張佳琪,張新新,馮佳珺,施婷婷,張鈺麟,王 婧

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610000)

大葉楊(Populuslasiocarpa)是楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)大葉楊組的落葉喬木,主要分布于中國湖北、四川、陜西、云南、貴州等地,生長在海拔1 300～1 500 m的山坡、灌叢等水資源較為豐富的區(qū)域[1],是中國特有的楊屬物種。相較于其他廣域分布的楊屬植物如山楊、銀白楊、青楊等[2],大葉楊的分布范圍較為局限,這可能與其喜濕的生長習(xí)性有關(guān)。近年來,全球氣候變暖導(dǎo)致極端氣候事件頻發(fā),這可能導(dǎo)致干燥地區(qū)變得更加干燥,潮濕地區(qū)則變得更加潮濕[3]。IPCC AR6報(bào)告指出,在過去的50余年,全世界范圍內(nèi)強(qiáng)降水事件頻發(fā)以及干旱事件增加[4],而由此引發(fā)的干旱和洪水等自然災(zāi)害已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了中國林業(yè)建設(shè)與發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的改善。因此在地區(qū)生境條件日益惡劣的背景下,培育抗逆性較強(qiáng)的樹種并制定相應(yīng)的保護(hù)和育種措施是恢復(fù)與重建生態(tài)系統(tǒng)平衡和提高林業(yè)生產(chǎn)力的重要方式。

長期的洪澇會(huì)使得土壤含水量處于飽和狀態(tài),植物的有氧呼吸逐漸替換為無氧呼吸[5],其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長生理和新陳代謝等逐步受到影響[6-8]。如楓楊在水淹12 h后,體內(nèi)類黃酮合成、亞麻酸、茉莉酸等代謝途徑明顯活躍[9]。而缺水造成的干旱脅迫可能導(dǎo)致農(nóng)作物和林木的減產(chǎn),超過其他環(huán)境因子脅迫所造成減產(chǎn)的總和[10]。另外,缺水環(huán)境下也能夠引起植物的葉子或幼果釋放大量的乙烯,從而脫葉、落果[11]。植物也可通過增加體內(nèi)的脫落酸含量以提高抗旱能力[12]。因此為了維持自身的生長發(fā)育,植物在分子水平上已進(jìn)化出一系列響應(yīng)非生物脅迫的機(jī)制。而外界的非生物脅迫也能影響植物體內(nèi)功能基因和調(diào)控基因的表達(dá)[13-14],其中就包括調(diào)控基因表達(dá)的眾多轉(zhuǎn)錄因子家族成員[15]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族在植物的生長發(fā)育、代謝以及生物和非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[16]。根據(jù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的數(shù)量以及是否含有其他結(jié)構(gòu)域?qū)⑵浞譃?個(gè)亞家族[17]:AP2、ERF(響應(yīng)乙烯)、DREB(與脫水響應(yīng)元件結(jié)合)、RAV、Soloist。AP2亞家族含有2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域;ERF和DREB亞家族中只含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域,其共同特點(diǎn)是基因結(jié)構(gòu)中內(nèi)含子數(shù)量很少[18],但是二者具有不同的作用,ERF亞家族主要與乙烯響應(yīng)元件結(jié)合[19],而DREB亞家族,主要通過DRE/CRT順式作用元件來調(diào)控基因的表達(dá)[20];Soloist亞家族也只含有1個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域,但是核苷酸序列和基因結(jié)構(gòu)與ERF等亞家族明顯不同,并且核苷酸序列在很多植物中高度保守[17];RAV亞家族除了含有1個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域外,還帶有1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域。AP2亞家族主要在植物生長發(fā)育階段起重要作用,例如開花[21]、種子生長與萌發(fā)[22]等;ERF主要作用于激素信號傳導(dǎo)、非生物脅迫響應(yīng)等[23];RAV主要參與葉片衰老、生物與非生物脅迫響應(yīng)調(diào)控[24];Soloist在擬南芥中僅包含1個(gè)基因,調(diào)控水楊酸的合成以及防御細(xì)菌病原體的入侵[25]。

目前對于大葉楊的研究多集中于種質(zhì)資源調(diào)查和保存[26],而對于大葉楊如何響應(yīng)非生物脅迫以及其脅迫耐受能力研究鮮有報(bào)道。本研究通過對水淹和干旱脅迫后的大葉楊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定到一系列響應(yīng)脅迫的差異表達(dá)基因,并發(fā)現(xiàn)大葉楊中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員在脅迫響應(yīng)基因中顯著富集,最后篩選出可能參與調(diào)控干旱或水淹脅迫耐受的候選基因。該研究結(jié)果將為今后深入探究極端水分環(huán)境下大葉楊的分子響應(yīng)過程和適應(yīng)性進(jìn)化奠定基礎(chǔ),為大葉楊分子遺傳育種提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大葉楊種子采集于四川省涼山彝族自治州美姑縣瓦候鄉(xiāng)(28°43′N,103°8′E),鋪種萌發(fā)后移至溫室進(jìn)行培養(yǎng),溫室生長條件為:光照16 h,(25±1) ℃,黑暗8 h,(20±1) ℃,空氣濕度在70%左右。待植株高度生長到30～40 cm時(shí),挑選一部分進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以此確定水分脅迫時(shí)間(以出現(xiàn)表型變化但未枯死不影響測序?yàn)闇?zhǔn)),最終確定干旱脅迫時(shí)間為5 d,水淹脅迫為15 d。挑選出長勢均勻良好的植株用于正式試驗(yàn)。

1.2 脅迫處理

正式試驗(yàn)將材料分為3組:水淹(waterlogging stress,WS)處理組(水沒過盆土3 cm左右)、干旱(drought stress,DS)處理組(脅迫開始前保持正常澆水,脅迫開始后停止?jié)菜?干旱脅迫結(jié)束時(shí)土壤含水量約在56%)以及對照(control group,CK)控制組(保持正常澆水,土壤含水量在70%～80%)。為確保脅迫結(jié)束的時(shí)間一致,于2021年11月18日早上9:00先開始水淹脅迫處理,在水淹脅迫的第10天早上9:00 DS組材料停止?jié)菜?開始干旱脅迫處理,期間保持所有處理組及對照組材料在相同環(huán)境,水淹處理組的水每3 d更換1次,以免微生物滋生干擾結(jié)果。

在水淹和干旱脅迫第3天和脅迫結(jié)束的最后一天采集樣品,每組各取3株葉片材料用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序,葉片統(tǒng)一取第5～6片新鮮的成熟葉片,并用液氮速凍后暫存于-80 ℃冰箱。將試驗(yàn)樣品材料送至深圳華大基因股份有限公司(https://www.bgi.com/),使用T7 PE150平臺(tái)進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建和RNA-Seq測序,每組處理的3株材料作為生物學(xué)重復(fù)。

1.3 生物信息學(xué)分析

原始測序數(shù)據(jù)(raw reads)先用FastQC[27]檢驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量,Trimmomatic[28]過濾接頭及低質(zhì)量的reads。過濾后的reads用HISAT2[29]比對到組裝好的大葉楊參考基因組上,再用StringTie[30]統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)量,得到標(biāo)準(zhǔn)化后的TPM(transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads)值。根據(jù)腳本prepDE.py(https://github.com/gpertea/stringtie/blob/master/prepDE.py)生成用于DESeq2[31]差異表達(dá)分析的矩陣(count)文件,將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR(false discovery rate)≤0.05,差異倍數(shù)|log2αFD|≥1的基因定義為差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。topGO[32]包對DEGs進(jìn)行GO富集分析。

1.4 大葉楊A(yù)P2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族分析

在Pfam蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(https://pfam-legacy.xfam.org/)下載AP2保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列(序列號:PF00847)HMM文件,HMMER v3.1b2[33](http://hmmer.org/)鑒定大葉楊基因組數(shù)據(jù)庫中的AP2/ERF候選基因。SMART(https://smart.embl.de/)和NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)在線數(shù)據(jù)庫對基因蛋白序列進(jìn)行檢測,保留有AP2保守結(jié)構(gòu)域的序列用于后續(xù)分析。

在PlantTFDB植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(http://planttfdb.gao-lab.org/)中下載擬南芥AP2/ERF基因家族成員的蛋白質(zhì)序列。Muscle v3.8.31[34]對大葉楊和擬南芥的目的基因蛋白序列進(jìn)行多序列比對,trimAL v.1.4.1[35]快速修剪和對齊,MEGA11[36]中采用 NJ(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap設(shè)置為1 000,在FigTree v1.4.4(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)對樹進(jìn)行可視化。

1.5 qRT-PCR驗(yàn)證

提取RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA原液用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR[37]實(shí)驗(yàn)。NCBI Primer(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)對12個(gè)大葉楊A(yù)P2/ERF家族成員在線設(shè)計(jì)候選基因和內(nèi)參基因的特異性引物(表1),UBQ-10為內(nèi)參基因[38]。采用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的(https://www.vazyme.com/Home.html)試劑Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行定量分析。每個(gè)孔總體系為20 μL:1 μL模板cDNA,0.4 μL上游引物,0.4 μL下游引物,10 μL 2×Tap Pro Universal SYBR qPCR Master Mix,8.2 μL無菌水。每個(gè)樣品有3個(gè)技術(shù)重復(fù)。擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)置為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)40次;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,循環(huán)1次。用2-ΔΔCT法[37]計(jì)算候選基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量。

表1 引物設(shè)計(jì)信息

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對結(jié)果

將不同脅迫下的處理組:水淹3 d(WS-3 d)、水淹15 d(WS-15 d)、干旱3 d(DS-3 d)、干旱5 d(DS-5 d)以及對照組(CK)各3個(gè)重復(fù)的總共15個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行質(zhì)控,得到Q20和Q30的均值分別為97.59%和93.67%和平均GC含量為43.71%和測序深度均在30×以上的clean reads。將其比對到組裝好的大葉楊參考基因組上,平均比對率為93.82%(表2)。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,可用于后續(xù)分析。利用StringTie統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本中基因的TPM值,為了檢驗(yàn)每組數(shù)據(jù)3個(gè)個(gè)體間的重復(fù)性,基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)對不同處理組中3個(gè)生物重復(fù)的表達(dá)量數(shù)據(jù)繪制相關(guān)性熱圖(圖1)。結(jié)果顯示每個(gè)處理組內(nèi)的3個(gè)個(gè)體間,其相關(guān)性都在0.9及以上,表明各處理組內(nèi)的3個(gè)樣本具有良好一致性,可以進(jìn)行下一步分析。

圖1 大葉楊對照和脅迫樣本相關(guān)性熱圖

表2 轉(zhuǎn)錄組樣本數(shù)據(jù)概述

2.1.2 差異表達(dá)基因鑒定

利用DESeq2分別將處理組與對照組進(jìn)行差異分析。干旱處理組:在DS-3d與CK組鑒定到5 747個(gè)DEGs,其中包含3 399個(gè)上調(diào)和2 348個(gè)下調(diào)的DEGs;在DS-5 d與CK組鑒定到8 486個(gè)DEGs,其中上調(diào)和下調(diào)的DEGs分別有4 035,4 451個(gè)(圖2,A,C)。水淹處理組:在WS-3 d與CK組共獲得2 114個(gè)DEGs,其中1 455個(gè)上調(diào)和659個(gè)下調(diào);在WS-15 d與CK組共獲得1 077個(gè)DEGs,上調(diào)和下調(diào)的DEGs分別有572,505個(gè)(圖2,B,C)。隨著水淹脅迫的天數(shù)增加,DEGs的數(shù)量由水淹3 d的2 114個(gè)逐漸減少到1 077個(gè);而隨干旱脅迫天數(shù)增加,DEGs數(shù)量明顯增加。接下來篩選出在WS-3 d和WS-15 d共享的DEGs作為全程響應(yīng)水淹脅迫的DEGs(命名WS-DEGs),同理也篩選出全程響應(yīng)干旱脅迫的DEGs(命名為DS-DEGs),分別鑒定出385個(gè)WS-DEGs和3 986個(gè)DS-DEGs(圖2,A,B)。對二者取交集,其中有237個(gè)WS-DEGs和DS-DEGs共享的DEGs(命名為Shared DEGs),還有148個(gè)WS-DEGs和3 749個(gè)DS-DEGs作為獨(dú)立響應(yīng)水淹和干旱脅迫的DEGs(分別命名為WS-uniq DEGs和DS-uniq DEGs),見圖2,D。大葉楊中響應(yīng)干旱脅迫的差異基因數(shù)量明顯多于水淹脅迫時(shí)差異基因數(shù)量。

2.1.3 差異表達(dá)基因GO富集

為了探究大葉楊在水分脅迫下的生物學(xué)過程及其響應(yīng)脅迫的大致機(jī)理,將上述鑒定到的Shared DEGs、WS-uniq DEGs和DS-uniq DEGs分別進(jìn)行基于Fisher檢驗(yàn)的GO富集。Shared DEGs富集到的生物過程主要包括原花青素生物合成途徑、調(diào)控葉片衰老、對水分刺激的響應(yīng)、光周期以及開花調(diào)控、獲得系統(tǒng)抗性、免疫防御等(圖3,A);在WS-uniq DEGs中,富集到色氨酸代謝、生長素介導(dǎo)的信號通路正調(diào)控、芳香族氨基酸代謝過程、吲哚類化合物的代謝過程等通路(圖3,B);在DS-uniq DEGS中,主要富集到光合通路、葉綠素代謝、獲得系統(tǒng)抗性、應(yīng)激防御反應(yīng)等(圖3,C)。依次以不同類型DEGs(Shared、WS-uniq、DS-uniq)的數(shù)量作為隨機(jī)取樣值,對大葉楊基因組中全部基因進(jìn)行20 000次隨機(jī)抽樣,統(tǒng)計(jì)每次抽樣數(shù)據(jù)集中AP2/ERF家族成員的數(shù)量,比較后發(fā)現(xiàn)AP2/ERF家族成員顯著富集于差異表達(dá)基因中。觀測值表示不同類型DEGs中AP2/ERF基因的數(shù)量(圖3)。

2.2 大葉楊A(yù)P2/ERF家族成員鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

參考Nakano等[18]在擬南芥中對AP2/ERF基因家族成員分類的方法,將大葉楊中的候選基因分為5類,包括AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist。在大葉楊中,有65個(gè)(31%)DREB亞家族基因,103個(gè)(50%)ERF亞家族基因,30個(gè)(14%)AP2亞家族基因,6個(gè)RAV亞家族基因和1個(gè)Soloist亞家族基因,其中ERF亞家族中的基因數(shù)量最多,Soloist亞家族中只有1個(gè)Polas10384基因。利用NJ法則對205個(gè)大葉楊A(yù)P2/ERF家族成員和138個(gè)擬南芥AP2/ERF家族成員進(jìn)行蛋白序列的多重比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。在前人研究中[39],將ERF與DREB亞家族統(tǒng)稱為ERF亞家族,二者主要的區(qū)別在于AP2/ERF結(jié)構(gòu)域中第14位和第19位氨基酸殘基位置不同。因此可以看出,大葉楊中DREB與ERF亞家族成員之間親緣關(guān)系更近。

圓圈代表后續(xù)qPCR實(shí)驗(yàn)中挑選的大葉楊A(yù)P2/ERF基因;黃色和藍(lán)色分別代表干旱和水淹脅迫。

2.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)大葉楊A(yù)P2/ERF基因家族成員在水淹和干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平變化,一共篩選出12個(gè)在水淹和干旱脅迫下基因表達(dá)存在明顯差異的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖5、圖6)。

A.AP2/ERF基因在干旱脅迫下基因聚類熱圖; B.AP2/ERF基因在水淹脅迫下基因聚類熱圖。

前6個(gè)為AP2/ERF基因在干旱脅迫下相對表達(dá)量,后6個(gè)為AP2/ERF基因在水淹脅迫下相對表達(dá)量。

所有候選基因在系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置見圖4。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果和基因熱圖發(fā)現(xiàn)Polas35282、Polas00804、Polas05763、Polas28115在干旱處理下具有明顯下調(diào)趨勢(圖5,A和圖6),其中Polas28115同時(shí)在水淹脅迫下也明顯下調(diào)(圖5,B,圖6)。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基因表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結(jié)果一致,這不僅進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性,也表明篩選的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員基因在受到水分脅迫時(shí)發(fā)生差異表達(dá),可能在大葉楊水淹和干旱脅迫下發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

3 討 論

本研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)對水淹、干旱脅迫和對照的大葉楊樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,得到測序質(zhì)量較好且相關(guān)性系數(shù)均在0.9以上的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析比較大葉楊在不同水分條件刺激下差異基因的變化,發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下DEGs的數(shù)量遠(yuǎn)高于水淹脅迫,推測與大葉楊長期生長在水資源豐富地區(qū)有關(guān),其體內(nèi)可能已經(jīng)進(jìn)化出一系列應(yīng)對水淹、洪澇等非生物脅迫的適應(yīng)性機(jī)制。隨著干旱脅迫天數(shù)增加,DEGs的數(shù)量明顯增加。相反的是,持續(xù)水淹脅迫并沒有導(dǎo)致DEGs數(shù)量的增加。WS-uniq DEGs GO顯著富集在生長素介導(dǎo)的信號通路等,而生長素對植物新生根系的形成具有重要的調(diào)控作用,研究表明施加生長素與吲哚丁酸能夠促進(jìn)蘋果幼苗產(chǎn)生新生根[40],因此推測大葉楊在水淹脅迫后期形成的不定根可能與生長素調(diào)控機(jī)制有關(guān),而不定根的形成能夠緩解植物根系因水淹脅迫而產(chǎn)生的不良影響[41],這表明大葉楊可能具有較高的耐水淹能力。DS-uniq DEGs的GO結(jié)果顯著富集在光合作用通路、葉綠素代謝等過程,參與該過程的基因表達(dá)均呈下調(diào)趨勢。因此進(jìn)一步推測干旱脅迫降低了大葉楊光合作用的能力,這與先前研究提出的楊樹在干旱脅迫下,光合速率和蒸騰速率顯著下降的結(jié)果[42]一致。

AP2/ERF是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,參與了許多植物的非生物脅迫響應(yīng),它主要通過激素調(diào)節(jié)方式應(yīng)對非生物脅迫。在擬南芥[18]、毛果楊等[43]模式植物中已經(jīng)對AP2/ERF基因家族進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)在擬南芥中At4g13040是Soloist家族中唯一成員,正向調(diào)控水楊酸的積累且能夠防御細(xì)菌病原體的入侵[25];玉米中的ZmEREB180屬于ERF亞家族,通過乙烯的誘導(dǎo)表達(dá),從而促進(jìn)不定根的形成來增強(qiáng)玉米的抗?jié)承訹44],而目前尚未對大葉楊中的AP2/ERF基因家族進(jìn)行探究。本研究鑒定了大葉楊中的AP2/ERF家族成員,一共有205個(gè)基因?qū)儆谠摷易?。根?jù)基因表達(dá)聚類熱圖及qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,發(fā)現(xiàn)Polas28115(AtRAP2.4)在水淹和干旱脅迫下均顯著下調(diào),而RAP2.4在擬南芥中參與干旱脅迫應(yīng)答,在提高植物抗旱性中有重要作用[45-46],但尚未有研究揭示其在水淹脅迫下的調(diào)控作用;Polas35282(ATRAP2.7)隨著干旱脅迫的天數(shù)逐漸增加,基因表達(dá)量明顯下調(diào),在四倍體棉花的鹽脅迫和干旱脅迫研究中,發(fā)現(xiàn)RAP2.7的同源基因GhirPA0801G001500為差異表達(dá)基因[47]。該結(jié)果說明大葉楊Polas35282可能參與了干旱脅迫的應(yīng)答過程,至于其調(diào)控機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。

目前極端氣候事件頻發(fā)正在導(dǎo)致動(dòng)植物遭受越來越多的非生物脅迫壓力,如氣溫升高、極端高溫事件頻繁發(fā)生、土壤干旱、土地沙漠化嚴(yán)重。干旱和水淹脅迫作為植物育種生產(chǎn)的一大難題,可能導(dǎo)致作物減產(chǎn)、林木等植物種群的地理分布和生存能力受限。因此探究植物脅迫響應(yīng)的分子基礎(chǔ)并篩選識(shí)別與抗逆性有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子是植物非生物脅迫研究和作物育種的關(guān)鍵。本研究初步探究了大葉楊在水淹和干旱脅迫下基因的差異表達(dá)情況,同時(shí)對廣泛參與非生物脅迫的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行了篩選與鑒定,未來可以聯(lián)合基因組學(xué)、群體遺傳學(xué)進(jìn)一步對大葉楊的適應(yīng)氣候變化潛力和適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制進(jìn)行探究,為大葉楊分子遺傳育種和種質(zhì)資源保護(hù)制定更為完善的方案,這也將為其他林木樹種的遺傳保護(hù)提供更多的思路及參考。