dòng),8周后造模結(jié)束。造模成功后,將大鼠隨機(jī)分為KOA組、Ephedrine組、Ephedrine+AMPK抑制劑組(Ephedrine+Compound C組),每組10只。Ephedrine組大鼠給予40.0 mg/kg的麻黃堿灌胃給藥,每天1次,Ephedrine+Compound C組使用40.0 mg/kg的麻黃堿灌胃給藥及0.2 mg/kg的AMPK抑制劑Compound C尾靜脈注射,給藥劑量參考文獻(xiàn)[7],Sham組與KOA組大鼠同時(shí)灌胃與尾靜脈注射等量的生理鹽水,每天1次,連續(xù)給藥4周。

1.2.2膝關(guān)節(jié)寬度檢測(cè):分別于造模成功后第1、14、28 d觀察關(guān)節(jié)腫脹情況,使用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠膝關(guān)節(jié)寬度。

1.2.3大鼠疼痛閾值:分別于造模成功后第1、14、28 d,用電子壓力感測(cè)器測(cè)量大鼠機(jī)械刺激縮爪閾值,使用刺激針刺激大鼠右肢足底二、三跖骨處并增加刺激壓力,大鼠出現(xiàn)縮足、舔腳等陽(yáng)反應(yīng)時(shí)記錄刺激壓力數(shù)值,每只大鼠連續(xù)刺激3次,計(jì)算平均值。

1.2.4軟骨組織病理學(xué)觀察:大鼠采集完關(guān)節(jié)液后,將右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔剖開后緊貼骨關(guān)節(jié)表面切取軟骨組織,其中5種大鼠軟骨組織使用4 %多聚甲醛固定5 d,10 % EDTA溶液脫鈣4周,石蠟包埋后切片,依次將切片放入二甲苯-無水乙醇-75 %乙醇脫蠟至水,自來水沖洗,固綠染液5～10 min,洗去多余染液,至軟骨呈無色,分化液稍浸泡,自來水稍洗后加入番紅染液15～30 s,使用無水乙醇快速脫水,二甲苯透明5 min,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察軟骨組織病理變化并拍照,并進(jìn)行Mankin評(píng)分[9]。

1.2.5關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、COX-2水平檢測(cè):末次給藥24 h,大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔穿刺取關(guān)節(jié)液,并用0.1 mL生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔,將關(guān)節(jié)液與沖洗液合并,3 000 g離心15 min,留取上清液,-80 ℃保存。根據(jù)TNF-α、IL-1β、COX-2試劑盒說明書分別配制TNF-α、IL-1β、COX-2標(biāo)準(zhǔn)品溶液,解凍關(guān)節(jié)液樣本,使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)TNF-α、IL-1β、COX-2標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及關(guān)節(jié)液在450 nm處的吸光度,繪制TNF-α、IL-1β、COX-2標(biāo)準(zhǔn)品曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品回歸曲線方程,計(jì)算TNF-α、IL-1β、COX-2水平。

1.2.6免疫組化檢測(cè)軟骨組織IL-1β、MMP-13蛋白:軟骨組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、山羊血清封閉、加入IL-1β(1∶1 000)、MMP-13(1∶1 000)一抗稀釋液,4 ℃孵育過夜,加羊抗兔二抗(1∶1 000)37 ℃孵育60 min,PBS洗滌后DAB顯色,蘇木精復(fù)染,以細(xì)胞中出現(xiàn)黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá),采用Image-Pro Plus 6.0分析吸光度值。

1.2.7Western blot檢測(cè)蛋白:各組大鼠取軟骨組織勻漿后加入RIPA裂解液提取總蛋白,采用Western blot法檢測(cè)蛋白,p-AMPK、AMPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65及β-actin一抗按照1∶1 000稀釋,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗按照1∶1 500稀釋,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,以β-actin為內(nèi)參,采用Image-QuaNT 軟件測(cè)量其吸光度,分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度

與Sham組比較,給藥第14、28 d后KOA組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度顯著增加(P<0.05);與KOA組比較,給藥第14、28 d后Ephedrine組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度顯著降低(P<0.05);與Ephedrine組比較,Ephedrine+ Compound C組給藥第14、28 d后大鼠膝關(guān)節(jié)寬度顯著增加(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度比較

2.2 各組大鼠疼痛閾值

與Sham組比較,給藥第14、28 d后KOA組大鼠疼痛閾值顯著降低P<0.05);與KOA組比較,給藥第14、28 d后Ephedrine組大鼠疼痛閾值顯著升高(P<0.05);與Ephedrine組比較,給藥第14 、28 d后Ephedrine+Compound C組大鼠疼痛閾值顯著降低(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠疼痛閾值比較

2.3 各組大鼠軟骨組織病理變化及Mankin評(píng)分

Sham組軟骨組織結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞分布均勻,潮線清晰;KOA組軟骨組織損傷嚴(yán)重,結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,細(xì)胞聚集,潮線模糊不清,Mankin評(píng)分較Sham組升高(P<0.05);Ephedrine組軟骨損傷明顯改善,軟骨組織結(jié)構(gòu)較完整、清晰,Mankin評(píng)分較KOA組顯著降低(P<0.05);Ephedrine+ Compound C組軟骨組織損傷較Ephedrine組加重,軟骨細(xì)胞聚集增多,潮線模糊,Mankin評(píng)分較Ephedrine組升高(P<0.05),見圖1與表3。

圖1 各組大鼠軟骨組織病理變化(番紅O-固綠染色)Fig.1 Pathological changes of cartilage tissue of rats in each group (safranine O-solid green staining)

表3 各組大鼠Mankin評(píng)分比較(分,

2.4 各組大鼠關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、COX-2水平

與Sham組比較,KOA組大鼠關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、COX-2水平顯著升高(P<0.05);與KOA組比較,Ephedrine組關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、COX-2水平顯著降低(P<0.05);與Ephedrine組比較,Ephedrine+ Compound C組關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、COX-2水平顯著升高(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、COX-2水平比較

2.5 各組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-13蛋白表達(dá)

Sham組軟骨組織僅有少量IL-1β、MMP-13蛋白陽(yáng)性表達(dá),與Sham組比較,KOA組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-13陽(yáng)性表達(dá)顆粒增多,IL-1β、MMP-13光密度值顯著升高(P<0.05);與KOA組比較,Ephedrine組IL-1β、MMP-13陽(yáng)性表達(dá)顆粒減少,IL-1β、MMP-13光密度值顯著降低(P<0.05);與Ephedrine組比較,Ephedrine+ Compound C組IL-1β、MMP-13陽(yáng)性表達(dá)顆粒增多,IL-1β、MMP-13光密度值顯著升高(P<0.05),見圖2與表5。

圖2 各組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-13蛋白表達(dá)(免疫組化,200×)Fig.2 IL-1β, MMP-13 protein expression of rat cartilage in each group (immunohistochemistry,200×)

表5 各組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-13蛋白表達(dá)(光密度值,

2.6 各組軟骨組織AMPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示,與Sham組比較,KOA組大鼠軟骨組織p-AMPK/AMPK水平顯著降低,p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著升高(P<0.05);與KOA組比較,Ephedrine組p-AMPK/AMPK水平顯著升高,p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著降低(P<0.05);與Ephedrine組比較,Ephedrine+Compound C組p-AMPK/AMPK水平顯著降低,p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著升高(P<0.05),見圖3與表6。

注:A:Sham group;B:KOA group;C:Ephedrine group;D:Ephedrine+Compound C group。圖3 Western blot檢測(cè)p-AMPK、AMPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)Fig.3 p-AMPK, AMPK, p-NF-κB p65 and NF-κB p65 proteins expression were detected by Western blot

表6 各組大鼠軟骨組織AMPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生病變及結(jié)構(gòu)破壞為KOA主要病理表現(xiàn)之一,軟骨損傷后自我修復(fù)能力較差,進(jìn)而影響膝關(guān)節(jié)活動(dòng)功能,軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解與細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致KOA軟骨降低[10]。

目前KOA的治療主要包括物理治療與藥物治療,但只能緩解癥狀,不能根治,因此尋找有效治療藥物具有重要意義。麻黃具有利尿、鎮(zhèn)咳、平喘、解熱、升高血壓與興奮中樞神經(jīng)等多種藥理學(xué)作用,麻黃堿是中藥麻黃的主要成分,在呼吸系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有廣泛的應(yīng)用[11]。研究顯示,麻黃堿與瑞帕林II聯(lián)合治療可減少哮喘大鼠氣道重塑和炎癥反應(yīng),改善哮喘大鼠肺組織高反應(yīng)性[12]。本研究給予KOA大鼠麻黃堿干預(yù)后,大鼠軟骨組織病理?yè)p傷減輕,膝關(guān)節(jié)寬度顯著降低,疼痛閾值顯著升高,提示麻黃堿可有效改善KOA癥狀與病理?yè)p傷。

炎癥與KOA的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),關(guān)節(jié)囊滑膜組織和關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥因子如IL-1β、TNF-α促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解,加速軟骨破壞,促進(jìn)KOA進(jìn)程[13]。IL-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)可誘導(dǎo)COX-2與MMP-13大量表達(dá),COX-2可與前列腺素合成酶(PGES)結(jié)合形成PGE-2,促進(jìn)關(guān)節(jié)腫脹與血管擴(kuò)張,導(dǎo)致疼痛產(chǎn)生,MMP-13可降解軟骨基質(zhì)中的CollagenⅡ,誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞變性凋亡,破壞軟骨完整性[14]。本研究給予大鼠麻黃堿干預(yù)后,大鼠關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、COX-2水平及軟骨組織IL-1β、MMP-13表達(dá)水平顯著降低,提示麻黃堿通過抑制炎癥反應(yīng)改善KOA大鼠軟骨病理?yè)p傷。已有研究證實(shí),抑制炎性因子釋放,可改善關(guān)節(jié)軟骨代謝,促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)[15]。本研究亦印證這一觀點(diǎn)。

AMPK/NF-κB信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng),AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,可抑制氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng),在軟骨細(xì)胞中,AMPK可通過調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)(如PGC-1α、SIRT1)增強(qiáng)軟骨細(xì)胞線粒體生物合成和功能,抑制軟骨細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激增強(qiáng)細(xì)胞活性,在關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中AMPK活性降低[16]。NF-κB信號(hào)通路是一種炎癥性通路,AMPK通過下調(diào)NF-κB抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子分泌,抑制軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng),促進(jìn)軟骨修復(fù)[17]。研究顯示,茶黃素通過調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/NF-κB信號(hào)通路,抑制炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激,對(duì)KOA大鼠起治療作用[18]。本研究結(jié)果顯示,麻黃堿可激活A(yù)MPK通路,抑制NF-κB信號(hào)通路,提示麻黃堿可能通過調(diào)節(jié)AMPK/NF-κB信號(hào)通路改善大鼠KOA。Shi等[19]研究顯示,麻黃堿通過抑制NF-κB信號(hào)通路,降低炎癥反應(yīng),減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷。本研究亦證實(shí)麻黃堿可抑制NF-κB信號(hào)通路激活。此外,給予KOA大鼠AMPK抑制劑Compound C后,大鼠軟骨組織損傷加重,炎癥因子水平增加,麻黃堿改善KOA的作用被部分逆轉(zhuǎn),證實(shí)麻黃堿通過激活A(yù)MPK通路抑制NF-κB信號(hào)通路,抑制炎癥反應(yīng),改善KOA大鼠軟骨炎性損傷。

綜上所述,麻黃堿通過激活A(yù)MPK通路,抑制NF-κB信號(hào)通路,抑制炎癥反應(yīng),改善KOA大鼠軟骨損傷,麻黃堿可能成為治療KOA的潛在藥物。