曾生元 杜燦燦 胡慶峰 李 闖 景德道 林添資 孫立亭 龔紅兵

（江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400）

我國(guó)人均耕地僅有0.1 hm2左右，不足世界平均水平的一半，因此常利用雙季稻、稻-麥等輪作方式來(lái)提高土地的單位面積產(chǎn)量。高產(chǎn)是水稻（Oryza sativaL.）育種的永恒主題［1］，通過(guò)改良水稻株葉形態(tài)以提升其光能利用效率或延長(zhǎng)生育期以增加其光合作用時(shí)間來(lái)提高碳素同化量是水稻獲得高產(chǎn)的兩條主要途徑［2-3］，但過(guò)長(zhǎng)的生育期往往對(duì)后茬作物存在不利影響。因此，協(xié)同優(yōu)化水稻株型與生育期，對(duì)實(shí)現(xiàn)我國(guó)糧食周年豐產(chǎn)具有促進(jìn)作用。

水稻株型是其植株根、莖、葉、穗等形態(tài)特征的綜合表現(xiàn)［4］。葉傾角是指葉片與莖稈之間的夾角，是水稻株型的重要組成部分，對(duì)于其自身的光能利用及自然環(huán)境中鄰近植物間的競(jìng)爭(zhēng)至關(guān)重要［5］。目前已報(bào)道了多個(gè)調(diào)控水稻葉傾角的基因，大多與油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids，BR）、生長(zhǎng)素（auxin，IAA）或其他激素引起的細(xì)胞增殖或膨大有關(guān)，且對(duì)株高等其他株型特征同樣存在顯著影響，如D2（Dwarf2）［6］、D4［7］、D11［8］、Brd1（Brassinosteroid-deficient dwarf1）［9］等基因主要與BR合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，LC1（LEAF INCLINATION1）［10］、LC3［11］、LC4［12］、LPA1（Loose Plant Architecture1）［13］等與IAA的合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，LC2參與了多種植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［14］。與上述激素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的是，ila1（increased leaf angle1）突變體表型是由MAPKKK（mitogen-activated protein kinase kinase kinases）家族C組成員ILA1基因的T-DNA插入突變引起［15］。

抽穗期決定著水稻的種植區(qū)域和季節(jié)適應(yīng)性，其調(diào)控機(jī)制一直是分子生物學(xué)家和育種家關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。自Hd1（Heading date1）被克隆以來(lái)，已有多個(gè)抽穗期（生育期）基因和數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）得到了克?。?6］，初步闡明了以O(shè)sGI（GIGANTEA）-Hd1-Hd3a和Ghd7（Grains-Height-Date7）-Ehd1（Early Heading date1）-Hd3a兩條通路為核心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中前者為植物中保守的成花信號(hào)傳導(dǎo)途徑，而Ghd7-Ehd1途徑為水稻自身所特有的通路［17-18］。

迄今已克隆了眾多水稻株型和生育期的相關(guān)基因，但水稻株型與生育期之間的信號(hào)交流、協(xié)調(diào)作用仍缺乏系統(tǒng)研究，需要發(fā)掘更多的突變體以進(jìn)行功能分析和育種利用研究。鑒于此，本研究在發(fā)現(xiàn)一個(gè)水稻基部葉角度顯著增大的早熟突變體（basal leaves inclination and early flowering，blief）的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行表型鑒定、遺傳分析、精細(xì)定位和候選基因分析，以期進(jìn)一步解析調(diào)控水稻生育期與株型的遺傳網(wǎng)絡(luò)，以及為選育具有動(dòng)態(tài)優(yōu)良株型的品種提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料野生型（wild type，WT）品種鎮(zhèn)恢832，系江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的一個(gè)雜交中秈兩用恢復(fù)系（植物品種權(quán)號(hào)：CNA20100442.0）。在2013 年利用60Co-γ 射線(xiàn)輻射鎮(zhèn)恢832 干種子的M2代株系中獲得blief突變體，經(jīng)過(guò)2014—2016 年連續(xù)4 代自交種植，確認(rèn)突變性狀能穩(wěn)定遺傳。武育粳3 號(hào)為直立葉角度遲熟中粳稻品種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有材料正季句容于5月15日播種，6月15日移栽，自然長(zhǎng)日照（natural long-day，NLD），光周期約為光照14 h/黑暗10 h；海南陵水于12月15日播種，1月12日移栽，自然短日照（natural short-day，NSD），光周期約為光照11 h/黑暗13 h，單本種植，株行距16.7 cm×25.0 cm。記錄野生型與突變體第1至第7葉位的葉角度、抽穗期，在成熟期隨機(jī)選取野生型與突變體各10株進(jìn)行農(nóng)藝性狀測(cè)定，包括株高、有效穗、穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率、千粒重、粒型及單株產(chǎn)量。

參照吳旺嬪等［19］的方法測(cè)定種子的萌發(fā)特性：選取健康飽滿(mǎn)的水稻種子，先用60 ℃溫水沖洗3～4 次，在25 ℃的人工氣候箱浸種24 h 后，將水稻種子均勻擺放在發(fā)芽盒中培養(yǎng)，每盒播種100粒，光強(qiáng)為10 000 lx，光周期為光照14 h/黑暗10 h，相對(duì)濕度為70%，視情況補(bǔ)充蒸餾水，浸種后第3天測(cè)定發(fā)芽勢(shì)，第10天隨機(jī)選取10株測(cè)定植株芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)及鮮重。

1.3 分子標(biāo)記和總DNA 的提取

水稻葉片總DNA 的提取采用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法進(jìn)行。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記根據(jù)McCouch 等［20］構(gòu)建的SSR 連鎖圖獲得，插入缺失（insertion-deletion，InDel）、衍生型酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（derived cleaved amplified polymorphism sequences，dCAPS）標(biāo)記運(yùn)用Primer 5.0 軟件自行設(shè)計(jì)。所有SSR、InDel、dCAPS標(biāo)記均由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

用于一般標(biāo)記檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照林添資等［21］的方法，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)8%垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳后0.1%硝酸銀染色觀測(cè)。

dCAPS 標(biāo)記的檢測(cè)方法：PCR 擴(kuò)增采用50 μL體系：模板DNA 3.0 μL，10×PCR 的緩沖液4.0 μL，2 mmol·L-1的dNTP 2.0 μL，0.3 μmol·L-1的上下游引物各2.0 μL，Taq 酶1.0 U，加ddH2O 補(bǔ)足50 μL，擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)［21］。反應(yīng)產(chǎn)物首先取10 μL經(jīng)3%瓊脂糖電泳檢測(cè)，溴化乙錠染色后在凝膠成像儀觀察確認(rèn)擴(kuò)增片段的正確后，參照Mbol 酶（NEB，北京）說(shuō)明書(shū)將擴(kuò)增產(chǎn)物37 ℃酶切30 min，連同酶切前擴(kuò)增產(chǎn)物作為對(duì)照采用3%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色后在凝膠成像儀上拍照。

1.4 遺傳分析及基因定位

1.4.1 遺傳分析群體 2016 年正季以突變體與野生型親本正交，同時(shí)以野生型親本與突變體反交，種植相應(yīng)的F1群體，自交獲得F2群體，根據(jù)F1及F2群體的性狀及性狀分離比例進(jìn)行遺傳統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.2 定位群體 2016 年正季用突變體與粳稻親本武育粳3 號(hào)雜交，2017 年正季從F2群體中選取15 株正常植株和284 株純合隱性植株（基部葉角度大、極端早熟個(gè)體）構(gòu)成初定位群體，分單株取葉片提取DNA 用于初步定位。由于blief/武育粳3號(hào)F2群體生育期分離大，存在矛盾單株的問(wèn)題，2017 年海南開(kāi)始利用初定位兩側(cè)標(biāo)記篩選含目標(biāo)區(qū)段的雜合個(gè)體，與受體親本武育粳3 號(hào)回交2 次以純化背景，2019 年在BC2F2群體中獲得背景較為單一的437個(gè)極端隱性個(gè)體。

1.4.3 基因定位 F2定位群體中各隨機(jī)選取15 個(gè)正常植株及突變株分別混合作為正常和突變基因池，利用江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室（本實(shí)驗(yàn)室）已有的分子標(biāo)記，采用集團(tuán)分離分析法（bulked segregant analysis，BSA）法篩選連鎖標(biāo)記，確定BLIEF基因所在染色體，之后進(jìn)一步擴(kuò)大群體、加密標(biāo)記，采用圖位克隆法對(duì)BLIEF基因進(jìn)行精細(xì)定位。

1.5 生物信息學(xué)與基因測(cè)序

參照Rice Genome Annotation Project（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）網(wǎng)站對(duì)目標(biāo)區(qū)段內(nèi)基因的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

依據(jù)日本晴的基因組序列設(shè)計(jì)引物，利用PrimeSTAR?長(zhǎng)片段高保真酶（TaKaRa，北京），分別擴(kuò)增突變體和野生型品種基因組DNA，每個(gè)片段在1 200～2 600 bp之間，PCR產(chǎn)物回收采用GK2045試劑盒（上海捷瑞），按說(shuō)明書(shū)操作，回收產(chǎn)物連到pMD18-T 載體（TaKaRa，北京）上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Vector NTI 9.0及Cluster W軟件比對(duì)分析。序列測(cè)定在南京擎科生物有限公司完成。

1.6 候選基因突變位點(diǎn)的驗(yàn)證

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)突變體與野生型存在兩個(gè)單堿基核苷酸（single nucleotide polymorphism，SNP）差異，遂根據(jù)dCAPs-finder 2.0 網(wǎng)站（http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）分析序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)dCAPs標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。

1.7 水稻總RNA 提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)

在苗期選取野生型和突變體第三葉葉片組織，采用植物RNA 小量提取試劑盒（天根北京）提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄用Prime Script RT regent Kit 試劑盒（TakaRa，北京）進(jìn)行，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，采用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa，北京），在7500 Real-time PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)）上按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRTPCR 分析，采用2-ΔΔCt方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型特征

與野生型品種鎮(zhèn)恢832 相比：突變體種子芽勢(shì)更強(qiáng)、萌發(fā)速度更快（表1、圖1-A），前6 張葉片角度顯著或極顯著增大，第7張葉片角度恢復(fù)正常（圖1-B、C 和圖2）；正季自然長(zhǎng)日照條件下抽穗期提前10 d，冬季自然短日照條件下提前6 d（圖3），由此將突變體命名為blief。其他主要農(nóng)藝性狀中，blief的株高顯著降低，單株有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)有所降低，粒寬及千粒重顯著增加，單株產(chǎn)量降低但均未達(dá)到顯著水平（表2）。

圖1 野生型與blief突變體不同時(shí)期的植株形態(tài)比較Fig.1 The morphological differences between wild type and blief at different growing stage

圖2 野生型與blief葉片角度Fig.2 The leaves angle of wild type and blief

圖3 野生型與blief在自然長(zhǎng)日照（NLD）和短日照（NSD）的生育期比較Fig.3 The heading date of wild type and blief under different environmental conditions

表1 野生型與blief種子萌發(fā)特性的比較Table 1 Germination characteristics of wild type and blief

表2 野生型與blief主要農(nóng)藝性狀的比較Table 2 Agronomic traits of wild type and blief

2.2 突變性狀的遺傳分析

突變體blief經(jīng)4 代自交確定突變性狀可穩(wěn)定遺傳，blief與野生型親本鎮(zhèn)恢832 正反交的F1植株均表現(xiàn)正常，F(xiàn)2可區(qū)分為差異明顯的正常植株和突變株兩種類(lèi)型，經(jīng)卡方（χ2）測(cè)驗(yàn)，其分離比例均符合孟德?tīng)?∶1的分離比（表3），表明該突變性狀受一對(duì)隱性核基因控制。

表3 突變體blief的遺傳分析Table 3 Genetic analysis of blief

表4 本研究所用的部分標(biāo)記信息Table 4 Part of markers employed in this study

2.3 基因定位

2017 年利用本實(shí)驗(yàn)室已有的551 對(duì)SSR、InDel 標(biāo)記，篩選得到在兩親本間表現(xiàn)出多態(tài)的178 對(duì)標(biāo)記。隨機(jī)選取正常株和極端突變株各15 個(gè)構(gòu)建正常和突變基因池，先用均勻分布于水稻12條染色體上的112對(duì)多態(tài)SSR標(biāo)記篩選，發(fā)現(xiàn)位于水稻第3染色體上的SSR標(biāo)記RM6291、RM282 與BLIEF基因連鎖。進(jìn)一步利用區(qū)間內(nèi)的已有標(biāo)記，檢測(cè)F2取得的所有284 株隱性個(gè)體，但由于blief/武育粳3號(hào)F2群體生育期分離很大，在選取極端早熟個(gè)體時(shí)不準(zhǔn)確，導(dǎo)致出現(xiàn)了10 株矛盾個(gè)體，根據(jù)對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記帶型數(shù)據(jù)，只能初步確定BLIEF基因位于InDel 標(biāo)記In3-13 與SSR 標(biāo)記RM282之間，這兩個(gè)標(biāo)記間的物理距離約4.4 Mb。

為了精細(xì)定位BLIEF基因，同年利用擴(kuò)大區(qū)間的兩側(cè)標(biāo)記RM6291與RM282重新從F1開(kāi)始篩選含目標(biāo)區(qū)段的雜合個(gè)體，與受體親本武育粳3號(hào)回交，得到背景較為單一的BC2F2群體，在BC2F2群體中獲得437 個(gè)基部大葉角早熟極端個(gè)體。同時(shí)在In3-14 與RM282 之間開(kāi)發(fā)標(biāo)記，獲得15對(duì)多態(tài)性InDel標(biāo)記，利用這17個(gè)標(biāo)記對(duì)437 個(gè)BC2F2定位群體進(jìn)行擴(kuò)增，分子標(biāo)記BL3-24 和BL3-27 各檢測(cè)到1 個(gè)重組單株，而B(niǎo)L3-25未檢測(cè)到重組單株，據(jù)此將BLIEF基因限定在BL3-24和BL3-27之間，參照日本晴基因組序列的物理距離約為51 kb（圖4-A）。

圖4 BLIEF基因的圖位克隆Fig.4 Map-based cloning of BLIEF gene

圖5 野生型和blief部分株型、生育期調(diào)控基因的表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of genes involved in planttype and flowering time between WT and blief

2.4 候選基因的初步確定

參照Rice Annotation Project Database 網(wǎng)站注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)定位區(qū)間內(nèi)存在7 個(gè)開(kāi)放式閱讀框（open reading frame，ORF），其中Os03g0309100編碼水稻B類(lèi)光敏色素OsPhyB基因（表5）。參考已有報(bào)道，該基因在水稻激素及生育期調(diào)控遺傳網(wǎng)絡(luò)中存在的重要作用［22-25］，因此選定其為本突變體的候選基因。

表5 定位區(qū)間內(nèi)的基因功能預(yù)測(cè)Table 5 Genes annotation in mapping region of BLIEF

參考基因組日本晴序列，設(shè)計(jì)了4 對(duì)引物分別擴(kuò)增突變體和野生型Os03g0309100基因的基因組序列（表4）。比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體與野生型在Os03g0309100基因在第一個(gè)外顯子內(nèi)存在2 個(gè)SNP 差異，即由TG 突變?yōu)镚T，導(dǎo)致了突變體基因轉(zhuǎn)錄提前終止?；谶@一序列差異，結(jié)合dCAPS-finder 2.0 網(wǎng)站的分析，開(kāi)發(fā)了一對(duì)dCAPS 標(biāo)記Phy-dCAPs1，用Phy-dCAPs1 分別擴(kuò)增野生型與突變體，產(chǎn)物再用內(nèi)切酶Mbo1 酶切，發(fā)現(xiàn)突變體可以切開(kāi)，而野生型無(wú)法切開(kāi)，從而驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性（圖4-B、C）。

2.5 相關(guān)基因的表達(dá)分析

利用qRT-PCR 檢測(cè)野生型及blief苗期葉片組織中部分株型及生育期基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示突變體中的OsPhyB基因表達(dá)量極低，說(shuō)明突變體基因轉(zhuǎn)錄提前終止導(dǎo)致其功能喪失，進(jìn)一步證明OsPhyB可能是BLIEF的候選基因。突變體中其他3 個(gè)株型基因IPA1（Ideal plant architecture1）、Brd1、D11的表達(dá)水平極顯著上調(diào)，其中IPA1上調(diào)幅度最大；OsGI（GI）-Hd1-Hd3a通路的主要基因：突變體中OsGI、OsPhyB的表達(dá)量均極顯著降低、Hd3a的表達(dá)量極顯著上調(diào)；Ehd1途徑中的Ehd1及成花素基因RFT1表達(dá)量極顯著上升，成花素基因OsMADS14、OsMADS15表達(dá)量一降一升。

3 討論

為了使水稻在全生育期充分捕獲和利用太陽(yáng)光能，近年來(lái)有學(xué)者提出了“動(dòng)態(tài)理想株型”的概念，要求水稻植株前期叢生快長(zhǎng)，分蘗角度、葉片角度前期較大（有一定角度披垂）而后期恢復(fù)直立，呈動(dòng)態(tài)變化，從而有效改善群體結(jié)構(gòu)和受光姿態(tài)，提高光能利用率而增加產(chǎn)量［26-28］。本研究在中秈恢復(fù)系鎮(zhèn)恢832 的輻射后代中獲得了一個(gè)基部葉角度顯著增大但后期能恢復(fù)直立的突變體blief，突變體萌發(fā)速度更快，生育期顯著變短，植株生長(zhǎng)量有一定的降低但單株產(chǎn)量沒(méi)有顯著下降，在一定程度上符合動(dòng)態(tài)理想株型的特征。

本研究遺傳分析結(jié)果表明，blief受一對(duì)隱性核基因控制，進(jìn)一步采用圖位克隆技術(shù)將BLIEF基因精細(xì)定位于第3 染色體短臂InDel 標(biāo)記BL3-24 和BL3-27之間的51 kb 區(qū)間內(nèi)?；驕y(cè)序及功能標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，blief中OsPhyB基因的基因序列發(fā)生了堿基替換，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄提前終止，結(jié)合基因定量表達(dá)結(jié)果，表明BLIEF為OsPhyB的一個(gè)功能缺失的等位基因。已有的研究發(fā)現(xiàn)，OsPhyB可負(fù)調(diào)控BR 的激素信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)控水稻株型特別是葉傾角的形成［22-23］；此外，OsPhyB還在Hd1、Ehd1生育期通路中起調(diào)控作用，PhyB 蛋白可抑制成花因子Hd3a、早花基因Ehd1促進(jìn)因子OsCOL4 的表達(dá)，從而在長(zhǎng)日照條件下抑制水稻開(kāi)花［24-25］。最新研究發(fā)現(xiàn)，OsPhyB基因在水稻生物（如紋枯?。┡c非生物脅迫（干旱、冷害）響應(yīng)等方面起重要作用［29-31］。本研究選取了株型及生育期部分基因，對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明blief中除OsPhyB的表達(dá)量極低外，大多株型基因的表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，其中IPA1、Brd1、D11的表達(dá)水平極顯著上調(diào)，說(shuō)明PhyB 很可能作用于IPA1、Brd1、D11 上游。生育期基因方面，本研究突變體中Hd1的促進(jìn)因子OsGI的表達(dá)量均顯著下降，而Hd1的表達(dá)量未發(fā)生顯著變化，大多促進(jìn)水稻抽穗的基因，如Ehd1及成花素基因Hd3a、RFT1表達(dá)量顯著上調(diào)，這與blief突變體在不同環(huán)境條件下生育期均顯著提前一致。綜上，本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了OsPhyB基因功能的多效性，其功能缺失可導(dǎo)致水稻基部葉片角度變大、生育期提前以及諸多產(chǎn)量性狀發(fā)生改變，對(duì)該基因的進(jìn)一步研究將有助于加深對(duì)人們水稻株型、生育期及抗逆性遺傳網(wǎng)絡(luò)的理解。

4 結(jié)論

與野生型鎮(zhèn)恢832 相比，本研究blief突變體芽勢(shì)更強(qiáng)，基部葉片角度顯著變大、后逐漸恢復(fù)正常，在不同環(huán)境條件下的抽穗期均顯著提前，且產(chǎn)量性狀發(fā)生了顯著變化。BLIEF基因精細(xì)定位于第3 染色體短臂InDel 標(biāo)記BL3-24 和BL3-27 之間，物理距離為51 kb，基因測(cè)序、功能標(biāo)記檢測(cè)和基因定量表達(dá)分析結(jié)果表明，BLIEF為OsPhyB的一個(gè)無(wú)功能的等位基因，blief中多個(gè)生育期、株型調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化。