范琳娟, 劉子榮, 吳彩云, 徐雪亮, 康美花, 彭德良, 姚英娟, 姚 健

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所,江西南昌 330200; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100193)

山藥別稱薯蕷、山薯、土薯、野薯等,在我國(guó)是一種常見的薯蕷科植物[1-2]。山藥在南北方地區(qū)均有種植,年產(chǎn)量?jī)H次于馬鈴薯、甘薯和木薯[3]。作為藥食兩用的典型代表,山藥不僅具有很高的食用價(jià)值,還具有很高的藥用價(jià)值,山藥能夠健脾益胃助消化,調(diào)節(jié)人體的免疫系統(tǒng),防止血栓的形成,對(duì)心血管疾病有一定的預(yù)防作用[2]。近些年來(lái),隨著種植面積的擴(kuò)大及同一區(qū)域連續(xù)多年種植現(xiàn)象的出現(xiàn),山藥連作障礙的問(wèn)題也日趨嚴(yán)重,特別是山藥線蟲病越發(fā)嚴(yán)重[4]。作為一種土傳病害,山藥線蟲病較難根治,主要作用于山藥的根系和地下莖塊,對(duì)山藥種植業(yè)造成嚴(yán)重危害,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致山藥減產(chǎn)60%甚至80%以上[5]。目前,山藥線蟲病的防治主要依靠化學(xué)防治,包括土壤熏蒸、藥劑溝施、藥劑灌根等。土壤熏蒸常見藥劑有威百畝、棉隆等;溝施或灌根等方式施用的藥劑主要有噻唑膦、阿維菌素和辛硫磷等?；瘜W(xué)防治山藥線蟲病效果好、見效快[6]。許念芳等研究發(fā)現(xiàn),噻唑膦微囊懸浮劑可以起到長(zhǎng)期防治山藥線蟲病的作用,對(duì)重茬地山藥具有較好的防治效果[4];董文芳等認(rèn)為,威百畝水劑對(duì)防治山藥短體線蟲病的效果較好[7]。

土壤微生物作為土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的動(dòng)力,是決定著土壤化學(xué)特性的重要組成部分,在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)過(guò)程中起著重要的作用[8],在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、有機(jī)質(zhì)分解、污染物的降解及土壤的修復(fù)等方面扮演著重要的角色[9]。土壤微生物群落在一定程度上調(diào)節(jié)著土壤乃至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的功能。土壤微生物的變化可作為評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量、維持土壤肥力和作物生產(chǎn)力的重要指標(biāo)之一[8,10]。在山藥線蟲防治的過(guò)程中,殺線蟲劑的使用不僅對(duì)土壤線蟲群落有一定的消殺作用,也對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成一定的影響。王裔娜等研究表明,土壤熏蒸劑能明顯地影響土壤中真菌和細(xì)菌的生物量比例[11]。Fang等研究發(fā)現(xiàn),二甲基二硫熏蒸雖然在門水平上對(duì)土壤細(xì)菌群落組成沒有明顯影響,但熏蒸后部分細(xì)菌的豐度卻發(fā)生了顯著變化[12]。Liu等研究發(fā)現(xiàn),1,3-二氯丙烯可短暫抑制土壤中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu),但細(xì)菌的豐度在后期可逐漸恢復(fù)[13]。目前,針對(duì)殺線蟲劑對(duì)山藥土壤微生物群落影響的高通量測(cè)序分析研究鮮有報(bào)道。本研究在前期研究基礎(chǔ)上,根據(jù)江西省山藥線蟲的田間發(fā)生規(guī)律確定了2種殺線蟲施藥方案[8,14-15]。目前江西省山藥的種植模式主要有2種：傳統(tǒng)縱向栽培和淺生槽栽培,前者為縱向向下生長(zhǎng),后者為橫向生長(zhǎng)。因此,本研究分別在這2種典型的栽培模式上對(duì)2種殺線蟲施藥方案進(jìn)行了評(píng)價(jià)。為真實(shí)反映殺線蟲劑對(duì)山藥土壤細(xì)菌及真菌群落組成的影響,本研究基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái),采用雙末端測(cè)序的方法,對(duì)用藥后的山藥土壤細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)和真菌 18S rDNA ITS_V1高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序,分析2種用藥方案對(duì)山藥土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及物種組成的影響,探索殺線蟲劑的使用與土壤微生物生態(tài)之間的關(guān)系,為利用土壤微生物生態(tài)指導(dǎo)殺線蟲劑在山藥種植業(yè)中的使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試作物為山藥,土壤樣品采自江西省泰和縣塘洲鎮(zhèn)朱家村(傳統(tǒng)栽培)和洲頭村(淺生槽栽培)山藥。供試藥劑：42%威百畝水劑,由利民化工股份有限公司提供;10%噻唑膦顆粒劑,由佛山盈輝作物科學(xué)有限公司提供;6%寡糖·噻唑膦水乳劑,由佛山盈輝作物科學(xué)有限公司提供。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年4—12月實(shí)施,共設(shè)計(jì)2種施藥方案,在傳統(tǒng)栽培區(qū)(江西省泰和縣塘洲鎮(zhèn)朱家村,114°57′E、26°27′N)和淺生槽栽培區(qū)(江西省泰和縣塘洲鎮(zhèn)洲頭村,114°57′E、26°27′N)分別實(shí)施,2個(gè)栽培區(qū)分別設(shè)置對(duì)照區(qū),以不施用殺線劑為對(duì)照(CK)。小區(qū)面積 20 m2,每個(gè)處理重復(fù)3次。除防治線蟲用藥方案外,各試驗(yàn)區(qū)所有的農(nóng)事操作完全相同。方案1：威百畝,試驗(yàn)田于4月3日施用42%威百畝水劑,按照750 kg/hm2的施用量?jī)端?0 000 kg,蓋膜滴灌薰蒸處理。4月20日揭膜散氣。方案2：噻唑膦+寡糖·噻唑膦,試驗(yàn)田于5月8日施用10%噻唑膦顆粒劑,按照22.5 kg/hm2的施用量拌適量沙撒施于栽薯畦面,并蓋土。7月5日用6%寡糖·噻唑膦水乳劑灌根,按照15 L/hm2的施用量?jī)端?5 000 kg。

1.3 山藥土壤樣品的采集

山藥土壤樣品于12月(山藥成熟期)采集。采集20 cm深的土層,每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取3個(gè)點(diǎn)的土壤樣品,過(guò)2 mm篩,除去土壤樣品中的雜物后置于50 mL的無(wú)菌管中。液氮速凍運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,-80 ℃冰箱保存。樣品采集標(biāo)記記錄見表1。

表1 2種用藥方案處理下山藥土壤樣品采集記錄對(duì)照

1.4 土壤樣品細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子V3～V4及真菌ITS_V1高變區(qū)微生物多樣性測(cè)定

將采集到的土壤樣品,每個(gè)樣本3個(gè)平行,送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)定處理。具體操作步驟：提取土壤樣品總DNA,針對(duì)細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子序列V3～V4區(qū)使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCGCAGCA-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增;真菌 ITS_V1 區(qū)使用引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和 ITS1(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。利用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序。通過(guò)對(duì)Reads拼接過(guò)濾、操作分類單元(OTU)聚類、物種注釋和豐度進(jìn)行分析,利用R語(yǔ)言工具繪制各分類水平下的微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)圖,對(duì)各樣品在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種用藥方案下山藥土壤微生物α多樣性指數(shù)差異性分析

α-多樣性指數(shù)分析可以反映樣本微生物群落的豐富度、均勻度和多樣性。Chao1指數(shù)表征樣本微生物的豐富度,Goods-coverage 指數(shù)表征樣本測(cè)序的覆蓋度,Pielou_e指數(shù)表征樣本微生物分布的均勻度,Shannon指數(shù)表征樣本微生物的多樣性。由圖1可知,樣本微生物的豐富度隨著測(cè)序深度的增加而增加并最終趨于平穩(wěn),意味著測(cè)序深度完全可以反映樣本微生物物種組成特征。由表2及表3可知,檢測(cè)樣本微生物Goods-coverage指數(shù)在95.47%～99.97%的范圍內(nèi),意味著測(cè)序結(jié)果足夠反映樣本所包含的微生物多樣性。

表2 不同處理山藥土壤細(xì)菌α-多樣性指數(shù)

表3 不同處理山藥土壤真菌α-多樣性指數(shù)

2種用藥方案對(duì)于不同栽培模式下的山藥土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響有著明顯的不同。如表2所示,經(jīng)不同用藥方案處理以及1個(gè)山藥生長(zhǎng)周期后,土壤微生物α-多樣性指數(shù)均發(fā)生了變化,尤其是傳統(tǒng)栽培模式下的土壤細(xì)菌的α-多樣性指數(shù)與對(duì)照組相比,發(fā)生了明顯的變化。2種用藥方案處理的土壤細(xì)菌的Chao1指數(shù)、Pielou_e指數(shù)及Shannon指數(shù)明顯高于其對(duì)照組,說(shuō)明2種用藥方案的處理有利于提高傳統(tǒng)栽培模式下的山藥土壤細(xì)菌的豐富度、均勻度及多樣性,明顯地改變?cè)撃Ｊ较碌耐寥兰?xì)菌的微生物群落結(jié)構(gòu)。另外,在淺生槽栽培模式下,方案1處理對(duì)土壤細(xì)菌的豐富度、均勻度和多樣性影響不大,而方案2卻提高了該模式下的土壤細(xì)菌的豐富度、均勻度和多樣性。

由表3可知,經(jīng)2種用藥方案處理后,淺生槽栽培模式下的山藥土壤真菌的豐富度、均勻度以及多樣性都有不同程度的降低,而傳統(tǒng)栽培模式下的山藥土壤豐富度、均勻度以及多樣性卻都有不同程度的提高。

2.2 2種用藥方案下的山藥土壤微生物多樣性韋恩圖分析

由圖2-A可知,不同處理間的土壤共有細(xì)菌OTU數(shù)量為239,獨(dú)有的OTU數(shù)量分別為wbm12c 11 985、yh12c 10 557、ck12c 9 938、wbm12q 8 135、yh12q 9 810、ck12q 8 814。由圖2-B可以看出,不同分組間土壤共有真菌OTU數(shù)量為46,獨(dú)有的OTU數(shù)量分別為wbm12c 758、yh12c 515、ck12c 473、wbm12q 290、yh12q 269、ck12q 316。與對(duì)照組相比,除wbm12q外,試驗(yàn)組的細(xì)菌OTU數(shù)量均高于其對(duì)照組。另外,2種用藥方案處理在傳統(tǒng)栽培模式下的土壤真菌OTU數(shù)量均高于其對(duì)照組,而淺生槽栽培模式下的土壤真菌OTU數(shù)量均低于其對(duì)照組。但總體上傳統(tǒng)栽培模式下的土壤細(xì)菌和真菌的OTU數(shù)量均高于淺生槽栽培模式下的土壤細(xì)菌和真菌的OTU數(shù)量。

2.3 2種用藥方案下的山藥土壤微生物群落組成分析

2.3.1 細(xì)菌群落組成分析 物種注釋結(jié)果顯示,土壤細(xì)菌在門水平上主要分布在放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteria),還有少量的厚壁菌門(Firmicutes)、WPS-2、藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes) 和髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)。經(jīng)2種用藥方案處理后,2種栽培模式下的土壤中的放線菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度變化不大。但在淺生槽栽培模式下,2種用藥方案處理的土壤中變形菌門的相對(duì)豐度有了明顯的提高,藍(lán)藻細(xì)菌門的相對(duì)豐度則明顯降低[12.33%降為3.27%(方案1)和1.05%(方案2)];在傳統(tǒng)栽培模式下,2種用藥方案處理的土壤中變形菌門的相對(duì)豐度均有明顯降低,另外方案1處理的厚壁菌門的相對(duì)豐度卻有明顯的提高(2.86%提高到9.88%)。在綱水平上,土壤細(xì)菌主要分布在放線菌綱(Actinobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria)、產(chǎn)氧光細(xì)菌綱(Oxyphotobacteria)、 嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)和芽孢桿菌綱(Bacilli)。2種用藥方案處理后,淺生槽栽培模式下的山藥γ-變形菌綱的相對(duì)豐度明顯升高,而傳統(tǒng)栽培模式下的山藥γ-變形菌綱的相對(duì)豐度則明顯降低。另外,淺生槽栽培模式下的山藥產(chǎn)氧光細(xì)菌綱經(jīng)2種用藥方案處理后,其相對(duì)豐度明顯降低,尤其是方案1處理后,其相對(duì)豐度從12.30%降為3.16%。在目水平上,土壤細(xì)菌主要分布在纖線桿菌目(Ktedonobacterales)、弗蘭克氏菌目(Frankiales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、土壤紅桿菌目(Solirubrobacterales)、黃單胞菌目(Xanthomonadales)、微球菌目(Micrococcales)、酸桿菌目(Acidobacteriales)、β-變形菌(Betaproteobacteriales)、芽孢桿菌目(Bacillales)、念珠藻目(Nostocales)、加諾卡氏菌目(Pseudonocardiales)、鏈霉菌目(Streptomycetales)、棒桿菌目(Corynebacteriales)和芽單胞菌目(Gemmatimonadales)。 其中,在傳統(tǒng)栽培模式中,2種用藥方案處理均提高了土壤弗蘭克氏菌目和芽孢桿菌目的相對(duì)豐度,降低了根瘤菌目、黃單胞菌目、微球菌目、β-變形菌和鏈霉菌目的相對(duì)豐度。而在淺生槽栽培模式中,2種用藥方案處理則嚴(yán)重降低了念珠藻目的相對(duì)豐度。在屬水平上,2種用藥方案處理提高了傳統(tǒng)栽培模式下的土壤細(xì)菌熱酸菌屬(Acidothermus)、AD3、Subgroup_2和芽孢桿菌屬(Bacillus)的相對(duì)豐度,但對(duì)淺生槽栽培模式下的土壤細(xì)菌影響不大(圖3)。

2.3.2 真菌群落組成分析 根據(jù)物種注釋結(jié)果(圖4),在門水平上,土壤真菌主要分布在子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)。其中子囊菌門的相對(duì)豐度最高,在淺生槽栽培模式中占據(jù)93.3%(ck12q),但經(jīng)方案2處理后,其相對(duì)豐度降為89.7%;而在傳統(tǒng)栽培模式中,其相對(duì)豐度略低(ck12c為87.7%),經(jīng)方案1處理后,其相對(duì)豐度降為60.1%,而該處理下的擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度卻由3.6%提高到11.4%。在綱水平上,土壤真菌主要分布在糞殼菌綱(Sordariomycetes)、盤菌綱(Pezizomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)和散囊菌綱(Eurotiomycetes)。其中,無(wú)論是淺生槽栽培模式還是傳統(tǒng)栽培模式下的土壤真菌,方案1處理都降低了糞殼菌綱的相對(duì)豐度,而方案2處理則提高了糞殼菌綱的相對(duì)豐度;另外,方案1處理大大提高了盤菌綱在淺生槽栽培模式下的相對(duì)豐度,卻降低了盤菌綱在傳統(tǒng)栽培模式下的相對(duì)豐度。2種用藥方案處理都大大地降低了座囊菌綱在傳統(tǒng)栽培模式下的豐度。在目水平上,淺生槽栽培模式下的土壤優(yōu)勢(shì)真菌主要分布在糞殼菌目(Sordariales)、肉座菌目(Hypocreales)和盤菌目(Pezizales),其中方案1用藥方案處理嚴(yán)重降低了糞殼菌目在該培養(yǎng)模式下的相對(duì)豐度,卻提高了盤菌目的相對(duì)豐度;傳統(tǒng)栽培模式下的土壤優(yōu)勢(shì)真菌主要分布在肉座菌目(Hypocreales)、腔菌目(Pleosporales)和盤菌目(Pezizales),方案1處理嚴(yán)重降低了肉座菌目、腔菌目和盤菌目在該模式下的相對(duì)豐度,而方案2處理則提高了肉座菌目和盤菌目在該模式下的相對(duì)豐度,但嚴(yán)重降低了腔菌目的相對(duì)豐度。在屬水平上,淺生槽栽培模式下的山藥土壤真菌主要集中在腐質(zhì)霉屬(Humicola),約占46.7%,2種用藥方案處理均嚴(yán)重降低了腐質(zhì)霉屬在該模式下的相對(duì)豐度,方案1和方案2的處理分別使其降低到了9.9%和39.1%,方案2處理提高了枝葡萄孢屬(Botryotrichum)在該模式下的相對(duì)豐度,由4.2%提高到了22.1%;傳統(tǒng)栽培模式下的山藥土壤真菌主要分布在鐮孢屬(Fusarium)和彎孢屬(Curvularia),其中, 方案2處理提高了鐮孢屬在該模式下的相對(duì)豐度,但降低了彎孢屬的相對(duì)豐度,同樣,方案1處理也降低了彎孢屬在該模式下的豐度,但對(duì)鐮孢屬卻沒有影響。

2.3.3 山藥土壤微生物熱度圖分析 為進(jìn)一步分析2種用藥方案對(duì)土壤微生物在屬水平上的差異,對(duì)細(xì)菌和真菌的優(yōu)勢(shì)屬(前20)進(jìn)行熱圖比較分析。如圖5所示,熱圖上方給出了不同處理下的土壤樣品在屬水平上的差異聚類分析,分為2部分——傳統(tǒng)栽培模式和淺生槽栽培模式。從左側(cè)各優(yōu)勢(shì)屬在不同樣品中的組成聚類差異分析結(jié)果可知,與對(duì)照組相比,在淺生槽栽培模式下,經(jīng)方案1處理后,土壤細(xì)菌的測(cè)序結(jié)果差異主要體現(xiàn)在Actinospica、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、WPS-2、Bryobacter、Acidothermus和Chujaibacter;而經(jīng)方案2處理后的土壤細(xì)菌的測(cè)序差異主要體現(xiàn)在Actinospica;在傳統(tǒng)栽培模式下,與對(duì)照組相比,2種用藥方案處理的山藥土壤細(xì)菌的測(cè)序差異主要體現(xiàn)在Subgroup_2、AD3、Bacillus、Rhodanobacter、Chujaibacter、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、鏈霉菌屬(Streptomyces)、Acidothermus、IMCC26256和Rhodanobacter;除此之外,方案2處理的山藥土壤細(xì)菌在HSB_OF53-F07和KF-JG30-C25也有較大差異。淺生槽栽培模式下,2種用藥方案處理的土壤真菌的差異性均體現(xiàn)在曲霉屬(Aspergillus)、Ovatospora、Microascus、Botryotrichum、Humicola和木霉屬(Trichoderma),而傳統(tǒng)栽培模式下,方案2處理的土壤真菌的差異性體現(xiàn)在青霉屬(Penicillium)、Cephaliophora、Plectosphaerella、Talaromyces、Fusarium、Mortierella、Curvularia、Pyrenochaetopsis、Myrmecridium和Saitozyma,而方案1處理土壤真菌主要在Curvularia、Pyrenochaetopsis、Trechispora、Hamigera、Phallus和Penicillium有較大差異,其余各屬在不同處理間的差異不明顯。

3 討論與結(jié)論

土壤施用化學(xué)藥劑后,對(duì)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性會(huì)產(chǎn)生一定的影響。李君研究了熏蒸劑威百畝對(duì)土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)施用威百畝后,土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到影響,優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化[16]。Li等研究發(fā)現(xiàn),采用威百畝熏蒸后,土壤中細(xì)菌群落和優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生了改變,但是在門水平上,樣本之間差異卻不明顯[17]。卜東欣等利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定威百畝處理后土壤微生物數(shù)量,發(fā)現(xiàn)威百畝對(duì)土壤細(xì)菌先有一個(gè)抑制作用,然后再出現(xiàn)激活作用,最后再恢復(fù)到對(duì)照水平;而真菌在整個(gè)處理期內(nèi),都表現(xiàn)出抑制作用[18]。鄒小明等研究發(fā)現(xiàn),高濃度的三唑磷對(duì)土壤細(xì)菌抑制后又具有促進(jìn)作用,但對(duì)土壤真菌卻一直具有抑制效應(yīng)[19]。殺線蟲劑對(duì)土壤中的微生物起促進(jìn)作用的研究也有報(bào)道。時(shí)立波等研究表明,涕滅威刺激了土壤細(xì)菌繁殖[20];鄧曉等研究表明,辛硫磷對(duì)土壤中細(xì)菌有刺激作用[21]。本研究針對(duì)殺線蟲劑對(duì)山藥成熟期土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)與組成的影響,通過(guò)高通量測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行了研究,分析2種不同用藥方案對(duì)山藥成熟期土壤細(xì)菌和真菌在門、綱、目和屬等不同分類水平上的優(yōu)勢(shì)類群。研究結(jié)果顯示,2種用藥方案對(duì)不同栽培模式下的山藥成熟期土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響大不相同,不僅提高了傳統(tǒng)栽培模式下的土壤細(xì)菌和真菌的豐富度、均勻度及多樣性,也提高了淺生槽栽培模式下的土壤細(xì)菌群落均勻度和多樣性,但卻降低了土壤真菌群落的豐富度。不論是淺生槽栽培模式還是傳統(tǒng)栽培模式,2種用藥方案不會(huì)改變山藥土壤細(xì)菌和真菌的優(yōu)勢(shì)物種組成,僅在不同物種的組成豐度上造成一定的影響。