趙益梅,劉偉強,崔 萍,張曉煜,夏永秀,劉 旭*

(1 西北農(nóng)林科技大學 葡萄酒學院,陜西楊凌 712100;2 茅臺學院釀酒工程系,貴州仁懷 564507;3 寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)業(yè)園區(qū)管理委員會,銀川 750004;4 寧夏氣象科學研究所,銀川 750002;5 中國林業(yè)科學研究院 華北林業(yè)實驗中心,北京 102300)

寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)位于北緯37°43′-39°23′,東經(jīng)105°45′-106°47′,光熱充足、干旱少雨、晝夜溫差大,是國際公認的釀酒葡萄種植“黃金地帶”,也是中國最佳的釀酒葡萄種植區(qū)之一[1]。該產(chǎn)區(qū)地理分布廣、種植面積大,不同子產(chǎn)區(qū)間的氣候條件、土壤特性和栽培技術等均存在一定的差異,葡萄原料質(zhì)量和葡萄酒品質(zhì)表現(xiàn)出相應的區(qū)域差異性。

花色苷、原花色素(又稱縮合單寧)等酚類物質(zhì)是釀酒葡萄果實重要的次級代謝產(chǎn)物,廣泛存在于果皮和種子中,是賦予葡萄果皮與葡萄酒顏色、口感及風味的重要成分。研究表明,釀酒葡萄果實品質(zhì)尤其是酚類物質(zhì)特性與產(chǎn)地密切相關,并受葡萄園的地理位置、氣候、土壤、地形、太陽輻射和葡萄園管理水平等多種因素影響[2]。例如,‘玫瑰香’、‘梅爾諾’、‘蛇龍珠’、‘赤霞珠’等釀酒葡萄品種的果實品質(zhì)分析結果表明,不同產(chǎn)地間葡萄果實酚類物質(zhì)的特性均存在明顯差異[3-5]。

釀酒葡萄‘馬瑟蘭’(Marselan)是由‘赤霞珠’和‘歌海娜’雜交選育而成的中晚熟品種,具有抗旱性強、耐瘠薄、果實品質(zhì)優(yōu)良等特點。該品種于2003年引入寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū),表現(xiàn)出良好的生物學特性和釀酒潛力[6]。近年來種植面積不斷擴大,有望成為未來重要的主栽品種?！R瑟蘭’葡萄和葡萄酒品質(zhì)與氣候、土壤和栽培管理密切相關[7]。研究表明,遮光處理減少了果實中來自于脂肪酸、氨基酸和異戊二烯代謝途徑合成的揮發(fā)性有機化合物的種類和含量[8];不同產(chǎn)區(qū)間‘馬瑟蘭’葡萄與葡萄酒的基本理化指標和感官品質(zhì)差異較大[9,10];秦皇島5個小產(chǎn)區(qū)‘馬瑟蘭’果實的粒重、糖、酸、總酚和總花色苷含量均存在明顯差異,且不同小產(chǎn)區(qū)果皮花色苷單體物質(zhì)和非花色苷酚類物質(zhì)的種類也不同[10]。Lan等[9]基于揮發(fā)性香氣化合物,采用偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)對膠東半島、渤海灣、懷涿盆地、黃土高原和新疆等5個產(chǎn)區(qū)年輕‘馬瑟蘭’葡萄酒的地理來源進行了區(qū)分,但是酚類化合物不能用于產(chǎn)地區(qū)分。

目前,針對賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)‘馬瑟蘭’葡萄果實品質(zhì)尤其是花色苷和原花色素等酚類物質(zhì)特性的相關研究鮮見報道。因此,為了明確賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)‘馬瑟蘭’葡萄果實的花色苷和原花色素特性,探明不同子產(chǎn)區(qū)間果實品質(zhì)的差異性,本試驗以賀蘭山東麓4個子產(chǎn)區(qū)10個代表性酒莊的‘馬瑟蘭’葡萄為材料,對其果實基本理化特性、花色苷和原花色素的組分與含量等進行測定,通過PLS-DA分析篩選出造成不同酒莊果實品質(zhì)差異的主要酚類物質(zhì)指標,并采用主成分分析法(principal component analysis, PCA)對不同酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果實品質(zhì)進行綜合評價,以期為該品種在賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的科學推廣和種植提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2021年在賀蘭山東麓自北往南選擇銀川、農(nóng)墾玉泉營、青銅峽和紅寺堡4個子產(chǎn)區(qū)的10個代表性酒莊(表1),在各酒莊‘馬瑟蘭’葡萄商業(yè)成熟期時采集果實樣品。采樣時,每個酒莊樣地葡萄園隨機選擇5棵生長健康、長勢一致的植株,分別剪下所有果穗,迅速帶回實驗室后剪下所有健康的漿果,然后按照各指標的測定方法隨機選取一定數(shù)量的果粒裝袋,設置3次生物學重復。所有樣品除用于基本理化指標測定外均置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 指標測定及方法

1.2.1 果實基本理化指標

采用電子天平分別稱量20粒漿果的粒重(精度0.01 g),然后用數(shù)顯游標卡尺分別測定漿果的縱橫徑。采用CM-5色差儀(HunterLab公司,美國)測定葡萄果實的L*、a*、b*。L*值代表亮度,值越大亮度越大、顏色越白,值越小顏色越黑。a*值為正,代表紅色,值越大就越紅;a*值為負,代表綠色,值越大就越綠。b*值為正,代表黃色,b*值為負,代表藍色。使用Biosystems(http://www.biosystems.es)試劑盒對葡萄果實可溶性固形物、還原糖和可滴定酸含量在Y15全自動分析儀(Biosystems, Barcelona,西班牙)進行測定。其他常規(guī)理化指標參考《葡萄酒分析檢測》[11]進行測定。每個樣品重復3次。

1.2.2 果皮花色苷特性

采用高效液相色譜儀(安捷倫1260型,美國)測定果皮花色苷的組分與含量,花色苷測定方法參考Downey[12]的方法并略作修改。

(1)樣品提取:隨機取80粒葡萄,冷凍狀態(tài)下迅速將果皮和果肉分離,加液氮研磨成粉狀,避光冷凍干燥24 h,-80 ℃貯藏備用。準確稱取0.03 g果皮干粉于2 mL離心管中,加入1 mL 50%甲醇水溶液,于功率40 Hz、溫度30 ℃下避光超聲提取30 min,然后在4 ℃、8 000 r/min下離心10 min,重復提取3次,收集所有上清液于離心管中保存,過0.22 μm濾膜后上機檢測。

(2)色譜條件:色譜柱Agilent EC-C18(150 mm×4.6 mm),柱溫40 ℃,進樣量25 μL,流速1 mL/min,檢測波長520 nm。流動相A為10%甲酸水溶液;B為10%甲酸甲醇溶液。洗脫程序:0～14 min,18%～29% B;14～16 min,29%～32% B;16～18 min,32%～37% B;18～18.1 min,37%～30% B;18.1～29 min,30%～37% B;29～30 min,37%～100% B;30～32 min,100% B等梯度;32～33 min,100%～18% B;33～36 min,18% B等梯度。每個樣品重復3次。單體花色苷的含量以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷計算。

1.2.3 果實原花色素特性

采用高效液相色譜儀(安捷倫1260型,美國)測定果皮和種子原花色素的亞基組成、含量和平均聚合度(mean degree of polymerization, mDP),提取與測定參考趙益梅[13]的方法。

(1)樣品提取:將80粒漿果稱重后分別撕下果皮和種子,加入液氮分別研磨成粉狀,冷凍干燥24 h,稱重。放入150 mL三角瓶中,加入丙酮水溶液震蕩提取24 h,過濾,粗提液于38 ℃旋轉蒸干,加入10 mL甲醇溶解后用于原花色素特性的測定。取200 μL原花色素提取液加入到等體積的間苯三酚溶液中,50 ℃水浴20 min后終止反應,過0.45 μm濾膜后上機檢測。

(2)色譜條件:色譜柱Chromolith RP-18e(100×4.6 mm),柱溫30 ℃,流速3 mL/min,進樣量20 μL,檢測波長280 nm。流動相A為1%乙酸水溶液,B為1%乙酸乙腈溶液。洗脫程序:0～4 min,3% B等梯度;4～14 min,3%～18% B;14～14.01 min,18%～80% B;14.01～16 min,80% B等梯度;16～16.01 min,80%～3% B;16.01～18 min,3% B等梯度。每個樣品重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019對試驗數(shù)據(jù)進行基本統(tǒng)計分析,采用SPSS 20.0進行單因素方差分析(Duncan,P<0.05)、聚類分析和PCA分析,采用MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)進行PLS-DA分析。

2 結果與分析

2.1 不同酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果實基本理化指標比較

寧夏賀蘭山東麓‘馬瑟蘭’葡萄果實的可溶性固形物、還原糖、可滴定酸和顏色參數(shù)等品質(zhì)指標在10個酒莊間均存在顯著差異(表2),10個酒莊的葡萄果實產(chǎn)量也存在一定的差異(表1)。

表2 不同酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果實的基本理化指標

其中,果實粒重以H-Hd酒莊的最大,顯著高于除Y-H酒莊外的其他8個酒莊;果實橫徑以H-Hd酒莊的最大,顯著高于Y-Mh、Y-Mq、N-C、Q-M和H-P酒莊;果實縱徑以Y-H酒莊的最大,顯著高于除Y-Mh、N-X和H-Hd酒莊外的其他6個酒莊。同時,果實的可滴定酸含量也以H-Hd酒莊最高(6.99 g/L),且與除H-Hs酒莊以外的其他酒莊間均差異顯著;果實可溶性固形物和還原糖含量均以Q-M酒莊最高,分別為34.10%、315.3 g/L,且與其他酒莊間差異顯著,這可能是由于產(chǎn)量較低導致果穗果實間隙較大,從而使其陽光照射充分,促進了糖分的積累。另外,CIELAB顏色分析結果表明,H-Hd酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果實的L*值最低,而a*值為正值中最大,說明其果實顏色最深,顏色最紅;H-P酒莊果實的b*值為負值中最高,說明其果實顏色最藍。

2.2 不同酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果皮花色苷特性比較

由表3可見,10個酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果皮中共檢測出19種花色苷單體,包含5種非?；ㄉ?、5種乙酰化花色苷、3種咖啡酸酰化花色苷和6種香豆?；ㄉ?其含量范圍分別為31.08～80.55 mg/g、8.14～18.72 mg/g、1.68～3.34 mg/g和3.47～9.99 mg/g,分別占果皮花色苷總含量的64.66%～73.76%、14.76%～21.38%、2.84%～4.36%和5.20%～14.86%?？梢?非酰化和乙?；ㄉ帐琴R蘭山東麓‘馬瑟蘭’葡萄果皮花色苷的主要類型。

表3 不同酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果皮花色苷的組成與含量

由表3可知,10個酒莊葡萄果皮中花色苷總含量范圍為46.46～111.91 mg/g。其中,H-Hs酒莊果皮花色苷總含量和非酰化花色苷含量均為最高,分別為111.91 mg/g和80.55 mg/g,且顯著高于其他酒莊;H-Hs酒莊果皮中乙?；ㄉ蘸亢涂Х弱；ㄉ蘸恳沧罡?分別為18.72 mg/g和3.34 mg/g,均與除N-X酒莊外的所有酒莊差異顯著;從‘馬瑟蘭’葡萄果皮花色苷的香豆?；潭葋砜?N-X和H-Hs酒莊的香豆?；ㄉ蘸孔罡?分別為9.99 mg/g和9.30 mg/g,且顯著高于其他酒莊。

2.3 不同酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果實原花色素特性比較

從表4可知,10個酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果皮原花色素共檢測出7種亞基,包括4種延伸亞基和3種末端亞基,其摩爾百分比分別占亞基總量的86.47%～94.06%和5.94%～12.65%,延伸亞基和末端亞基分別以表兒茶素(EC-p)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)為主。其中,EC-p是賀蘭山東麓‘馬瑟蘭’果皮原花色素的主要構成亞基,其占總量的摩爾百分比為50.46%～70.68%,并以H-Hs和Y-H酒莊最高;10個酒莊‘馬瑟蘭’果皮原花色素總含量為13.90～35.68 mg/g,并以H-Hs酒莊含量顯著高于其他酒莊;不同酒莊‘馬瑟蘭’果皮原花色素mDP值范圍為7.43～16.84,以H-Hs、Q-M、Q-H、Y-H和Y-Mh酒莊較高。

表4 不同酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果皮和種子原花色素特性

由表4可見,‘馬瑟蘭’葡萄種子原花色素僅檢測出6種亞基,包括3種延伸亞基和3種末端亞基,其摩爾百分比分別占亞基總量的70.63%～83.39%和16.61%～29.37%,延伸亞基和末端亞基分別以EC-p和兒茶素酯(CA)為主。與果皮相比,種子原花色素中沒有檢測到表沒食子兒茶素延伸亞基(EGC-p)。其中,EC-p和表兒茶素沒食子酸酯延伸亞基(ECG-p)為賀蘭山東麓‘馬瑟蘭’葡萄種子原花色素的主要構成亞基,占總量的摩爾百分比分別為44.93%～67.13%和5.31%～20.58%,其中以H-Hd酒莊的EC-p含量占比最高;不同酒莊‘馬瑟蘭’葡萄種子原花色素的總含量范圍為54.79～108.67 mg/g, 顯著高于果皮;種子原花色素mDP值則低于果皮,范圍為3.58～6.02。

2.4 不同酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果實品質(zhì)多元統(tǒng)計變量分析

2.4.1 PLS-DA和層次聚類分析

A.PLS-DA得分圖;B.PLS-DA載荷圖;C.PLS-DA的VIP得分圖;D.聚類譜系圖;ECG-p-SD. 種子原花色素ECG-p摩爾百分比; EC-p-SD. 種子原花色素EC-p-SD摩爾百分比; TA. 果皮總花色苷含量; Non-acylation Content. 果皮非?；ㄉ蘸? EC-p-SK. 果皮原花色素EC-p摩爾百分比; EGC-p-SK. 果皮原花色素EGC-p摩爾百分比; Pn3g. 芍藥素-3-O-乙酰葡萄糖苷; ECG-p-SK. 果皮原花色素ECG-p摩爾百分比; Dp3g.飛燕草素-3-O-葡萄糖苷; Pt3g. 矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷。

另外,本研究還對葡萄果實花色苷和原花色素特性指標數(shù)據(jù)進行標準化處理,通過系統(tǒng)聚類為組間聯(lián)接,采用歐式距離差平方和法對D值進行聚類分析。

結果(圖1,D)顯示,10個酒莊被劃分為4個類群,第Ⅰ類包括Q-H、H-P、Y-H、N-C、H-Hd和Y-Mq酒莊,其果皮原花色素EC-p、mDP和延伸亞基占亞基總量的摩爾百分比相近;第Ⅱ類包括Y-Mh和N-X酒莊,其果皮原花色素EC、末端亞基占亞基總量的摩爾百分比、乙?；ㄉ照急取n3ag、Pn3cag和Dp3cg(cis)含量均較高;Q-M酒莊單獨成為第Ⅲ類,其果實種子原花色素EC、CA、C-p、末端亞基占亞基總量的摩爾百分比和非?；ㄉ照急染^高;H-Hs酒莊單獨成為第Ⅳ類,其果實含有較高的Cy3g、Pt3g、Pn3g、Mv3g、非?；ㄉ蘸俊t3ag、Dp3ag、Cy3ag、Pt3cag、咖啡酰化花色苷含量、Pn3cg(cis)、Cy3cg(trans)、Pt3cg(trans)和總花色苷含量。

2.4.2 葡萄果實品質(zhì)指標的主成分分析

通過對‘馬瑟蘭’葡萄各品質(zhì)指標測定值進行主成分分析,最終提取5個主成分作為果實品質(zhì)的綜合評價指標,其累積方差貢獻率為88.91%。結果(表5)表明,與主成分1有較高正相關性的指標有色差值a*、果皮原花色素延伸亞基摩爾百分比和果皮原花色素mDP,而負相關性較強的有果皮原花色素延伸亞基摩爾百分比和乙?；ㄉ照急?即主成分1的方差貢獻率大時,色差值a*、果皮原花色素延伸亞基摩爾百分比和果皮原花色素mDP均增加,而果皮原花色素延伸亞基摩爾百分比和乙?；ㄉ照急染鶞p少;與主成分2有較高正相關的品質(zhì)指標有種子原花色素延伸亞基摩爾百分比和種子原花色素mDP,有較強負相關的為種子原花色素末端亞基摩爾百分比和可溶性固形物含量;與主成分3有較強正相關性的為色差值L*、果皮原花色素含量、種子原花色素含量和總花色苷含量,有較強負相關性的為咖啡酰化花色苷含量和漿果粒重;與主成分四有較強正相關的有色差值b*、可滴定酸含量;與主成分5有較強正相關的有香豆酰化花色苷占比,有較強負相關的是非?；ㄉ照急群涂偦ㄉ蘸?。

表5 ‘馬瑟蘭’葡萄果實品質(zhì)指標的主成分分析

5個主成分分別從各個方面反映了‘馬瑟蘭’葡萄果實的品質(zhì),對其品質(zhì)進行綜合評價。利用公式計算出綜合得分:S=S1λ1/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5)+S2λ2/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5)+S3λ3/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5) +S4λ4/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5)+S5λ5/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5),λ1、λ2、λ3、λ4、λ5分別為5個主成分的貢獻率,S1、S2、S3、S4和S5分別為主成分1-5的得分,最終的綜合得分越高,則其綜合品質(zhì)越好。

最終,不同酒莊‘馬瑟蘭’果實品質(zhì)綜合排名為H-Hs>Y-Mq>Q-H>H-Hd>H-P>Y-H>N-X>Q-M> Y-Mh>N-C(表6)。經(jīng)綜合分析,紅寺堡子產(chǎn)區(qū)的果實綜合品質(zhì)均較好,尤其以H-Hs的表現(xiàn)最佳。

表6 不同酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果實品質(zhì)的綜合評價結果

3 討 論

賀蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)處于季風氣候邊緣,氣候多樣和豐富的土壤類型使得該產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄果實品質(zhì)不盡相同,葡萄酒也各有特色[14,7]。本研究中10個酒莊所在地的無霜期均大于160 d,≥10 ℃積溫最低為3 459.2 ℃,遠遠大于葡萄栽培最低界限2 800 ℃,但是10個酒莊的葡萄植株在冬季均需埋土防寒。葡萄園栽培管理措施、種植環(huán)境及品種本身特性等多方面的交互作用[15-16]會通過改變果實粒徑、果皮/果肉/種子比值[17]、漿果化學物質(zhì)構成與含量[18]等影響釀酒葡萄原料的品質(zhì)。

作為紅色釀酒葡萄果實中重要的次級代謝產(chǎn)物,花色苷和原花色素對葡萄果實品質(zhì)形成及葡萄酒的顏色和口感具有重要作用。其中,花青素的甲基化和?；磻a(chǎn)生的衍生物使得果實表現(xiàn)出多種色調(diào)和不同的顏色穩(wěn)定性[19]。目前,在‘馬瑟蘭’葡萄果皮中主要檢測到了13種花色苷單體[9],而本研究中則檢測出了19種花色苷單體,這除了與采用的檢測方法不同外,還可能由于賀蘭山東麓較強的太陽輻射導致果實內(nèi)苯丙烷生物合成途徑相關基因上調(diào),從而增加花青素等花色苷前體物質(zhì)在果實中的合成[20]。此外,產(chǎn)地環(huán)境條件如土壤、光照、熱量、水分、坡向、海拔等對葡萄果實化學成分具有重要的影響[21-22],尤其是揮發(fā)性香氣物質(zhì)和酚類化合物。有研究表明,不同產(chǎn)區(qū)‘馬瑟蘭’葡萄果實香氣物質(zhì)和酚類化合物的含量存在明顯的差異[8],但該研究并未涉及寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)。王寧等[22]、彭婧等[23]研究發(fā)現(xiàn)賀蘭山東麓‘霞多麗’和‘赤霞珠’等品種果實酚類物質(zhì)含量也存在明顯的產(chǎn)地差異性,但呈現(xiàn)出的差異規(guī)律與本研究中‘馬瑟蘭’葡萄有所不同,表明釀酒葡萄品種本身也是造成產(chǎn)地間果實品質(zhì)差異的重要因素。本研究分析了賀蘭山東麓4個子產(chǎn)區(qū)10個酒莊‘馬瑟蘭’葡萄果實基本理化指標、花色苷和原花色素的組分與含量等指標,各個指標相互獨立且不同酚類物質(zhì)的組成與含量差異明顯。其中,H-Hs酒莊葡萄果實果皮總花色苷和總原花色素含量均顯著高于其他大部分酒莊,果實顏色呈現(xiàn)較深的紫紅色,這可能與當?shù)氐耐寥李愋?、光照條件和果實成熟期間≥10 ℃積溫等有關[24]。此外,果實中較多的黃酮醇和黃烷-3-醇有利于花青素的輔色反應,從而增強葡萄果皮顏色強度[24],具體還需要針對‘馬瑟蘭’葡萄做進一步研究。

糖、酸、花色苷和原花色素等酚類物質(zhì)是評價釀酒葡萄果實品質(zhì)的重要因子[25]。為了篩選出賀蘭山東麓不同子產(chǎn)區(qū)‘馬瑟蘭’葡萄果實品質(zhì)差異的重要標志性指標,本研究采用PLS-DA分析和聚類分析確定了造成10個酒莊間葡萄果實品質(zhì)差異的5個關鍵指標:種子原花色素ECG-p摩爾百分比和EC-p摩爾百分比、總花色苷含量、非?；ㄉ蘸颗c果皮原花色素EC-p摩爾百分比,并將10個酒莊劃分成了4類。并通過PCA分析得出‘馬瑟蘭’葡萄在紅寺堡子產(chǎn)區(qū)的種植表現(xiàn)更好,這與文秀萍等的研究結果[26]較為一致,其對賀蘭山東麓‘馬瑟蘭’葡萄的生態(tài)區(qū)劃發(fā)現(xiàn)青銅峽市、紅寺堡區(qū)等地屬于生態(tài)優(yōu)質(zhì)區(qū),這也與本研究中青銅峽子產(chǎn)區(qū)的Q-H酒莊‘馬瑟蘭’果實綜合品質(zhì)排名較前一致。

除了花色苷和原花色素等重要酚類物質(zhì)外,果實香氣化合物也是釀酒葡萄果實品質(zhì)的重要指標。因此,后續(xù)將進一步研究賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)‘馬瑟蘭’葡萄果實香氣物質(zhì)的產(chǎn)地差異性,并結合本研究結果進行綜合評價,從而為該品種在賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的合理化種植提供科學依據(jù)。