龍媛媛，于顧然

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病中心，江蘇 南京 210029）

阿爾茨海默?。ˋizheimer's disease，AD）是最常見(jiàn)的老年癡呆類型，發(fā)病機(jī)制尚不明確，主流學(xué)說(shuō)有β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)和Tau 蛋白異常磷酸化學(xué)說(shuō)，但針對(duì)Aβ 或Tau 蛋白所開(kāi)發(fā)的新藥和相關(guān)臨床試驗(yàn)大多以失敗告終。AD 在中醫(yī)學(xué)屬于“癡呆”范疇，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本病以腎虛為本，腎精不足，髓海虧虛，則易釀生癡呆，故補(bǔ)腎益精是主要治則。五子衍宗丸為古代補(bǔ)腎名方，明代《攝生眾妙方》記載其由車前子、枸杞子、北五味子、覆盆子、菟絲子組成，全方共奏補(bǔ)腎益精之功，近來(lái)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用日益增加［1］。臨床上許多醫(yī)家運(yùn)用其加減化裁治療AD，取得了良好的效果，有延緩AD 病情進(jìn)展的作用［2-3］。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：五子衍宗方對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有改善，可以減輕氧化損傷，加味五子衍宗方可以減輕Aβ25-35致PC12 細(xì)胞的Tau 蛋白高度磷酸化，并有效改善AD 大鼠的行為學(xué)癥狀［4-6］。然而五子衍宗丸目前治療AD 作用機(jī)制尚不完全清晰，本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘五子衍宗丸治療AD 的活性成分和作用靶點(diǎn)，期望探索其抗AD 的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供思路和依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 獲取五子衍宗丸活性成分及作用靶點(diǎn) 在TCMSP 數(shù)據(jù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［7］分別以“車前子”“枸杞子”“北五味子”“覆盆子”“菟絲子”為關(guān)鍵詞檢索其活性成分，設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%以及類藥性（DL）≥0.18，并去除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分，去重后合并得到五子衍宗丸活性成分。然后在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中查找活性成分并下載相應(yīng)smile 結(jié)構(gòu)式文件，將其上傳至SwissTargetPredicition 平臺(tái)［8］，物種名設(shè)為“Homo sapiens”，依次檢索并下載其作用靶點(diǎn)的Excel 數(shù)據(jù)表，篩選Possibility＞0 的作用靶點(diǎn)。若活性成分在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)相關(guān)作用靶點(diǎn)，則使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中該活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，并利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）對(duì)作用靶點(diǎn)的基因名稱進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.2 獲取AD 的疾病靶點(diǎn) 以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞在GeneCards［9］（https：//www.genecards.org/）、OMIM［10］（https：//omim.org/）、DrugBank［11］（https：//go.drugbank.com/）、TTD［12］（http：//db.idrblab.net）數(shù) 據(jù)庫(kù)中分別進(jìn)行檢索，并在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)置疾病靶點(diǎn)的相關(guān)度分?jǐn)?shù)（relevance score）≥15，其余數(shù)據(jù)庫(kù)均保留檢索得到的全部疾病靶點(diǎn)，合并上述4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果，并刪除重復(fù)疾病靶點(diǎn)，最終得到AD 的疾病靶點(diǎn)。

1.3 五子衍宗丸治療AD 的靶點(diǎn)篩選 利用在線工具Venny 2.1.0（http：//www.bioinformatics.com.cn/）將五子衍宗丸活性成分的作用靶點(diǎn)與AD 的疾病靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，篩選得到二者的交集靶點(diǎn)即為五子衍宗丸治療AD 的靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建“中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并篩選關(guān)鍵成分 剔除與交集靶點(diǎn)無(wú)作用關(guān)系的活性成分，將剩下的活性成分與中藥、交集靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)得到Excel 格式的網(wǎng)絡(luò)文件，并對(duì)中藥、活性成分、交集靶點(diǎn)進(jìn)行定義，得到Excel 格式的屬性文件，將二者同時(shí)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件［13］中建立“中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。后借助Cytoscape 3.9.1軟件中的內(nèi)置插件CytoNCA 篩選關(guān)鍵成分，考慮拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)度值排名前10 的成分可能為五子衍宗丸治療AD 作用的關(guān)鍵成分。

1.5 構(gòu)建蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖并篩選關(guān)鍵靶點(diǎn) 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)［14］（https：//cn.string-db.org/），所有參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，導(dǎo)出TSV格式結(jié)果文件，并利用Cytoscape 3.9.1優(yōu)化PPI網(wǎng)絡(luò)。后借助CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，獲取中介中心性、接近中心性及度值3 個(gè)參數(shù)，以同時(shí)大于上述參數(shù)的中位數(shù)作為篩選條件，先后對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行2 次篩選，最終得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 在matespace數(shù)據(jù)庫(kù)［15］（https：//metascape.org/）中，設(shè)置物種為“Homo Sapiens”，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行包括生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能在內(nèi)的基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析。利用微生信平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對(duì)GO 功能富集分析得到的生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能中基因數(shù)排名前10 的條目及KEGG通路富集分析得到的基因數(shù)排名前20 的條目進(jìn)行可視化處理。

1.7 分子對(duì)接 選取五子衍宗丸部分關(guān)鍵成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，并使用PyMOL 軟件移除蛋白上的水分子及小分子配體。通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取關(guān)鍵成分的二維結(jié)構(gòu)，再利用Chembio3D軟件轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)。在AutoDock Tools 1.5.6 軟件中將處理過(guò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)及關(guān)鍵成分轉(zhuǎn)化為pdbqt格式，進(jìn)行加氫處理，分別設(shè)置為受體及配體并定義扭轉(zhuǎn)鍵，接著設(shè)置對(duì)接盒子運(yùn)行autogrid 程序，將運(yùn)行次數(shù)設(shè)為50 次，運(yùn)行AutoDock 程序?qū)崿F(xiàn)分子對(duì)接，并將結(jié)果導(dǎo)出，利用PyMOL 軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)接結(jié)果的可視化。

2 結(jié) 果

2.1 五子衍宗丸活性成分及作用靶點(diǎn) 通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行篩選顯示車前子、覆盆子、枸杞子、菟絲子、北五味子分別有8、7、38、10、8 個(gè)活性成分，去重合并后得到五子衍宗丸共63 個(gè)活性成分；通過(guò)SwissTargetPredicition、TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共預(yù)測(cè)到活性成分有534 個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.2 AD 的疾病靶點(diǎn) 通過(guò) GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)分別篩選得到853、87、543、145個(gè)AD 的疾病靶點(diǎn)，去重合并后共得到1 466 個(gè)AD的疾病靶點(diǎn)。

2.3 五子衍宗丸治療AD 的靶點(diǎn) 通過(guò)在線工具Venny 2.1.0 將五子衍宗丸活性成分的作用靶點(diǎn)與AD 的疾病靶點(diǎn)取交集，共得到168 個(gè)交集靶點(diǎn)，并繪制得到韋恩圖，見(jiàn)圖1。

圖1 五子衍宗丸治療AD 的靶點(diǎn)篩選

2.4 “中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 剔除掉與交集靶點(diǎn)無(wú)作用關(guān)系的16 個(gè)活性成分后，將剩下的47 個(gè)活性成分與168 個(gè)交集靶點(diǎn)及5 味中藥一一對(duì)應(yīng)，利用Cytoscape3.9.1 軟件搭建了一個(gè)含有220 個(gè)節(jié)點(diǎn)，827 條邊的“中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。圖中節(jié)點(diǎn)越大表示度值越高，選取度值排名前10 的為五子衍宗丸治療AD 關(guān)鍵成分，見(jiàn)表1。其中，車前素、槲皮素、歐前胡素、異鼠李素等成分度值較高，提示可能在治療AD 中起重要作用。

表1 五子衍宗丸治療AD 關(guān)鍵成分

圖2 “中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò) 將168 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到TSV 文件格式，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1中進(jìn)一步優(yōu)化得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。借助CytoNCA插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，獲取中介中心性、接近中心性、度值等參數(shù)進(jìn)行篩選，共得到18 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中腫瘤壞死因子（TNF）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）值排名靠前，可能在治療AD 中發(fā)揮關(guān)鍵作用，見(jiàn)表2。

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

圖3 交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 GO 富集分析得到相關(guān)條目共2 418 條，其中生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能的條目分別為2 046、244、128 條，根據(jù)P值大小篩選出各部分排名前10 的條目進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖4。其中，生物過(guò)程主要涉及了細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、對(duì)激素的反應(yīng)分泌調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組分主要涉及膜筏、樹(shù)突、突觸后、受體復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)等；分子功能主要涉及G 蛋白耦聯(lián)受體信號(hào)通路、蛋白激酶活性、激酶結(jié)合、核受體活性等。KEGG 通路富集分析得到203 條通路，選擇富集程度最高的前20 條通路繪制氣泡圖，提示主要富集在阿爾茨海默病、2 型糖尿病、高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物-受體（AGE-RAGE）、Janus 激酶-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（JAK-STAT）、核因子kappa B （NF-κB）、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸等信號(hào)通路上，見(jiàn)圖5。

圖4 交集靶點(diǎn)GO 功能富集分析圖

圖5 交集靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析圖

2.7 分子對(duì)接結(jié)果 將關(guān)鍵成分高車前素、槲皮素、歐前胡素、異鼠李素分別與關(guān)鍵靶點(diǎn)TNF、AKT1、IL-6進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表3。一般認(rèn)為結(jié)合能越低對(duì)接效果越好，結(jié)合能小于-5 kcal/mol時(shí)，配體與受體可較好結(jié)合，小于-7.0 kcal/mol 時(shí)則具有更強(qiáng)的結(jié)合活性［16］。由表3 可知：上述五子衍宗丸關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性。選擇結(jié)合能最低的歐前胡素與TNF 對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖6。

表3 分子對(duì)接結(jié)果

圖6 歐前胡素與TNF 分子對(duì)接圖

3 討 論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出五子衍宗丸的大部分關(guān)鍵成分，經(jīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明這些成分具有治療AD 的潛力。高車前素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，LIN 等［17］發(fā)現(xiàn)在大鼠驚厥模型中，高車前素可抑制海馬區(qū)促炎因子生成，如IL-6 和TNF-α等。槲皮素可以通過(guò)減輕氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥來(lái)保護(hù)神經(jīng)元，同時(shí)抑制Aβ 聚集及Tau 蛋白磷酸化，抑制乙酰膽堿酯酶活性從而減少乙酰膽堿水解等方式發(fā)揮抗AD 特性［18-20］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)歐前胡素可減輕AD 小鼠海馬組織的氧化應(yīng)激損傷［21］，并可通過(guò)抑制Smac/DIABLO 信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體途徑減少AD 小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡［22］。異鼠李素可減少Aβ 激活的IL-6 分泌，并通過(guò)介導(dǎo)神經(jīng)炎癥IL-6/TYK2 信號(hào)通路發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，提示其具有治療AD 的潛力［23］。

PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示TNF、AKT1、IL-6 等靶點(diǎn)度值排名靠前，考慮是治療AD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在AD 病理機(jī)制研究中，神經(jīng)炎癥的作用越來(lái)越受到重視。TNF 參與許多全身性慢性炎癥和退行性疾病，是神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)之一。其中，TNF-α 可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子分泌，上調(diào)β-分泌酶和γ-分泌酶活性，加劇Aβ 生成，引起突觸功能障礙，導(dǎo)致認(rèn)知能力下降［24］；IL-6作為促炎因子，與TNF 在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮協(xié)同作用，還可激活JAK/STAT 通路，調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，加重神經(jīng)炎癥［25］。AKT1 在調(diào)控細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要的作用，在AD 早期階段，突觸上活性氧（ROS）介導(dǎo)的AKT1 氧化導(dǎo)致活性依賴蛋白翻譯障礙，可引起突觸功能失調(diào)［26］。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示：五子衍宗丸主要通過(guò)膜筏、樹(shù)突、突觸后、受體復(fù)合物等細(xì)胞成分參與磷酸化正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程，發(fā)揮激酶結(jié)合、核受體活性等分子功能。分子對(duì)接結(jié)果表明高車前素、槲皮素、歐前胡素、異鼠李素均與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合良好，驗(yàn)證了本研究的可靠性。

KEGG 通路富集分析主要富集在阿爾茨海默病、2 型糖尿病、AGE-RAGE、JAK-STAT、NF-κB、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸等信號(hào)通路上。五子衍宗丸治療AD 的信號(hào)通路富集在阿爾茨海默病上體現(xiàn)了五子衍宗丸治療AD 的靶向性。此外，信號(hào)通路富集也在2 型糖尿病上，有研究者稱AD 為3型糖尿病，二者存在許多共同致病機(jī)制，如胰島素抵抗、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）、線粒體功能障礙等［27］。AGE-RAGE 信號(hào)通路與AD 密切相關(guān)，研究表明AD 患者AGEs 及其受體RAGE 水平升高，介導(dǎo)ROS、NF-κB 及細(xì)胞因子生成增加，NF-κB 和細(xì)胞因子又促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生，ROS 水平過(guò)高可導(dǎo)致神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷、Aβ斑塊形成而促進(jìn)AD 進(jìn)展［28］。JAK/STAT 通路與細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡密切相關(guān)，涵蓋4個(gè)JAK蛋白家族成員和7 個(gè)STAT 蛋白家族成員，其中JAK2-STAT3 主要在腦組織表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)抑制該通路可減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞極化、星形膠質(zhì)細(xì)胞異常增生從而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)［25］。NF-κB 是一種調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控炎癥因子產(chǎn)生，在AD 患者腦內(nèi)主要分布在Aβ 斑塊周圍的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，Aβ 聚集增加持續(xù)激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子，促炎因子進(jìn)一步激活NFκB 信號(hào)通路，釋放大量炎癥因子，形成惡性循環(huán)，抑制該通路可減輕神經(jīng)炎癥［29］。突觸與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)，研究表明突觸丟失、突觸功能紊亂在AD 患者中表現(xiàn)十分明顯。5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸均在神經(jīng)遞質(zhì)協(xié)調(diào)、記憶鞏固的過(guò)程中起著重要的生物學(xué)作用［30-31］，因此相關(guān)信號(hào)通路失調(diào)可能是AD 發(fā)生及進(jìn)展的原因之一。

綜上，五子衍宗丸可能通過(guò)改善神經(jīng)炎癥、減輕氧化應(yīng)激、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)突觸功能等多種機(jī)制來(lái)發(fā)揮治療AD 的作用。本研究為進(jìn)一步治療AD 提供了新的用藥思路，但是，本研究仍然存在許多局限性，例如中藥在煎煮時(shí)及在體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的化學(xué)變化，本研究未將五子衍宗丸煎煮后的化學(xué)成分以及在體內(nèi)的代謝后的產(chǎn)物納入分析，有待進(jìn)一步完善，后續(xù)將通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。