陳筱瑜，馮玉天嬌，吳少嬡，黃慶德*

（1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，福建 福州 350101；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

創(chuàng)面愈合是機(jī)體皮膚遭受外力作用造成損傷后的修復(fù)愈合過程，整個過程由多種因素共同參與調(diào)控，復(fù)雜且有序，通常分為3 個階段：止血與炎癥期、組織形成期以及組織重塑期［1-2］。黃芪具有解毒生肌的功效，能夠改善皮膚狀態(tài)，在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面療效良好［3-4］。黃芪甲苷是黃芪主要的藥理活性成分之一，具有抗炎、抗衰老、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等多方面的藥理作用［5］?，F(xiàn)代研究表明黃芪甲苷在創(chuàng)面修復(fù)以及抑制瘢痕形成過程具有重要作用［6-8］。陳希［9］研究表明：黃芪甲苷可促進(jìn)皮膚膠原蛋白的有序排列、血管新生、降低Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原的比例，可增加角化細(xì)胞的增殖遷移能力，促進(jìn)創(chuàng)面?zhèn)诘挠?，同時增加創(chuàng)傷部位的皮膚張力，使創(chuàng)面皮膚恢復(fù)為正常的組織。黃芪甲苷為難溶性成分［10］，難以透過表皮和在真皮層達(dá)到有效濃度，將其制成二元醇質(zhì)體可增加藥物的透皮吸收和藥物在皮膚中的滯留量［11］。但二元醇質(zhì)體黏度較低，單獨使用時很難使藥物在皮膚表面長時間滯留，且不能形成封閉的保護(hù)膜，不利于傷口的愈合。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，將黃芪甲苷二元醇質(zhì)體制備為凝膠，并初步考察其穩(wěn)定性、皮膚刺激性、體外釋放度及對大鼠創(chuàng)面愈合的影響，為后期的產(chǎn)品開發(fā)提供實驗數(shù)據(jù)。

1 實驗材料和儀器

1.1 實驗動物 SD 大鼠，清潔級，雄性，體質(zhì)量200～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0005；普通新西蘭兔，雄性，體質(zhì)量2.3～2.5 kg，購自上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場，實驗動物使用許可證號為SCXK（滬）2017-0008。實驗前均于飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。清潔級醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施由福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 實驗儀器 ACQUITY UPLC?TOD system 超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；ACQUITY UPLC?BEH C18 超高效液相色譜柱（美國Waters 公司）；透皮擴(kuò)散試驗儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司，型號：TK-12D）；恒溫磁力攪拌器（常州市金壇大地自動化儀器廠，型號：MPLR-702）；高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司，型號：Centrifuge 5418）；蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司，型號：BT100-1F）；pH酸度儀（美國OHAUS 公司，型號：STARTER3100）；萬分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號：FA2004N）；十萬分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號：XS205］；透析袋（北京索萊寶科技有限公司，型號：MD34）。

1.3 實驗試劑 黃芪甲苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：J25F10T81373，純度≥98%）；黃芪甲苷二元醇質(zhì)體（自制）［12］；橡皮生肌膏（天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，批號：206615）；卡波姆934（批號：B22A11F122191）、卡波姆940（批號：J14GS154671）、卡波姆980（批號：S18D10X106090）均購自上海源葉生物科技有限公司；羧甲基殼聚糖（青島舜博生物技術(shù)研究所有限公司，批號：210412）；甲酸、水、甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠的制備

2.1.1 凝膠的制備方法 稱取0.2 g 羧甲基殼聚糖溶解于100 mL 純化水中，將1.0 g 卡波姆均勻撒在上述純化水上，于4 ℃冰箱內(nèi)靜置過夜，使其充分溶脹，溶脹后用適量三乙醇胺調(diào)節(jié)pH 值至中性，即得空白凝膠基質(zhì)；按照1∶1 的比例將凝膠基質(zhì)與黃芪甲苷二元醇質(zhì)體均勻混合，即得黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠。

2.1.2 凝膠基質(zhì)種類的篩選 分別稱取1.0 g 卡波姆934、卡波姆940、卡波姆980，按照“2.1.1”項下方法制備黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠，根據(jù)凝膠外觀、黏稠度、涂展性和穩(wěn)定性分為優(yōu)（1.5～2.0分）、良（1.0～1.5分）、中（0.5～1.0 分）和差（0～0.5 分）4 個等級進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1，評分結(jié)果見表2。結(jié)果表明：使用卡波姆980 作為凝膠基質(zhì)時，與二元醇質(zhì)體混合無法形成凝膠；而卡波姆940 作為凝膠基質(zhì)制備的凝膠過于黏稠，較難涂抺；卡波姆934 制備的凝膠評分最高，且涂展性好，具有一定的光澤性，可作為凝膠基質(zhì)。

表1 凝膠評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 3 種基質(zhì)制備的凝膠綜合評分比較 分

2.1.3 卡波姆934 用量的篩選 按照“2.1.1”項下方法分別制備含卡波姆934 基質(zhì)0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、3.0%和4.0%的空白凝膠基質(zhì)，按照1∶1 的比例將凝膠基質(zhì)與黃芪甲苷二元醇質(zhì)體混合均勻。取制備好的凝膠置于離心管中，用離心機(jī)以4 000 r/min離心30 min，按照表1 的評分標(biāo)準(zhǔn)考察制備凝膠的外觀、涂展性、黏稠度和穩(wěn)定性，并進(jìn)行綜合評分。結(jié)果表明：卡波姆934 基質(zhì)的用量對凝膠的離心穩(wěn)定性幾乎沒有影響；但隨著基質(zhì)含量的增加，制備的凝膠黏稠度增加，涂展性變差；空白凝膠基質(zhì)中卡波姆934 含量為1.6%時，黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠的綜合評分最高。評分結(jié)果見表3。

表3 卡波姆934 不同用量制備的凝膠綜合評分結(jié)果 分

2.1.4 卡波姆934 與黃芪甲苷二元醇質(zhì)體比例的篩選 按照“2.1.1”項下方法分別制備含卡波姆934 不同濃度的空白凝膠基質(zhì)，與黃芪甲苷二元醇質(zhì)體以1∶9、2∶8、3∶7、4∶6 和5∶5 的比例混合制備黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠，每份凝膠中均含0.8 %卡波姆934 和0.2 %羧甲基殼聚糖，按照表1 的評分標(biāo)準(zhǔn)評分，卡波姆934 與黃芪甲苷二元醇質(zhì)體不同比例制備的凝膠評分基本一致，均為7.5 分左右。為增加凝膠中含藥量，最終選擇卡波姆934 與黃芪甲苷二元醇質(zhì)體的比例為1∶9，即黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠的處方為：羧甲基殼聚糖0.2%、卡波姆934 0.8%、黃芪甲苷二元醇質(zhì)體90.0%、純化水9.0%。

2.2 黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠的質(zhì)量評價

2.2.1 離心穩(wěn)定性 取黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠適量，置于離心管中，分別于4 000、12 000 r/min 離心15 min，平行3 份，觀察其外觀形態(tài)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠均無分層現(xiàn)象，外觀、涂展性、穩(wěn)定性和黏稠度無明顯變化，說明黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠在低速和高速離心狀態(tài)下物理穩(wěn)定性良好。

2.2.2 黃芪甲二元醇質(zhì)體凝膠的皮膚刺激性考察 取3 只新西蘭兔，分別在其背部劃定4 個區(qū)域，均予脫毛處理；用1 g 左右的黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠分別涂抹在其中3 個不同區(qū)域，輕揉10 s，再使用無刺激性的紗布和膠布加以固定；在另一區(qū)域涂抹生理鹽水后直接用無刺激性的紗布和膠布加以固定。給藥4 h 后，擦去殘留凝膠劑，用溫水擦洗干凈。于藥物清除后1、24、48、72 h 觀察涂抹部位紅腫及紅斑情況。結(jié)果顯示：涂抹黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠的背部皮膚部位均未出現(xiàn)紅腫和紅斑，與生理鹽水涂抹皮膚比較無明顯差異，說明黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠對皮膚無刺激性，可用于皮膚給藥。

2.2.3 黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠的體外釋放度考察 以含0.25%聚山梨酯80 的PBS（pH 值7.4）為接收液，將活化后的透析袋（截留相對分子量為6 000～8 000 U）剪成半透膜，固定在供給池和接收池之間，精密稱定黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠1 g 加入到供給池中，使其均勻分布于半透膜表面，接收池中加入8 mL 接收液，擴(kuò)散池溫度（37±0.5）℃，磁力攪拌的速度為200 r/min。分別于0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24、36、60 h 取樣100 μL 于5 mL 量瓶中，同時在接受池中補充相同溫度的接收液100 μL，將取得的樣品溶液加50%甲醇稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜濾過，采用UPLC-MS/MS 法測定樣品中黃芪甲苷的含量［13］，計算黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠中黃芪甲苷的累積釋放率（Qn），計算公式如下。

注：Q0為黃芪甲苷總的藥物含量；V0為釋放介質(zhì)總體積（8 mL）；V為每次取樣時的體積（100 μL）；Ci為各取樣點藥物質(zhì)量濃度（μg/mL）；i、n為取樣次數(shù)。

以釋放時間（t）為橫坐標(biāo)（X），以黃芪甲苷累積釋放率（Qn）為縱坐標(biāo)（Y），繪制黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠體外釋放曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠體外釋放曲線

2.2.4 黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠的體外釋放行為分析 采用零級釋藥模型、一級釋藥模型和Higuchi 釋藥模型對“2.2.3”項下黃芪甲苷的累積釋放率進(jìn)行釋藥行為擬合分析，見表4。結(jié)果表明：黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠中黃芪甲苷的體外釋放機(jī)制均符合Higuchi 釋藥模型，r為0.993 9，說明黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠釋藥過程為溶蝕與擴(kuò)散共同作用。

表4 黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠體外釋藥曲線擬合結(jié)果

2.3 黃芪甲二元醇質(zhì)體凝膠對大鼠皮膚創(chuàng)面愈合作用的初步考察

2.3.1 大鼠皮膚創(chuàng)面模型建立 將18 只SD 大鼠隨機(jī)分成空白對照組、黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠組和橡皮生肌膏組，每組6 只。將3 組SD 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，用刮毛刀剃去背部毛發(fā)，使用脫毛膏脫細(xì)毛；24 h 后再次麻醉，采用碘伏對大鼠背部皮膚消毒后用打孔器在背部制造出直徑為1 cm 的圓形創(chuàng)面，碘伏對創(chuàng)面邊緣進(jìn)行消毒，建立創(chuàng)面模型。

2.3.2 動物給藥及創(chuàng)面愈合率比較 創(chuàng)面形成30 min后開始給藥：黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠組、橡皮生肌膏組分別將黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠、橡皮生肌膏涂抹于無菌紗布（寬度以超過創(chuàng)面邊緣2 mm 為宜）后覆蓋創(chuàng)面，使藥物與創(chuàng)面充分接觸；空白對照組將生理鹽水噴濕無菌紗布后覆蓋創(chuàng)面，每2 d 給藥1 次，療程20 d。于給藥前（第0 天）及給藥后第3、7、11、15、19 天對創(chuàng)面拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析計算創(chuàng)面面積和創(chuàng)面愈合率，應(yīng)用SPSS 25.0 軟件對創(chuàng)面愈合率數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。3 組大鼠給藥后各時間點創(chuàng)面圖像見圖2，3組大鼠給藥后各時間點創(chuàng)面愈合率比較見表5。創(chuàng)面愈合率計算公式：

圖2 3 組大鼠給藥后各時間點創(chuàng)面圖像

表5 3 組大鼠給藥后各時間點創(chuàng)面愈合率比較（±s）

表5 3 組大鼠給藥后各時間點創(chuàng)面愈合率比較（±s）

注：與空白對照組比較，1） P＜0.01。

第19天86.46±2.12 94.30±0.791）98.15±0.491）組別空白對照組黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠組橡皮生肌膏組n6 6 6第3天13.57±1.30 36.39±2.691）42.11±1.881）第7天26.49±2.40 57.32±1.431）62.16±3.371）第11天55.98±3.45 76.25±2.141）83.22±2.821）第15天73.40±2.83 86.05±2.331）95.34±0.581）

創(chuàng)面愈合率＝（給藥前創(chuàng)面面積－第n 天創(chuàng)面面積）/給藥前創(chuàng)面面積×100%

由表5可知：黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠組和橡皮生肌膏組創(chuàng)面愈合率與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明黃芪甲苷制成二元醇質(zhì)體凝膠及橡皮生肌膏組均能促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。

3 討 論

在進(jìn)行黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠體外釋放度考察時，由于HPLC-ELSD 方法無法測定較低濃度樣品中的黃芪甲苷含量，所以本實驗采用實驗室前期建立的黃芪甲苷UPLC-MS/MS 測定方法中的色譜條件和質(zhì)譜條件［13］測定釋放介質(zhì)中藥物濃度，并對方法專屬性試驗、加樣回收率試驗等項目進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果均符合規(guī)定。

橡皮生肌膏源自明代外科大家陳實功的《外科正宗》，具有潤膚生肌、祛腐生新、解毒鎮(zhèn)痛、活血化瘀、消炎長皮的功效，有利于加強(qiáng)局部抗感染能力，加快瘢痕組織軟化，促進(jìn)瘢痕吸收，對促進(jìn)創(chuàng)面愈合具有很好效果［14］，所以本實驗選擇橡皮生肌膏作為陽性對照組藥物。

大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的初步考察試驗表明，黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠組及橡皮生肌膏組均能促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)面愈合，且2 組效果相當(dāng)，分析原因可能是黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠應(yīng)用二元醇質(zhì)體技術(shù)可以增加黃芪甲苷在皮膚中的滯留量。且凝膠處方中添加的羧甲基殼聚糖，是殼聚糖在強(qiáng)堿性條件下與氯乙酸反應(yīng)，并在分子結(jié)構(gòu)中導(dǎo)入羧甲基形成的衍生物，幾乎為無定形狀態(tài)，因此具有良好的水溶性，可以單獨或與卡波姆等其他成分共同用作凝膠劑的基質(zhì)［15］。有研究表明：高、低分子量的羧甲基殼聚糖組均可以有效促進(jìn)傷口愈合，創(chuàng)面愈合時間比生理鹽水對照組縮短了41%，且沒有明顯的炎癥或感染現(xiàn)象，具有良好的促創(chuàng)面愈合作用［16］。細(xì)胞水平實驗表明：羧甲基殼聚糖可以減少皮膚傷口處的膠原分泌，有助于減少瘢痕的形成［17］，這可能是黃芪甲苷二元醇質(zhì)體凝膠組能促進(jìn)創(chuàng)面愈合的原因。