李文麗 侯小超 孫會(huì)媛 黃學(xué)者 李 巖， 崔宗巖， 張進(jìn)杰

（1燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北 秦皇島 066004）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜味物質(zhì)［1］。蜂蜜的種類(lèi)繁多，受植物的來(lái)源和地域影響，其在成分、色澤、口感等方面都會(huì)有一定的差異，進(jìn)而影響蜂蜜的品質(zhì)和價(jià)格［2］。近年來(lái)，一些不法商家為了獲得更高的利潤(rùn)，將低價(jià)蜂蜜摻入高價(jià)蜂蜜中進(jìn)行售賣(mài)，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益。油菜蜜作為我國(guó)年產(chǎn)量最大、最穩(wěn)定的單花種蜂蜜［3］，成為了不法商家摻雜的首選，如將其摻入洋槐蜜、椴樹(shù)蜜等蜂蜜中出售［4］。目前，國(guó)內(nèi)外常用的單花種蜂蜜的鑒別技術(shù)有花粉檢驗(yàn)法［5］、DNA 標(biāo)記物檢驗(yàn)法［6-7］和化學(xué)標(biāo)記物檢驗(yàn)法［8-9］等。研究發(fā)現(xiàn)，油菜蜜中丁香酸甲酯含量遠(yuǎn)高于其他蜜種［10］，可以作為油菜蜜鑒別的特征標(biāo)記物。然而，有文獻(xiàn)報(bào)道麥盧卡蜂蜜中丁香酸甲酯含量也較高［11-12］，單獨(dú)采用丁香酸甲酯這一指標(biāo)無(wú)法區(qū)分油菜蜜和麥盧卡蜂蜜。因此，亟需進(jìn)一步發(fā)掘油菜蜜的特征化學(xué)成分，以實(shí)現(xiàn)油菜蜜的快速和準(zhǔn)確鑒別。

葫蘆巴堿（trigonelline）是從豆科植物葫蘆巴的干燥種子中分離的一種具有生物活性的生物堿［13］，是一種天然的含氮有機(jī)物。秦皇島海關(guān)技術(shù)中心蜂產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)研發(fā)團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆巴堿在油菜蜜中的含量遠(yuǎn)高于其他蜜種，可作為一種新的特征標(biāo)志物用于油菜蜜的鑒別［14］。目前，葫蘆巴堿的測(cè)定方法主要有薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）［15］、高效液相色譜法（high-pressure liquid chromatography，HPLC）［16-17］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）［18-19］、毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）［20］和核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance，NMR）［21-22］等。其中，高效液相色譜法是最常用的檢測(cè)方法，具有分離效率較高、操作簡(jiǎn)單，適合大批量樣品檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。HPLC-MS/MS采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行測(cè)定，可以有效降低背景噪音，提高了目標(biāo)物檢測(cè)的靈敏度和特異性。本研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行溶解稀釋后直接進(jìn)行HPLC-MS/MS 檢測(cè)［14］，實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中葫蘆巴堿的快速測(cè)定，但該研究由于沒(méi)有進(jìn)行凈化操作，導(dǎo)致儀器容易受到污染，且高倍數(shù)稀釋降低了方法的靈敏度。因此，亟需建立一種蜂蜜中葫蘆巴堿檢測(cè)的新方法，以降低儀器損耗，提高方法靈敏度和準(zhǔn)確度。

本研究采用固相萃取技術(shù)對(duì)蜂蜜中葫蘆巴堿進(jìn)行富集和凈化，通過(guò)優(yōu)化HPLC-MS/MS試驗(yàn)條件，采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，以期實(shí)現(xiàn)蜂蜜中葫蘆巴堿的高靈敏和高準(zhǔn)確度檢測(cè)，為油菜蜜鑒別提供新的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究所需油菜蜜、洋槐蜜、棗花蜜、椴樹(shù)蜜、荊條蜜、咖啡蜜和百花蜜等蜂蜜樣品均于2018—2021 年采集自我國(guó)云南、安徽、河北、吉林、新疆等地蜂場(chǎng)。

葫蘆巴堿（trigonelline，CAS號(hào)：535-83-1，上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%）；葫蘆巴堿-d3（trigonellined3，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，純度≥98%）；甲醇、甲酸、乙酸銨均為色譜純［默克化工技術(shù)（上海）有限公司］，乙腈為色譜純（北京迪馬科技有限公司）。

分別稱(chēng)取適量上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于冰箱2～8 ℃條件下避光保存。用80%甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Acquity-Quattro Premier XE高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有Masslynx 4.0數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)Waters公司）；ACQUITY UPLC BEH HILIC（親水作用色譜，Hydrophilic interaction chromatography）色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）；Milli-Q超純水制備儀（美國(guó)Merck Millipore公司）；TURBOVAPLV氮?dú)庑鳚饪s儀、VOATEX-2渦旋混勻儀器（瑞典Biotage公司）；Oasia MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國(guó)Waters公司）。

1.3 樣品前處理

稱(chēng)取試樣2.0 g（精確到0.01 g）置于燒杯中，加入20 mL 0.1%甲酸水溶液充分溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液定容，混勻后備用。對(duì)咖啡蜜和油菜蜜樣品，取上述溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液稀釋、定容和混勻后備用。取上述備用液1.0 mL 加入100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液（1 μg·mL-1）混勻后進(jìn)行固相萃取凈化。

混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱（mixed-mode cation exchanger spe column，MCX）依次用3 mL甲醇、3 mL水活化。將添加了內(nèi)標(biāo)物的樣品溶液上樣至小柱，分別用3 mL 水、3 mL 甲醇溶液淋洗，抽干。然后加入3 mL 2%氨水甲醇溶液對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，洗脫液在50 ℃條件下用氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)屑尤? mL 80%甲醇水溶液，渦旋混合溶解，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后，供HPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 儀器條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH HILIC 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A： 乙腈，流動(dòng)相B： 5 mmol·L-1乙酸銨水溶液；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積2.0 μL；梯度洗脫條件：0.0～0.5 min，10% B；0.5～1.5 min，10%～50% B；1.5～3.5 min，50%B；3.5～4.0 min，50%～10% B；4.0～6.0 min，10% B。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子（electric spray ion，ESI）源；掃描模式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：+3 kV；離子源溫度：120 ℃。葫蘆巴堿及葫蘆巴堿-d3的MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 葫蘆巴堿及葫蘆巴堿-d3的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of trigonelline and trigonelline-d3

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的選擇和優(yōu)化 HILIC是以硅膠或衍生硅膠等極性填料作為固定相，高比例有機(jī)溶劑和低比例水溶液為流動(dòng)相的色譜模式［23］，對(duì)強(qiáng)極性化合物具有良好的保留效果。葫蘆巴堿分子中同時(shí)存在正負(fù)電荷基團(tuán)，極性較強(qiáng)，在HILIC 色譜柱上的峰形尖銳，分離效果良好［24］，故本研究以此作為分析柱，進(jìn)一步優(yōu)化了流動(dòng)相條件。

HPLC 分析中常用的有機(jī)相為甲醇或乙腈，本研究分別以甲醇和乙腈作為有機(jī)相，同時(shí)對(duì)不同水相（5 mmol·L-1乙酸銨溶液、0.1%甲酸水溶液）的色譜分離效果進(jìn)行考察。結(jié)果表明，采用甲醇作為有機(jī)相時(shí)，目標(biāo)物均峰形展寬，拖尾嚴(yán)重（圖1-A、B）。而當(dāng)乙腈作為有機(jī)相，目標(biāo)物的峰形和靈敏度均較好。進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)，水相為5 mmol·L-1乙酸銨溶液（圖1-C）時(shí)，目標(biāo)物響應(yīng)明顯高于0.1%甲酸水溶液（圖1-D），故本研究采用乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相條件下葫蘆巴堿（1 μg·mL-1）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Trigonelline （1 μg·mL-1） under different mobile phase conditions

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化 配制500 ng·mL-1葫蘆巴堿和100 ng·mL-1葫蘆巴堿-d3 標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用針泵直接進(jìn)樣，以10 μL·min-1流速分別注入離子源，用正離子模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描得到葫蘆巴堿和葫蘆巴堿-d3 的母離子；再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選擇質(zhì)荷比（m/z）較大、強(qiáng)度較高且穩(wěn)定的離子作為子離子，并對(duì)錐孔電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。最終2 種物質(zhì)的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表1，各目標(biāo)物的MRM色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 葫蘆巴堿（500 ng·mL-1）和葫蘆巴堿-d3（100 ng·mL-1）的MRM色譜圖Fig.2 MRM Chromatograms of Trigonelline （500 ng·mL-1） and Trigonelline-d3 （100 ng·mL-1）

2.2 樣品前處理優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇 MCX 是將磺酸基鍵合在高度交聯(lián)的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物（polystyrene/divinylbenzene，PS/DVB）表面得到的混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換吸附劑，具有反相和陽(yáng)離子交換雙重保留性能，對(duì)堿性化合物具有良好的保留能力［25］。葫蘆巴堿是一種生物堿，因此本研究選用MCX固相萃取柱。

2.2.2 提取溶劑的優(yōu)化 本研究選取某油菜蜜作為代表性樣品進(jìn)行前處理?xiàng)l件優(yōu)化?；贛CX 柱吸附生物堿的機(jī)理，一般采用酸性上樣、堿性洗脫的模式，因而提取液的酸度可能影響葫蘆巴堿在MCX 柱上的吸附。研究考察了不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸水溶液對(duì)目標(biāo)物萃取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3-A。

圖3 不同提取或洗脫條件下目標(biāo)物的響應(yīng)Fig.3 Intensity of the target substance under different extraction or elution conditions

由于蜂蜜水溶液本身的酸性特征，不加甲酸即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物在MCX 固相萃取柱上的良好吸附，加入0.1%、0.5%和1.0%的甲酸，目標(biāo)物響應(yīng)無(wú)明顯差異，而甲酸濃度為1.0%時(shí)其重復(fù)性稍差。考慮到加入一定量甲酸有利于提取體系穩(wěn)定，可以適用于不同酸度的蜂蜜樣品，試驗(yàn)選擇0.1%的甲酸水溶液作為提取溶劑。

2.2.3 淋洗條件的優(yōu)化 固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）過(guò)程中采用合適的溶劑淋洗固相萃取柱可以去除干擾物質(zhì)，試驗(yàn)研究了不同體積的水和甲醇淋洗條件對(duì)目標(biāo)物的影響，測(cè)試結(jié)果表明，用3 mL水和3 mL 甲醇淋洗時(shí)，目標(biāo)物不會(huì)被淋洗下來(lái)，而蜂蜜中的糖分等干擾物質(zhì)可以被有效去除，因而試驗(yàn)選用淋洗條件為3 mL水和3 mL甲醇。

2.2.4 洗脫條件的優(yōu)化 氨水甲醇是MCX 固相萃取柱的常用洗脫試劑，本研究評(píng)估了不同濃度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%）的氨水甲醇溶液對(duì)蜂蜜中葫蘆巴堿的洗脫效果。結(jié)果表明（圖3-B），氨水甲醇濃度由0.1%增加到1.0%時(shí)，目標(biāo)物的洗脫效率明顯增加，為1.0%～5.0%，隨著氨水濃度的增加，目標(biāo)物響應(yīng)基本一致，本研究選擇穩(wěn)定的中間點(diǎn)，即2%氨水甲醇（V/V）作為洗脫溶劑。

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了洗脫溶劑用量對(duì)目標(biāo)物洗脫效率的影響。結(jié)果表明，3 mL 的洗脫溶劑即可使得目標(biāo)物完全洗脫，因此，本研究選擇3 mL 為洗脫溶劑用量。

2.3 定量方法選擇

針對(duì)復(fù)雜樣品基質(zhì)的檢測(cè)，HPLC-MS/MS 常存在基質(zhì)效應(yīng)，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量可降低或消除基質(zhì)效應(yīng)，提高方法的準(zhǔn)確性和精密度［26］。本研究選用葫蘆巴堿-d3 作為同位素內(nèi)標(biāo)，其性質(zhì)與目標(biāo)物相似，在前處理過(guò)程中的損失和受基質(zhì)影響程度相近，可以有效降低或消除基質(zhì)效應(yīng)，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 方法線(xiàn)性、檢出限和定量限 以80%甲醇-水溶液作為溶劑配制葫蘆巴堿濃度分別為10、20、50、100、200、500 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，同位素內(nèi)標(biāo)濃度為100 ng·mL-1，HPLC-MS/MS 進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品與同位素內(nèi)標(biāo)物峰面積比值y為縱坐標(biāo)，繪制葫蘆巴堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線(xiàn)，得到化合物的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程以及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明（表2），葫蘆巴堿的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（R2）=0.999 9，儀器檢出限為3 ng·mL-1，定量限為10 ng·mL-1。按照稀釋倍數(shù)1∶25計(jì)算。方法定量限為0.25 mg·kg-1。由于油菜蜜和咖啡蜜中葫蘆巴堿含量較高，稀釋倍數(shù)為1∶250，對(duì)應(yīng)的方法定量限為2.5 mg·kg-1。

表2 葫蘆巴堿的線(xiàn)性、檢出限和定量限Table 2 The linearity，detection limit and quantitation limit of trigonelline

2.4.2 回收率和精密度 采用添加回收試驗(yàn)對(duì)方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行考察，由于實(shí)際樣品中均檢出葫蘆巴堿，因此研究采用成分相近的果葡糖漿作為空白樣品進(jìn)行低、中、高水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)。此外，進(jìn)一步選擇洋槐蜜、棗花蜜、椴樹(shù)蜜、荊條蜜、百花蜜、咖啡蜜、油菜蜜7個(gè)蜜種的樣品，根據(jù)其本底含量，進(jìn)行適量濃度的添加試驗(yàn)。

對(duì)空白樣品，在0.25、0.50 和2.50 mg·kg-13 個(gè)添加濃度下，每個(gè)濃度平行測(cè)定6 次，按上述方法進(jìn)行前處理和儀器檢測(cè)，計(jì)算回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表3 所示，方法的平均回收率為97.8%～101.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSDs）范圍為0.5%～4.3%。

表3 空白樣品中葫蘆巴堿的添加回收率和精密度數(shù)據(jù)（n=6）Table 3 Recoveries and precisions of trigonelline in blank samples （n=6）

代表性樣品按照上述方法進(jìn)行處理和測(cè)定，并依據(jù)其含量水平進(jìn)行適量濃度添加，每個(gè)添加濃度平行測(cè)定4次，其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表4。結(jié)果表明，實(shí)際樣品中葫蘆巴堿的平均回收率為87.3%～106.3%，RSD范圍為0.9%～6.7%。說(shuō)明本方法的回收率和精密度良好，適用于蜂蜜中葫蘆巴堿的測(cè)定。

表4 代表性樣品中葫蘆巴堿的添加回收率和精密度數(shù)據(jù)（n=4）Table 4 Recoveries and precisions of trigonelline in representative samples （n=4）

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用建立的方法對(duì)14種不同蜜源植物共274批樣品中的葫蘆巴堿進(jìn)行測(cè)定，包括油菜蜜60 批、咖啡蜜8 批、洋槐蜜30 批、荊條蜜30 批、椴樹(shù)蜜30 批、荔枝蜜30批、棗花蜜30批、蕎麥蜜8批、百花蜜8批、葵花蜜8批、苕子蜜8 批、紫云英蜜8 批、橡膠蜜8 批、龍眼蜜8 批。結(jié)果表明，葫蘆巴堿在所有樣品中均有檢出，各蜜種樣品中葫蘆巴堿的含量見(jiàn)圖4，某代表性油菜蜜樣品中葫蘆巴堿和葫蘆巴堿-d3 的MRM 色譜圖見(jiàn)圖5。葫蘆巴堿在油菜蜜和咖啡蜜中的含量遠(yuǎn)高于其他蜜種，平均含量分別為77.8 和55.5 mg·kg-1，最高含量為91.7和58.3 mg·kg-1；本研究咖啡蜜中葫蘆巴堿含量的檢測(cè)結(jié)果與Elisabetta 等［27］的結(jié)果基本一致。而葫蘆巴堿在洋槐蜜、荊條蜜、椴樹(shù)蜜、棗花蜜等12種蜂蜜樣品中的含量均低于10 mg·kg-1；因此依據(jù)葫蘆巴堿的含量可以區(qū)分油菜蜜或咖啡蜜與其他蜜種，但對(duì)于油菜蜜和咖啡蜜的進(jìn)一步鑒別，還需要結(jié)合花粉分析或其他技術(shù)手段進(jìn)行。

圖4 不同蜜種蜂蜜中葫蘆巴堿的含量Fig.4 Content of trigonelline in different types of honey sample

圖5 某油菜蜜樣品中葫蘆巴堿（100 ng·mL-1）和葫蘆巴堿-d3（100 ng·mL-1）的MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of trigonelline and trigonelline-d3 （100 ng·mL-1） in a rape honey sample

3 討論

目前，葫蘆巴堿含量的檢測(cè)主要集中在采用超聲波提取的苦蕎麥［28］、咖啡［29］及中草藥［30］等植物源樣品中，而蜂蜜中葫蘆巴堿的檢測(cè)研究?jī)H有少量報(bào)道。Elisabetta 等［27］采用NMR 法測(cè)定了蜂蜜中的葫蘆巴堿含量，但該方法所用儀器昂貴，且靈敏度低于色譜質(zhì)譜方法；Nguyen 等［31］選用毒性較強(qiáng)的氯仿提取越南咖啡蜜中的葫蘆巴堿，提取時(shí)間為12 h，前處理耗時(shí)較久。蜂蜜基質(zhì)較為復(fù)雜，對(duì)蜂蜜中葫蘆巴堿的測(cè)定需要去除其中大量的糖類(lèi)、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)?？紤]到葫蘆巴堿是一種堿性化合物，已有文獻(xiàn)報(bào)道了采用陽(yáng)離子交換（MCX）固相萃取技術(shù)測(cè)定蜂蜜中苦參堿類(lèi)生物堿［32］和吡咯里西啶生物堿［33］。參考類(lèi)似機(jī)理，本研究選用MCX 固相萃取技術(shù)，對(duì)前處理過(guò)程中提取溶劑、淋洗條件和洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)采用0.1%甲酸水溶液作為提取試劑，操作安全且整個(gè)前處理過(guò)程只需1.5 h即可完成，實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中葫蘆巴堿含量的快速檢測(cè)。經(jīng)MCX 柱固相萃取后，蜂蜜中葫蘆巴堿的平均回收率為87.3%～109.7%，因此，本研究采用固相萃取技術(shù)實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中葫蘆巴堿的高效富集和有效凈化。

對(duì)于蜂蜜等復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的LC-MS/MS 定量分析，采用同位素內(nèi)標(biāo)法可以有效提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確度［34］。本研究采用葫蘆巴堿-d3作為同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)葫蘆巴堿進(jìn)行定量，葫蘆巴堿-d3 與葫蘆巴堿結(jié)構(gòu)相似，在色譜柱上的保留時(shí)間、峰形等都基本一致，質(zhì)譜的碎裂途徑也基本一致。與先前建立的外標(biāo)法［14］相比，本研究方法具有更高的靈敏度，定量限由之前的1.0 mg·kg-1降低至0.25 mg·kg-1，同時(shí)有效降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高了方法的準(zhǔn)確度。

前言所述丁香酸甲酯作為鑒別油菜蜜的特征標(biāo)志物有一定的不足之處，即無(wú)法有效區(qū)分油菜蜜與麥盧卡蜂蜜。而本研究建立的蜂蜜中葫蘆巴堿檢測(cè)方法可作為丁香酸甲酯的補(bǔ)充或替代方法，用來(lái)區(qū)分油菜蜜和其他蜜種。但該方法也有一定的局限性，即單獨(dú)采用葫蘆巴堿這一指標(biāo)不能有效區(qū)分油菜蜜和咖啡蜜。而將二者結(jié)合應(yīng)用，可有效地提高油菜蜜鑒別的準(zhǔn)確性和可靠性。

4 結(jié)論

本研究采用固相萃取富集和凈化，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了蜂蜜中葫蘆巴堿的定性定量測(cè)定方法。試驗(yàn)對(duì)固相萃取前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法對(duì)葫蘆巴堿進(jìn)行準(zhǔn)確定量，結(jié)果表明，在10～500 ng·mL-1范圍，葫蘆巴堿的含量與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其平均回收率范圍為87.3%～106.3%，RSD不高于6.7%，方法定量限為0.25 mg·kg-1。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好，符合方法學(xué)要求，適用于蜂蜜中葫蘆巴堿含量的測(cè)定。本研究建立的分析方法和實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果可以為油菜蜜的鑒別和品質(zhì)評(píng)價(jià)、蜂蜜摻雜鑒別等提供技術(shù)和數(shù)據(jù)支撐。