劉思佳, 曾祥國, 肖桂林, 王 涌, 韓永超

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所,湖北武漢 430072; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院,湖北武漢 430070)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)是薔薇科草莓屬多年生草本植物。草莓果實味道酸甜可口,含有豐富的無機和有機營養(yǎng)物質(zhì)和花青素,香味濃郁,被譽為“水果皇后”[1]。草莓對栽培環(huán)境的適應(yīng)性較強,有著結(jié)果快、成熟早、繁殖快、周期短、經(jīng)濟效益高的特點,在全國各地廣泛種植,目前我國已成為世界第一草莓生產(chǎn)和消費大國[2]。由于草莓在生產(chǎn)中以匍匐莖無性繁殖為主,病毒病較為嚴(yán)重,感染一種病毒時植株往往沒有明顯癥狀,但是病毒侵染會導(dǎo)致植株的抗病性下降,產(chǎn)量降低,畸形果率增加。病毒病是草莓生產(chǎn)中的主要病害之一,對產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展造成嚴(yán)重影響,草莓病毒病的防治是保障草莓生產(chǎn),提升產(chǎn)量與品質(zhì)的關(guān)鍵。

據(jù)不完全統(tǒng)計,目前全球已報道的草莓病毒有20余種,關(guān)于草莓病毒檢測,在我國各地區(qū)也都有過不少相關(guān)研究[3]。楊波等在新疆地區(qū)檢測出草莓鑲脈病毒(strawberry vein banding virus,簡稱SVBV)、草莓斑駁病毒(strawberry mottle virus,簡稱SMoV)和草莓輕型黃邊病毒(strawberry mild yellow edge virus,簡稱SMYEV)并建立了三重PCR體系[4];韓曉玉等在河南地區(qū)檢測出SVBV、SMoV、SMYEV、草莓白化病毒(strawberry pallidosis-associated virus簡稱,SPaV)和草莓壞死休克病毒(strawberry necrotic shock virus,簡稱SNSV),并建立了多重PCR體系,一次檢測5種病毒[5];陳道在福建地區(qū)檢測出SVBV、SMoV、SMYEV、草莓毛形病毒3(strawberry crinivirus 3,SCrV3)、草莓毛形病毒4(strawberry crinivirus 4,簡稱SCrV4)和SPaV,并獲得了SPaV的全基因組序列[6];冉策在北京地區(qū)檢測出SVBV、SMoV、草莓皺縮病毒(strawberry crinkle virus,簡稱SCV)、煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,簡稱TMV)和黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,簡稱CMV)并建立了SCV的RT-LAMP病毒檢測體系,提高了檢測效率和靈敏度[7];劉雅等在上海地區(qū)檢測出SVBV、SMoV、SMYEV[8];黃倩茹等在陜西地區(qū)檢測出SVBV、SMoV、SMYEV、菠菜潛隱病毒(spinach latent virus,簡稱SpLV)和番茄線蟲傳多面體病毒(lycopersicon esculentum nepovirus,簡稱LENV),首次報道在草莓上檢測到SpLV和LENV[9-10];王佳等在遼寧地區(qū)檢測出SVBV、SMoV、SMYEV和SNSV[10-11];朱海生等在四川地區(qū)檢測出SMoV,并且對7個省份的紅顏、白雪公主、隋珠、光點和圣誕紅5個草莓品種調(diào)查發(fā)現(xiàn),感染病毒的品種均為紅顏,而其他品種并未檢測出病毒[12]。

我國草莓產(chǎn)區(qū)內(nèi)常見病毒有3種,分別為草莓斑駁病毒SMoV、SVBV、SMYEV[12]。SPaV最早于20世紀(jì)50年代在美國和澳大利亞被報道,2017年Ding等在福建首次發(fā)現(xiàn)SPaV[13],次年Shi等在河南發(fā)現(xiàn)SPaV[14]。目前關(guān)于草莓病毒病的相關(guān)報道中,病毒檢測時較少說明感染病毒的草莓品種。采用高通量測序技術(shù)對草莓苗進(jìn)行檢測,并利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行驗證,為草莓病毒病的防治以及選育抗病毒品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

本研究于2021年3月至2022年5月在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所完成。

1.1 材料

用于本研究的草莓品種材料為歷年來從各地收集的栽培草莓品種,共86份,保存于湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所草莓種質(zhì)資源圃(避雨網(wǎng)室)。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合樣品中病毒的高通量檢測 對86份草莓品種材料分別采樣,每份樣品采集100 mg新鮮葉片,采用RNA提取試劑盒(HiPure Plant RNA Mini Kit,Magen生物)提取草莓葉片總RNA,每管加入 30 μL RNA free水溶解。樣品檢測合格后,將提取的86份草莓RNA進(jìn)行混樣處理,此樣品命名為PZM01。剩余樣品RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r采集脫毒苗葉片并提取總RNA,命名為TDM01,重復(fù)上述提取步驟,并將2個樣品的Small RNA建庫,測序分析委托北京百邁客生物科技有限公司完成[15-19]?？俁NA的RIN值≥8.0,28S/18S≥1.5。

1.2.2 草莓樣品的RT-PCR檢測 首先采用 RT-PCR 對高通量測序結(jié)果進(jìn)行驗證,然后再分別對每份供試草莓品種樣品的詳細(xì)帶毒情況進(jìn)行檢測。針對每種Small RNA測序檢測到的病毒均采用2對特異性引物進(jìn)行檢測,根據(jù)Small RNA測序拼接結(jié)果中的相應(yīng)病毒基因片段序列,應(yīng)用引物在線設(shè)計網(wǎng)站(https://www.genscript.com/)進(jìn)行引物設(shè)計,引物設(shè)計目的片段大小為400～800 bp。另從已發(fā)表文獻(xiàn)中分別選取3種病毒的特異性檢測引物各1對(表1)。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,Thermo科技有限公司),以混樣總RNA為模板,用隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后采用所設(shè)計的特異性引物分別進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μL,2×TaqMaster Mix 13 μL,10 μmol/L引物各1 μL,加ddH2O至終體積25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃變性4 min;94 ℃變性30 s,退火35 s(退火溫度因引物而異),72 ℃延伸60 s,35個循環(huán);72 ℃延伸反應(yīng)10 min;反應(yīng)結(jié)束后采用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。取PCR產(chǎn)物交至武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。

表1 引物序列

采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,Thermo科技有限公司),分別以86份待測草莓品種樣品的總RNA為模板,用隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后采用所設(shè)計的特異性引物(表1)分別進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。檢測每份樣品中的病毒感染情況。PCR體系及反應(yīng)程序同“1.2.2”節(jié)。

1.2.3 病毒序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析 將測序所得序列在BLAST (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/) 進(jìn)行序列比對,從NCBI中下載相關(guān)病毒序列,利用MEGA6.0中的Clustal W進(jìn)行序列比對,以鄰位法(neighbor joining,NJ)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(表2)。

表2 用于3種病毒系統(tǒng)發(fā)生樹的GenBank登錄號和來源

2 結(jié)果與分析

2.1 混合樣品中病毒的高通量檢測

研究表明,測序共獲得29 556 977個原始測序量,經(jīng)過濾共得到26 581 703個高質(zhì)量序列。此次樣品測序數(shù)據(jù)可作為后續(xù)轉(zhuǎn)錄本拼接的參考序列。測序結(jié)果顯示：從草莓資源混合樣品中共檢測出3種病毒,分別為SMoV、SVBV和SPaV。脫毒苗中并未檢測出病毒。

2.2 草莓品種樣品的RT-PCR檢測

應(yīng)用“1.2”節(jié)設(shè)計的每種病毒2對特異引物,以草莓混樣cDNA為模板,進(jìn)行RT-PCR擴增。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,得到目的片段,大小與預(yù)期相符(圖1)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果通過DNAMAN與目標(biāo)序列比對,一致率符合要求。所有高通量測序分析出的病毒均能得到2對特異性引物的驗證。

應(yīng)用本研究設(shè)計的引物,對86份草莓樣品分別進(jìn)行RT-PCR 檢測,結(jié)果表明,在86份草莓樣品中,有28份樣品檢測到病毒,單一病毒侵染樣品18份,復(fù)合侵染樣品10份。其中,11份樣品帶有SMoV病毒,23份樣品帶有SVBV病毒,5份樣品帶有SPaV病毒(表3)。

表3 草莓病毒的RT-PCR檢測結(jié)果

2.3 病毒序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

本次測序得到的草莓斑駁病毒的部分片段(TRINITY DN691,6 745 bp),與我國分離物(GenBank NO.MT991095.1、GenBank NO.MT991097.1和GenBank NO.MT070751.1)親緣關(guān)系最近。本次測序得到的草莓鑲脈病毒的部分片段(TRINITY DN25710,6 571 bp)與加拿大分離物(GenBank NO. MZ328100.1)親緣關(guān)系最近,與其他分離物親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn),單獨形成一個小支。G431是本次測序得到的草莓白化病毒的部分片段(1 559 bp),單獨形成一個小支,但其與美國分離物(GenBank NO. AY488138.2)聚為一個大支。

3 討論與結(jié)論

我國草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,草莓栽培面積與產(chǎn)量位居世界第一[23-24]。湖北省是我國草莓重要產(chǎn)區(qū)之一,產(chǎn)業(yè)規(guī)模居全國第5,年產(chǎn)值超48億元,產(chǎn)區(qū)分布于武漢、荊州、襄陽等市縣城郊。湖北省作為農(nóng)業(yè)大省,草莓產(chǎn)業(yè)是農(nóng)村種植結(jié)構(gòu)調(diào)整的主要選擇之一[25]。本研究利用高通量測序和RT-PCR方法,對86份栽培草莓品種進(jìn)行了較為全面的檢測與分析,檢測出危害3種草莓的病毒,分別為SMoV、SVBV、SPaV。運用高通量測序技術(shù)可以快速確定感病植株所帶病毒的種類,根據(jù)高通量測序結(jié)果所測得的病毒序列設(shè)計引物,大大提高了病毒檢測的效率。另一方面是高通量測序方法可檢測到未在本地發(fā)現(xiàn)的病毒,可較全面地檢測與鑒定草莓病毒種類。

本研究是首次在湖北地區(qū)發(fā)現(xiàn)SPaV,此前已在我國福建、河南相繼被報道,并已獲得SPaV的全基因組序列[26]。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示,本研究中檢測出的SPaV與我國福建的SPaV親緣關(guān)系較遠(yuǎn),而與美國SPaV相對較近,說明SPaV病毒間的變異較大,本研究檢出的SPaV與國內(nèi)其他已報道的來源可能不同。草莓鑲脈病毒與草莓斑駁病毒是我國常見的草莓病毒,本次檢測出的SVBV與加拿大分離物(GenBank NO. MZ328100.1)親緣關(guān)系最近,而與我國的分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn),說明本研究檢出的SVBV可能來源于加拿大。SMoV與北京、遼寧和山東地區(qū)的親緣關(guān)系較近[27],可能是由國內(nèi)相關(guān)地區(qū)傳播而來。

前人多應(yīng)用指示植物鑒定、血清學(xué)及 RT-PCR等檢測鑒定方法,這些方法局限于只能檢測已知病毒,無法發(fā)現(xiàn)未知病毒,而高通量測序分析可在樣本沒有病毒信息的情況下檢測出樣品中含有的病毒,并可檢測到未知病毒,但是檢測成本相對較高,也會由于樣品中不同病毒含量的差異,導(dǎo)致未能檢測出含量低的病毒[28-30]。

利用高通量測序及RT-PCR方法鑒定出本次湖北省草莓資源中的病毒包括3種,分別為草莓鑲脈病毒、草莓斑駁病毒以及草莓白化病毒。其中帶有草莓鑲脈病毒最多,共有23株,其次為草莓斑駁病毒,共10株,復(fù)合侵染樣品共10份。