姜 振, 董 航, 曹昆鵬, 劉守偉, 吳鳳芝

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué),黑龍江哈爾濱 150000; 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院,黑龍江牡丹江 157000)

由于長期連作,黃瓜容易受到土傳病害的影響[1-2]。黃瓜枯萎病是由黃瓜?；图怄哏牭毒鸬囊环N常見且危害最為嚴(yán)重的真菌性土傳病害,該病害在全世界地區(qū)都廣泛發(fā)生,給黃瓜栽培產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重影響[3]。

近年來合理的間、輪、套作模式是緩解連作障礙的有效措施之一,這些種植模式通過增加植物多樣性來緩解植物土傳病害的發(fā)生[4-5]。伴生作為一種不以收獲為目的的特殊間作模式,在一定程度上緩解了連作障礙的發(fā)生[6]。有研究表明,采用分蘗洋蔥伴生番茄的栽培方式,番茄灰霉病的發(fā)生能夠得到顯著緩解[7]。黃瓜與西芹間作可以降低黃瓜枯萎病的發(fā)生,促進(jìn)植株的生長發(fā)育、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì),且兩者間作改變了土壤真菌、細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及土壤酶活性[8]。吳紹軍等研究發(fā)現(xiàn),大蒜伴生西瓜顯著增加了西瓜植株地上、地下干鮮質(zhì)量及產(chǎn)量,顯著降低了西瓜枯萎病的發(fā)病率[9]。小麥?zhǔn)且环N化感植物,其在設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中往往以伴生植物的形式出現(xiàn),采用其伴生,可以降低西瓜枯萎病的發(fā)生,同時可以增加西瓜的產(chǎn)量[10-11]。小麥與黃瓜間作能夠降低黃瓜枯萎病發(fā)病率,并且增加黃瓜根際土壤微生物群落多樣性[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn),相同作物間的不同品種在間作或伴生栽培模式中所起的作用也有所不同,采用不同品種的小麥品種間作對蠶豆枯萎病的抗性有明顯差異,其中云麥47、云麥42這2個處理后,蠶豆的根際微生物有顯著變化[14]。白晶芝等研究表明,分蘗洋蔥伴生番茄可以顯著降低番茄的發(fā)病率,其中M29、M51與番茄伴生后,與對照相比能夠顯著降低番茄的發(fā)病率[15]。董艷等研究表明,不同抗病品種的蠶豆根系分泌物對病原菌抑制率不同,不同品種小麥伴生對蠶豆枯萎病的發(fā)病率都有顯著差異,說明不同品種之間伴生效果也不同[16-17]。

前期研究表明,不同品種小麥對黃瓜枯萎病的防控效果有所不同,其中,采用東農(nóng)123小麥伴生可以降低黃瓜枯萎病發(fā)病率,防治效果較好[18]。本研究在此基礎(chǔ)上,采用盆栽方式,用東農(nóng)123小麥與黃瓜伴生栽培,通過測定超氧化物歧化酶、過氧化物酶等防御酶活性以及PR1、EIN2等相關(guān)抗性基因的表達(dá)量,研究東農(nóng)123小麥伴生黃瓜栽培,對尖孢鐮刀菌脅迫下黃瓜防御酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響,以期為小麥伴生緩解黃瓜連作障礙問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤為大田土,土壤基本理化性質(zhì)：銨態(tài)氮含量為44.78 mg/kg,硝態(tài)氮含量為66.50 mg/kg,速效磷含量為326.37 mg/kg,速效鉀含量為 315.79 mg/kg,有機(jī)質(zhì)含量為64.37 g/kg,pH值為7.6,EC值為1.15 mS/cm。試驗材料黃瓜品種為金秋1號,購自黑龍江省哈爾濱市新春天種子商店。試驗材料小麥品種為東農(nóng)123,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院蔬菜生理生態(tài)研究室提供。供試菌株為黃瓜枯萎病菌,從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站溫室內(nèi)的黃瓜枯萎病病株中分離得到。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2022年3—6月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝中心溫室內(nèi)進(jìn)行。黃瓜常規(guī)育苗,子葉展平時分苗于營養(yǎng)缽中,2葉1心時選取生長一致的幼苗定植于塑料盆(外口徑為22.5 cm×高14.0 cm)內(nèi)。定植7 d后,在每株黃瓜一側(cè),分別成簇撒播20～30粒小麥,當(dāng)小麥生長到20 cm時割掉,以不影響黃瓜生長為準(zhǔn),常規(guī)方法進(jìn)行黃瓜管理,黃瓜生長過程中適時適量澆水。在伴生小麥后20 d澆灌30 mL黃瓜枯萎病病原菌孢子懸浮液,濃度為1.0×107CFU/mL,試驗設(shè)置2個處理,以黃瓜伴生小麥并接種病原菌為處理,以黃瓜接種病原菌且不伴生小麥為對照,每個處理3次重復(fù),每個重復(fù)15盆,隨機(jī)區(qū)組排列。在接種前及接種后6、12、24、48、72、120 h,分別選取各處理長勢一致的黃瓜葉片樣品,放在液氮中速凍后,于-80 ℃冰箱保存,用于相關(guān)酶活性測定,并提取RNA用于相關(guān)抗性基因的測定,每個處理的每個重復(fù)選取3株,結(jié)果取平均值。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 病原菌的活化 采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基進(jìn)行病原菌的活化培養(yǎng)[19]。將滅過菌的培養(yǎng)基放在超凈室中冷卻,當(dāng)溫度達(dá)到室溫時,將培養(yǎng)基快速倒入滅過菌的培養(yǎng)皿內(nèi),將培養(yǎng)基倒到剛好鋪滿培養(yǎng)皿底部為止。接下來將倒入培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基繼續(xù)冷卻,直到培養(yǎng)皿上無明顯水汽后再進(jìn)行下一步,用滅菌后的槍頭挑取菌塊放在培養(yǎng)基上,并封口,放在培養(yǎng)箱中,看到菌落長滿培養(yǎng)皿為止,拿出后放于 4 ℃ 保存。

1.3.2 制備孢子懸浮液 用滅菌后的槍頭取1點“1.3.1”節(jié)制備好的菌餅,放進(jìn)重新制備好并滅完菌的液體培養(yǎng)基中,倒入三角瓶中并將瓶口封死,放在搖床培養(yǎng),7 d左右取出,將菌液用離心管分裝好后,放在離心機(jī)里離心,棄掉離心管中離心好的上清液,用無菌水將剛離心出來的病原菌孢子沉淀配制成濃度為1×107CFU/mL的孢子懸浮液備用。

1.3.3 黃瓜葉片相關(guān)酶活性測定 超氧化物歧化酶活性測定采用氮藍(lán)四唑光化還原法,過氧化物酶活性測定采用愈創(chuàng)木酚法,苯丙氨酸解氨酶活性測定采用苯丙氨酸法,β-1,3葡聚糖酶活性測定參考田菲菲的方法[20]。

1.3.4 黃瓜葉片相關(guān)抗性基因的測定 Trizol Reagent試劑提取方法參照孫國勝等的方法[21]進(jìn)行,提取的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。抗性基因熒光定量PCR(RT-PCR)采用20 μL反應(yīng)體系：8.0 μL TipGreenqPCR SuperMix(2×),上下游引物各0.5 μL,cDNA模板1 μL,加水至20 μL;RT-PCR的反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃ 5 s,60 ℃ 退火/延伸30 s,45個循環(huán)。引物見表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR所用引物

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析以管家基因Actin作為內(nèi)參,采用公式2-ΔΔCT方法計算相關(guān)基因表達(dá)量。數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism 7.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥伴生對尖孢鐮刀菌脅迫下黃瓜葉片防御酶活性的影響

2.1.1 對苯丙氨酸解氨酶活性的影響 由圖1可知,接種尖孢鐮刀菌后,處理后6 h及之后各時期,小麥伴生處理的苯丙氨酸解氨酶活性均高于對照,其中除處理后6 h外,均與對照有顯著差異,在48 h時,苯丙氨酸解氨酶活性最高,與對照相比增加30.70%。

2.1.2 對過氧化物酶活性的影響 由圖2可知,在接種尖孢鐮刀菌6 h及之后,與對照相比,除接種后120 h外,各時期的黃瓜葉片過氧化物酶活性均顯著高于對照,在24 h時最高,較對照增加113.40%。

2.1.3 對β-1,3葡聚糖酶活性的影響 由圖3可知,在接種尖孢鐮刀菌6 h及之后,與對照相比,在各取樣時期,伴生小麥處理的黃瓜葉片β-1,3葡聚糖酶活性均高于對照,均與對照有顯著差異。在接菌后6 h時,β-1,3葡聚糖酶活性開始升高,在48 h時達(dá)到最高,較對照增加85.72%。

2.1.4 對超氧化物歧化酶活性的影響 由圖4可知,在接種尖孢鐮刀菌后,小麥伴生處理的黃瓜葉片超氧化物歧化酶活性呈先升高后降低的趨勢,在接種后12、24、48 h等3個取樣時期,伴生處理的黃瓜葉片超氧化物歧化酶活性均顯著高于對照。在接種后24 h時最高,較對照增加了95.01%。

2.2 小麥伴生對黃瓜尖孢鐮刀菌脅迫下黃瓜葉片抗性相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2.1 對PAL基因相對表達(dá)量的影響 由圖5可知,與對照相比,小麥伴生處理的黃瓜葉片PAL基因表達(dá)量,在接菌后的各取樣時期,均顯著高于對照,整體上呈先升高后降低的趨勢,在48 h達(dá)到最高,是對照的4.57倍。

2.2.2 對POD基因相對表達(dá)量的影響 由圖6可知,接種尖孢鐮刀菌后,小麥伴生處理的黃瓜葉片POD基因表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢,在各時期均比對照高,且均差異顯著,在24 h時的表達(dá)量最高,是對照的6.34倍。

2.2.3 對SOD基因相對表達(dá)量的影響 由圖7可知,在接種尖孢鐮刀菌后,除120 h外,小麥伴生處理的黃瓜葉片SOD基因表達(dá)量均比對照高且均差異顯著,整體上呈先升高后下降的趨勢,在接種后24 h時達(dá)到最高,是對照的2.5倍。

2.2.4 對PR1基因相對表達(dá)量的影響 由圖8可知,接種尖孢鐮刀菌后,在各取樣時期,小麥伴生處理的黃瓜葉片PR1基因表達(dá)量均顯著高于對照,在24 h時達(dá)到最高,此時的表達(dá)量是對照的7.39倍。

2.2.5 對EIN2基因相對表達(dá)量的影響 由圖9可知,接種尖孢鐮刀菌24 h時,小麥伴生處理的黃瓜葉片EIN2基因表達(dá)量最高,是對照的3.45倍,其他各時期的表達(dá)量也比對照高,差異均顯著,整體上表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢。

2.2.6 對LOX基因相對表達(dá)量的影響 由圖10可知,在接種尖孢鐮刀菌后,小麥伴生處理的黃瓜葉片LOX基因表達(dá)量呈升高趨勢,除接種后12、24 h外,在其他各取樣時期, 均顯著高于對照,在接種后120 h時最高,是對照的11.15倍。

3 討論與結(jié)論

充分利用不同作物之間化感作用的性質(zhì)和特點,是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的新思路[22]。小麥?zhǔn)堑湫偷幕行椭参?會影響不同植物的生長[23]。當(dāng)植物受到病原菌侵染時,會產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng)。其中抗氧化酶系統(tǒng)是植物自身保護(hù)的一個重要機(jī)制,當(dāng)植株在受到外界環(huán)境刺激時,植株體內(nèi)活性氧激增,損傷植物細(xì)胞膜系統(tǒng),植物免疫組織受到影響[24]。有研究表明,苯丙氨酸解氨酶在一些抗病性物質(zhì)合成中起重要作用[11]。過氧化物酶作為活性氧清除酶系統(tǒng)中的一個重要保護(hù)酶,在植物抵抗病原菌侵入中起重要作用[18]。當(dāng)病原菌入侵植物體時,β-1,3葡聚糖酶可以破壞真菌的細(xì)胞壁,從而殺死病原菌,保護(hù)植株正常生長[25]。超氧化物歧化酶作為催化劑,可以催化過氧化氫的合成,過氧化氫可作為防御物質(zhì)存在于植物體內(nèi),提高植物抗性[26]。有研究表明,在連作土壤栽培條件下,小麥伴生處理的西瓜葉片苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶活性顯著高于西瓜單作[27]。Xu等研究發(fā)現(xiàn),與西瓜單作相比,小麥伴生處理增加了連作西瓜葉片內(nèi)β-1,3葡聚糖酶活性,可能是西瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的細(xì)胞壁被降解,阻止了致病菌侵染[28]。吳紹軍等研究表明,在連作西瓜栽培條件下,大蒜伴生西瓜處理的西瓜葉片超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性均顯著高于西瓜單作[29]。本研究結(jié)果表明,在尖孢鐮刀菌脅迫下,小麥伴生處理的黃瓜苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、β-1,3葡聚糖酶、超氧化物歧化酶活性,整體上均高于對照,其中,苯丙氨酸解氨酶、β-1,3葡聚糖酶活性均是在接種后48 h時最高,過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性均是在接種后24 h時最高。其可能的原因是小麥伴生黃瓜栽培后,在尖孢鐮刀菌逆境脅迫下,小麥根系分泌物誘導(dǎo)了黃瓜植株體內(nèi)氧化酶活性的升高,消除黃瓜體內(nèi)多余的超氧陰離子自由基,提升了黃瓜抵抗病原菌侵染的能力。魏彥梅等在用西芹鮮根及浸提液對黃瓜枯萎病菌的化感作用機(jī)制的試驗中發(fā)現(xiàn),采用浸提液處理后的黃瓜,過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等3種酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,且各處理均高于對照,其研究結(jié)果[30]與本試驗結(jié)果類似。

有研究報道發(fā)現(xiàn),病程相關(guān)蛋白基因(PRs)在對抗植物病害中起重要的作用,主要是在病原體入侵植物體時發(fā)揮作用。PR1基因表達(dá)量與水楊酸的積累密切相關(guān)并且具有防御真菌的功能[31]。LOX編碼的脂氧合酶是茉莉酸生物合成途徑的第一關(guān)鍵酶,當(dāng)不利的外界因素影響植物正常生長時,LOX是植物響應(yīng)外界信號的關(guān)鍵基因[32]。加速乙烯生物合成的主要條件有3個,其中之一就是受逆境脅迫誘導(dǎo)的乙烯生物合成,在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,EIN2是乙烯相關(guān)防衛(wèi)信號響應(yīng)的必需因子[33]。有研究表明,在小麥伴生體系栽培中,接種西瓜枯萎病病原菌后,小麥伴生提高了西瓜根系抗病基因PR1的表達(dá)量[34]。楊帆研究發(fā)現(xiàn),接種根結(jié)線蟲后,在不同的取樣時間點,分蘗洋蔥、油菜、薄荷、茴香的根系分泌物處理的LOX基因相對表達(dá)量都高于對照[35]。石延霞等研究表明,在接種尖孢鐮刀菌后,經(jīng)BDO-1處理后,黃瓜體內(nèi)EIN2基因相對表達(dá)量從第1天到第7天都有顯著升高[36]。本試驗研究結(jié)果表明,在接種尖孢鐮刀菌后,伴生小麥處理的黃瓜PR1基因、EIN2基因及PAL基因表達(dá)量都顯著高于對照,LOX基因表達(dá)量除12、24 h外,都顯著高于對照,其中PR1基因、EIN2基因及PAL基因表達(dá)量都是隨著時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。SOD基因、POD基因分別調(diào)控超氧化物歧化酶和過氧化物酶的合成,其變化趨勢與超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性的變化趨勢基本一致,皆呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。而兩者之間酶活性及基因達(dá)到峰值的時間不一致,可能是因為基因指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程,使其表達(dá)時間出現(xiàn)錯峰情況。呂慧芳研究表明小麥—西瓜間作通過增加西瓜根系中SA積累,誘導(dǎo)西瓜根系與抗性密切相關(guān)基因表達(dá)量增加,從而誘導(dǎo)整體抗性的提高[37]。小麥伴生黃瓜模式中,小麥根系分泌物可能是通過誘導(dǎo)黃瓜相關(guān)抗病基因的表達(dá),來提高整體抗性,從而提高黃瓜對枯萎病抗性。

綜合以上試驗結(jié)果可知,在接種尖孢鐮刀菌后,小麥伴生提高了黃瓜植株抗氧化酶活性及相關(guān)抗性基因的表達(dá)。分析其可能的原因是小麥根系分泌物進(jìn)入黃瓜根區(qū)土壤后,在尖孢鐮刀菌脅迫下,是小麥根系分泌物誘導(dǎo)了黃瓜植株體內(nèi)酶活性及相關(guān)抗性基因的表達(dá),從而間接地提高了黃瓜植株對尖孢鐮刀菌脅迫的抵御能力。根系分泌物作為植物-土壤-微生物的重要媒介,它能夠起到物質(zhì)交換以及信息傳遞的重要作用,是植物根際區(qū)微生態(tài)特征的關(guān)鍵,同時也是植物響應(yīng)外界環(huán)境脅迫的途徑之一[38]。根系分泌物可以作為一種化感物質(zhì),促進(jìn)或者抑制植物之間的關(guān)系,化感物質(zhì)可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、影響植物生長調(diào)節(jié)劑和酶等方式來影響植物間的關(guān)系。李春霞采用小麥伴生及外源添加小麥根系分泌物的方式,在接種西瓜枯萎病菌后,與對照相比,無論是小麥伴生還是外源添加小麥根系分泌物的方式都顯著增加了西瓜根系內(nèi)的抗性基因的表達(dá)[39]。劉一鳴等研究表明在對羥基苯甲酸脅迫下,采用小麥與蠶豆間作的栽培方式,可以發(fā)現(xiàn)小麥間作處理能夠顯著增加蠶豆根系內(nèi)相關(guān)抗氧化酶活性,從而降低了鐮刀菌對蠶豆的侵染[40]。同樣有研究發(fā)現(xiàn),在接種西瓜枯萎病后,間作小麥處理顯著提高了西瓜根系內(nèi)抗氧化酶活性及相關(guān)抗性基因的表達(dá)[37]。有研究發(fā)現(xiàn),玉米的根系分泌物可以抑制帚梗柱孢菌的生長,同時能夠誘導(dǎo)大豆體內(nèi)相關(guān)病程基因的表達(dá),從而使大豆紅冠腐病的發(fā)生可以得到緩解[41]。根系分泌物誘導(dǎo)黃瓜提高自身抗性不僅僅局限于上述相關(guān)防御酶活性及差異表達(dá)基因誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生,還有可能是根系分泌物自身的特異性物質(zhì)提升了黃瓜的抗病性,接下來的工作重點將是深入研究根系分泌物中的組成成分物質(zhì)對黃瓜枯萎病或枯萎病病原菌的影響。