甘新彪，劉名奎

1 武漢市武昌醫(yī)院肛腸科，武漢 430000；2 武漢市武昌醫(yī)院普外科

結(jié)直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，也是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因［1-2］。全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率在所有腫瘤中均排第3位［3］?；熍c手術(shù)仍是結(jié)直腸癌的主要治療策略。盡管在開發(fā)新療法方面取得了進展，結(jié)腸癌患者預(yù)后仍然較差［4-5］。約有50%接受手術(shù)切除和積極化療的患者會復(fù)發(fā)［6］，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者預(yù)后不佳的重要因素［7］。深入探討結(jié)直腸癌分子機制對開發(fā)新的治療方法及改善預(yù)后至關(guān)重要［8-9］。微小RNA（miRNA）是一類非編碼RNA，通過與相應(yīng)靶信使RNA（mRNA）的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合調(diào)節(jié)細胞生物學(xué)過程，在細胞增殖、遷移、侵襲和分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］。miRNA 與腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥性和復(fù)發(fā)密切相關(guān)［11］。miR-210、miR-21 和miR-126已被確定為診斷大腸癌的標(biāo)志物［12］。miR-199 是新發(fā)現(xiàn)的miRNA，其在肝細胞癌中表達下調(diào)，且抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［13］。研究顯示，在非小細胞肺癌中，miR-199 可抑制體外培養(yǎng)的肺癌細胞增殖、侵襲，并促進細胞凋亡［14］。但miR-199 在結(jié)直腸癌中的表達情況及作用機制尚不清楚。2020 年1 月—2021 年1月，本研究旨在探討結(jié)直腸癌細胞系中miR-199 表達及對增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細胞系（LOVE、SW620、SW480、HT29、DLD-1 細胞）和人正常結(jié)腸上皮細胞系（HCoEpiC 細胞）均購于美國ATCC 細胞中心。改良版Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）、RPMI-1640 培養(yǎng)基和LipofectamineTM3000 試劑購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。帶有8.0 μm 孔聚碳酸酯膜插入物的Transwell 板購于美國Corning 公司，Matrigel 購自美國BD Biosciences 公司。螢火蟲和海腎雙螢光素酶檢測試劑盒購于北京碧云天生物技術(shù)有限公司。實時熒光定量PCR 試劑盒購于美國Life Technologies 公司，miR-199mimics、mimic-NC、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TFR1）過表達質(zhì)粒均由廣州銳博生物科技有限公司合成。TFR1 和GAPDH 一抗及二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 將人正常結(jié)腸上皮細胞系HCoEpiC 保存在RIPM-1640 中，結(jié)直腸癌細胞系（LOVE、SW620、SW480、HT29 和DLD-1）保存在DMEM培養(yǎng)基中，均在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。吸出細胞培養(yǎng)液，放入離心管中，1 000 r/min 離心5 min（離心半徑165 mm），吸掉上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，混和均勻，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。傳至三代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞隨機分為miR-199 過表達組、陰性對照組及miR-199+TFR1 共 表 達 組（miR-199mimics+TFR1組），用LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-199mimics、mimic-NC、miR-199mimics+TFR1 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至以上各組細胞，另取部分未轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照組。

1.3 miR-199、TFR1 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取各組細胞，用TRIzol 試劑從細胞中提取總RNA，用cDNA 合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA。用iQ SYBR Green Supermix Kit（Bio-Rad）行qRT-PCR實驗，基因表達量用循環(huán)閾值（Ct）法計算，并將GAPDH 作內(nèi)部對照。miR-199 正向引物序列5'-TGTGTAGTAGTTTTTGTTTATAGTG-3'、反向引物序列5'-CCAACTCTACAACTACTAAATC-3'；TFR1正向引物序列5'-GCAGGATGAAGGGAGGACAC-3'、反向引物序列5'-GCGATCTGTCAGAGCACCTC-3'；GADPH 正向引物序列5'-GTGAACCATGAGAAGTATG-3'、反向引物序列5'-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3'。將 引 物SYBR Green I Master Mix 和DNA模板混合。反應(yīng)體系：2× SYBR Green Mix 10 μL，RT Product 2 μL，Bulge-LoopTMmiRNA Forward Primer 0.8 μL，Bulge-LoopTMReverse Primer 0.8 μL，加ddH2O 至 20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s 共45個循環(huán)。實驗重復(fù)3次。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用MTT 實驗。取各組細胞，以4×106/孔置于96 孔板中，分別于0、24、48、72 h 每孔加入10 μL MTT 溶液和90 μL 培養(yǎng)液，37 ℃下培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測定490 nm 處吸光度（A490）值。

1.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。將懸浮在100 μL 無血清DMEM 中的2×104個細胞接種到小室的上層隔室中，在上層隔室中預(yù)涂100 μL基質(zhì)膠，將800 μL 含10% FBS 的DMEM 添加到該室的下層隔室中；將細胞用4%多聚甲醛固定30 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色；用棉簽小心除去上室中的非穿膜細胞。隨機選擇5 個視野，用Olympus IX70倒置顯微鏡（×200）拍照，用Image-Pro Plus6.0 軟件計數(shù)穿膜細胞。實驗重復(fù)3次。

1.6 TFR1 蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞，用RIPA 緩沖液裂解，總蛋白進行高溫變性定量，按每孔50 μg 進行蛋白電泳，電泳條件：80 V 40 min，120 V 2 h，轉(zhuǎn)膜至NC 膜，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，并與TFR1一抗（1∶400）及GAPDH一抗（1∶400）在4 ℃下孵育過夜；漂洗3次，加入二抗（1∶500）并常溫孵育2 h；漂洗3 次，用ECL 試劑盒檢測條帶，GAPDH 用作內(nèi)參對照。目的蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.7 miR-199 靶基因檢測 采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐Ｓ蒙飳W(xué)軟件TargetScan 分析miR-199的靶基因，發(fā)現(xiàn)TFR1 為miR-199 的靶基因。將TFR1 基因的3'-UTR 區(qū)域的全長克隆和擴增，PCR產(chǎn)物克隆到pGL4.49 載體克隆位點，其在激活時表達螢火蟲熒光素酶，以形成pGL4.49-TFR1-WT載體或pGL4.49-TFR1-MUT 載體。將含有miR-199 的野生型（WT）或突變型（MUT）結(jié)合位點的TFR1基因的3'-UTR 區(qū)克隆到pGL4.49［luc2p/TCF-LEF RE/Hygro］載體中，而表達海藻熒光素酶的pGL4.73［hRluc/SV40］載體用于控制轉(zhuǎn)染效率。按照說明書，將貼壁細胞分別與pGL4.49-TFR1-wt 載體或pGL4.49-TFR1-mut 載 體 和pGL4.73［hRluc/SV40］載體與Lipofectamine LTX＆PLUS 試劑共轉(zhuǎn)染。孵育24 h 后，用TECAN Infinite F500 平臺和Dual-Luciferase Reporter Assay System 檢測細胞，并檢測熒光素酶信號，將螢火蟲熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性。計算兩種熒光素酶的相對活性（ΔCt）。實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad2.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較用Tukey多重比較檢驗法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌細胞系中miR-199 的表達 結(jié)直腸癌細胞系（LOVE、SW620、SW480、HT29、DLD-1 細胞）、人結(jié)腸上皮細胞系HCoEpiC 細胞中miR-199 相對表達量分別為2.12 ± 0.25、1.38 ± 0.15、2.49 ±0.31、2.18 ± 0.19、2.15 ± 0.28、12.10 ± 0.59。人結(jié)直腸癌細胞系中miR-199 相對表達量均低于人結(jié)腸上皮細胞系（P均＜0.05），且SW620 細胞中miR-199相對表達量最低，故選SW620細胞為實驗細胞。

2.2 轉(zhuǎn)染效率 miR-199 過表達組、陰性對照組、空白對照組miR-199 相對表達量分別為8.10 ±0.93、1.38 ± 0.36、1.35 ± 0.33。miR-199 過表達組miR-199 相對表達量高于陰性對照組、空白對照組（P均＜0.05）。

2.3 過表達miR-199 對SW620 細胞增殖能力的影響 見表1。

表1 各組轉(zhuǎn)染48、72 h細胞增殖能力（A490值）比較（± s）

表1 各組轉(zhuǎn)染48、72 h細胞增殖能力（A490值）比較（± s）

注：與miR-199過表達組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組miR-199過表達組A490值轉(zhuǎn)染72 h 1.36 ± 0.52#1.42 ± 0.41#0.65 ± 0.28#轉(zhuǎn)染48 h 0.67 ± 0.25#0.71 ± 0.31#0.41 ± 0.18

2.4 過表達miR-199 對SW620 細胞侵襲能力的影響 miR-199 過表達組、陰性對照組、空白對照組侵襲細胞數(shù)分別為（123 ± 5）、（210 ± 8）、（213 ± 7）個。miR-199 過表達組侵襲細胞數(shù)少于陰性對照組、空白對照組（P均＜0.05），陰性對照組、空白對照組侵襲細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.5 miR-199 的靶基因 用TargetScan 軟件分析發(fā)現(xiàn)，TFR1 為miR-199 潛在的預(yù)測靶基因，TFR1 存在與miR-199 結(jié)合的位點，TFR1 mRNA 的3'UTR 中存在與miR-199互補的序列?？瞻讓φ战M、miR-199過表達組野生型3'UTR 的TFR1 熒光素酶活性分別為1.05 ± 0.08、0.40 ± 0.03，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；空白對照組、miR-199 過表達組突變型3'UTR 的TFR1 熒光素酶活性分別為1.04 ± 0.06、1.06 ± 0.05，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 過表達miR-199對SW620細胞中TFR1表達的影響 見表2。

表2 各組TFR1表達比較（± s）

表2 各組TFR1表達比較（± s）

注：與miR-199過表達組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組miR-199過表達組TFR1 mRNA 4.02 ± 0.59#4.23 ± 0.48#1.83 ± 0.10蛋白1.40 ± 0.63#1.48 ± 0.52#0.63 ± 0.19

2.7 過表達TFR1對miR-199抑制SW620細胞增殖作用的影響 見表3。

表3 各組轉(zhuǎn)染24、48、72 h細胞增殖能力（A490值）比較（± s）

表3 各組轉(zhuǎn)染24、48、72 h細胞增殖能力（A490值）比較（± s）

注：與miR-199過表達組比較，#P＜0.05。

組別A490值轉(zhuǎn)染72 h 1.39 ± 0.18*1.41 ± 0.21*0.62 ± 0.13 1.45 ± 0.23*轉(zhuǎn)染48 h 0.70 ± 0.26*0.68 ± 0.21*0.41 ± 0.10 0.69 ± 0.18*轉(zhuǎn)染24 h 0.21 ± 0.04 0.23 ± 0.05 0.25 ± 0.03 0.26 ± 0.05空白對照組陰性對照組miR-199過表達組miR-199mimics+TFR1組

2.8 過表達TFR1對miR-199抑制SW620細胞侵襲作用的影響 miR-199 過表達組、陰性對照組、空白對照組、miR-199mimics+TFR1 組侵襲細胞數(shù)分別為（110 ± 19）、（212 ± 25）、（221 ± 32）、（178 ± 29）個。miR-199過表達組侵襲細胞數(shù)少于陰性對照組、空白對照組、miR-199mimics+TFR1組（P均＜0.05）。

3 討論

miRNA 在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。多 種miRNA（miR-21、miR-26、miR-31、miR-141、miR-145、miR-196 和miR-200）與結(jié)直腸癌的遷移和侵襲有關(guān)［15］。識別與結(jié)直腸癌相關(guān)的miRNA及其靶基因?qū)τ诶斫鈓iRNA 在結(jié)直腸癌進展中的作用至關(guān)重要。

miR-199 是一種具有多種功能的RNA 分子，其在癌癥中的作用最先是在肝細胞癌［16］中被發(fā)現(xiàn)。血清miR-199和miR-21可聯(lián)合診斷早期肝細胞癌，后來在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-199 表達顯著下調(diào)，miR-199可抑制體外培養(yǎng)的肝癌細胞的遷移和侵襲并抑制ROCK1 基因表達［17］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a/b-5p 在結(jié)腸癌細胞系中表達下調(diào)，且可靶向下調(diào)GCNT2 表達，調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程，但該文獻并未在結(jié)腸癌組織中檢測miR-199 的表達水平，也未在細胞系中研究miR-199 對細胞增殖、侵襲的影響［18］。這與本研究不同，本研究發(fā)現(xiàn)相較于正常腸上皮細胞系，結(jié)直腸癌細胞系中miR-199 表達顯著降低，提示其在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。研究顯示，在頭頸部鱗狀細胞癌中，miR-199 表達下調(diào)，也發(fā)揮抑癌基因的作用［19］。

本研究通過在結(jié)直腸癌細胞系（SW620）中過表達miR-199 后，結(jié)直腸癌細胞增殖能力受到顯著抑制，且細胞侵襲能力顯著降低。證實miR-199 可在體外培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細胞系中發(fā)揮抑癌基因作用。為探討miR-199 參與結(jié)直腸癌發(fā)生和進展的作用機制，本研究進一步通過生物學(xué)軟件TargetScan 分析發(fā)現(xiàn)，TFR1 為miR-199 的靶基因，TFR1 mRNA 的3'UTR 中存在與miR-199 互補序列；雙熒光素報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，miR-199 的靶基因為TFR1 基因。SW620 細胞中過表達miR-199 后，TFR1 mRNA 和蛋白表達均顯著降低。上述結(jié)果提示miR-199 的靶基因為TFR1。這與CHAO 等［18］報道的靶標(biāo)不一致，原因可能是miRNA 分子有多個不同的靶基因，依據(jù)所結(jié)合的靶基因不同，所起的作用也不盡相同。

TFR1 是一種跨膜糖蛋白，其由位于3 號染色體上的3q29 上TFR1 基因編碼，可協(xié)助運鐵蛋白通過內(nèi)吞作用進入細胞，在細胞的鐵循環(huán)和代謝及輔助細胞葡萄糖代謝，并參與細胞內(nèi)酶的合成和分解［20］。研究顯示，在乳腺癌［21］、非小細胞肺癌［22］和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤［23］中，TFR1 的表達均顯著增加，被認(rèn)為是腫瘤治療的靶標(biāo)［24］。在結(jié)直腸癌中TFR1 可參與癌細胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運和代謝，并且TFR1 過表達促進結(jié)直腸癌細胞增殖［25］。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中TFR1 表達上調(diào)，且可通過激活JAK/STAT 信號通路促進細胞侵襲、增殖和腫瘤發(fā)生［26］，被認(rèn)為是結(jié)直腸癌潛在的治療靶點。JAK/STAT 信號通路的激活可促進多種實體腫瘤的惡性進展，通過活性JAK 磷酸化受體細胞質(zhì)區(qū)域中的酪氨酸殘基，并與STAT的結(jié)合位點結(jié)合，形成STAT 二聚體游向細胞核，結(jié)合特定的啟動子序列，調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等基因轉(zhuǎn)錄過程［27］。TFR1 表達上調(diào)與肝細胞癌的惡性表型相關(guān)，并且可促進癌癥干細胞增殖和侵襲［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-199 過表達組侵襲細胞數(shù)少于其他三組，且miR-199過表達組A490值低于其他三組；而同時轉(zhuǎn)染miR-199 mimics 和TFR1 質(zhì)粒，可減弱miR-199 介導(dǎo)的對SW620 細胞增殖、侵襲的抑制作用。說明miR-199 是通過調(diào)控TFR1 的表達影響細胞增殖、侵襲過程。

綜上所述，miR-199 在結(jié)直腸癌細胞中表達下調(diào)，過表達miR-199通過靶向TFR1抑制SW620細胞增殖和侵襲，其可能是結(jié)直腸癌治療中有希望的分子靶標(biāo)。本研究也存在不足，TFR1的潛在機制尚不完全清楚，miR-199 表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系尚未可知，有待進一步研究。