吳宇欣, 蔡昌楊, 唐詩(shī)蓓, 謝裕紅, 王曉艷, 朱 強(qiáng)

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院,福建福州 350000; 2.福建省將樂縣林業(yè)局,福建將樂 353300;3. 福建省三明市林業(yè)科技推廣中心,福建三明 353000)

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中,經(jīng)常會(huì)受到多種非生物脅迫的影響,例如冷、熱、干旱、重金屬和鹽脅迫等;這些非生物脅迫會(huì)限制植物的地理分布范圍并降低其生產(chǎn)力[1]。低溫脅迫對(duì)植物影響巨大,會(huì)破壞植物的質(zhì)膜結(jié)構(gòu),降低植物光合作用能力,過(guò)量累積活性氧(ROS),使植物的生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)遲緩甚至停滯等現(xiàn)象[2-4]。

在漫長(zhǎng)的演變進(jìn)化過(guò)程中,植物形成了一系列復(fù)雜高效的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制,來(lái)應(yīng)對(duì)低溫帶來(lái)的威脅。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,植物應(yīng)對(duì)寒冷脅迫的機(jī)制已逐漸明晰[5]。在生理生化水平上,植物生成了可溶性糖、脯氨酸、多胺類化合物等一系列滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和清除活性氧[6-7]。另外,大量蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子在冷應(yīng)激信號(hào)通路中發(fā)揮著作用[8-9]。CBF/DREB1(C-Repeat Binding Factor/Dehydration-Responsive Element-Binding Protein 1)是其中最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[10]。在冷脅迫下,CBF基因受上游的ICE1(Inducer of CBF Expression 1)誘導(dǎo)而大量表達(dá),催化冷調(diào)節(jié)(COR)基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)冷應(yīng)激[11]。與CBF(C-Repeat Binding Factor)依賴型信號(hào)途徑相比,非CBF依賴型信號(hào)途徑也發(fā)揮著重要作用。例如,sfr6(sensitivetofreezing6)基因在不誘導(dǎo)CBF基因的情況下,直接調(diào)控下游COR基因的表達(dá)[12]。同時(shí),冷脅迫相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13]。本文對(duì)近年來(lái)植物響應(yīng)低溫脅迫調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)行綜述,并概述目前利用基因工程手段提高經(jīng)濟(jì)作物抗寒性的研究進(jìn)展,以期為更深入地研究植物低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制提供理論基礎(chǔ),并為培育抗寒能力優(yōu)秀的新品種奠定一定基礎(chǔ)。

1 植物對(duì)低溫脅迫的生理生化響應(yīng)

1.1 冷馴化現(xiàn)象

低溫脅迫包括冷害(0～20 ℃)和凍害(<0 ℃),對(duì)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育具有不良影響[14]。冷害是熱帶及亞熱帶地區(qū)植物遭遇的主要脅迫方式,嚴(yán)重影響水稻、玉米、大豆等農(nóng)作物的生產(chǎn);而凍害則主要影響溫帶地區(qū)植物,對(duì)小麥、油菜等作物產(chǎn)生不利影響[15]。為了應(yīng)對(duì)低溫脅迫帶來(lái)的不良影響,一些物種在不良環(huán)境中逐漸提高自身的耐凍能力,這種現(xiàn)象被稱為冷馴化[15]。植物在冷馴化過(guò)程中,會(huì)重新調(diào)節(jié)光合作用過(guò)程和碳水化合物代謝途徑,對(duì)轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)進(jìn)行重新調(diào)控,修復(fù)細(xì)胞損傷或死亡造成的失衡[16]。同時(shí),植物體內(nèi)生成一些關(guān)鍵的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),例如可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白、多胺類化合物等,用來(lái)抵抗脫水現(xiàn)象并減少冷應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損害[17-21]。過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)等一些抗氧化物酶也在植物體內(nèi)大量累積,以減輕活性氧(ROS)引起的過(guò)氧化損傷[19,22]。此外,植物也通過(guò)調(diào)節(jié)一些激素代謝途徑,例如增加赤霉素、細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、茉莉酸等一些激素的水平,來(lái)增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫的耐受性[23-24]。

1.2 低溫對(duì)植物的生理影響

植物在受到低溫脅迫后,其體內(nèi)的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)和細(xì)胞器形態(tài)會(huì)發(fā)生很大改變[25]。在低溫脅迫下,植物許多細(xì)胞的生理生化功能會(huì)隨著細(xì)胞膜及脂質(zhì)的變化而變化,如細(xì)胞內(nèi)離子的泄露、氨基酸的流失、各種細(xì)胞成分的結(jié)構(gòu)變化,最終會(huì)導(dǎo)致植物壞死或死亡[26]。

首先,遭受低溫影響時(shí),植物的表型會(huì)發(fā)生改變。當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí),氣孔開始閉合,致使CO2滯留在氣孔腔中,無(wú)法與外界進(jìn)行交換,從而影響光合作用的進(jìn)行;同時(shí),參與蔗糖和淀粉生物合成的某些關(guān)鍵酶受到損傷,例如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)發(fā)生失活,直接抑制線性電子傳輸并限制光合產(chǎn)物的數(shù)量[27]。此外,低溫直接影響葉綠體的結(jié)構(gòu)、功能和發(fā)育。當(dāng)植物暴露在低溫下時(shí),參與卡爾文循環(huán)(Calvin Cycle)的2種關(guān)鍵酶景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)的活性明顯降低[3]。這些結(jié)果說(shuō)明,低溫通過(guò)影響植物的呼吸作用和化合反應(yīng)中關(guān)鍵酶的合成,使植物的光合作用受到限制,最終導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育緩慢,植株矮化,葉片萎蔫,根系生長(zhǎng)受損,作物結(jié)實(shí)率低,產(chǎn)量下降。

其次,受低溫脅迫影響期間,植物細(xì)胞中可溶性糖的水平會(huì)有所增加?？扇苄蕴窃谥参矬w內(nèi)起滲透保護(hù)劑的作用,當(dāng)其在細(xì)胞中積累時(shí),滲透濃度增加,致使低溫引起的細(xì)胞收縮效應(yīng)減輕,從而起到保護(hù)細(xì)胞膜免受脫水和冷凍損害的作用[28]。在滲透調(diào)節(jié)方面,脯氨酸也發(fā)揮了重要作用。脯氨酸是一種在植物中廣泛存在的氨基酸,具有獨(dú)特的細(xì)胞功能,不僅參與植物的發(fā)育與代謝,還在防御和脅迫耐受性方面發(fā)揮重要作用[29]。植物處于低溫環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生大量的脯氨酸,可以清除產(chǎn)生的過(guò)量氫離子(H+)以維持有氧呼吸的平衡,并穩(wěn)定多聚核糖體來(lái)提高蛋白質(zhì)的親和性,進(jìn)而提高植物抵御不良環(huán)境的能力[30]?？傊?這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)通過(guò)維持細(xì)胞內(nèi)滲透水平的平衡,來(lái)抵抗低溫脅迫帶來(lái)的不良影響。

最后,低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜的損壞。低溫環(huán)境中,植物組織中開始形成冰晶[34]。首先是細(xì)胞外空間開始結(jié)冰導(dǎo)致滲透壓下降,進(jìn)而使細(xì)胞脫水,最終導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)異變和電解質(zhì)泄漏增加[35]。隨著低溫的持續(xù)刺激,細(xì)胞最終破裂,細(xì)胞質(zhì)流出體外,細(xì)胞質(zhì)膜損傷,最終導(dǎo)致植物死亡。

2 植物低溫脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制研究

在長(zhǎng)期的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,植物進(jìn)化出一系列復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)低溫脅迫,主要包括CBF依賴型信號(hào)途徑和非CBF依賴型信號(hào)途徑。

2.1 CBF依賴型機(jī)制

目前,已有大量研究探索了植物對(duì)寒冷的調(diào)節(jié)機(jī)制。其中,CBF途徑是植物應(yīng)對(duì)低溫脅迫最關(guān)鍵的調(diào)控途徑[36]。而ICE1(Inducer of CBF Expression 1)-CBF(C-Repeat Binding Factor)-COR(Cold Regulated)信號(hào)級(jí)聯(lián)通路,是當(dāng)中最重要的低溫信號(hào)通路[37]。在低溫脅迫條件下,轉(zhuǎn)錄因子ICE1與CBF基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,激活CBFs的表達(dá),被激活后的CBFs進(jìn)一步激活下游COR基因的表達(dá),以此增強(qiáng)植物的抗寒性[38]。

2.1.1 ICE1-CBF-COR調(diào)控途徑 調(diào)節(jié)低溫脅迫信號(hào)最典型的轉(zhuǎn)錄因子是C重復(fù)結(jié)合因子/脫水響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(C-Repeat Binding Factors/Dehydration Responsive Element Binding Protein,CBF/DREB),它屬于在植物生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫反應(yīng)方面發(fā)揮作用的AP2/ERF超蛋白家族ERF家族中的一個(gè)亞家族,僅包含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域[39]。其成員CBF1、CBF2、CBF3(DREB1B、DREB1C、DREB1A)已被證實(shí)參與低溫脅迫反應(yīng)過(guò)程,當(dāng)植物處于低溫條件下能夠在短時(shí)間內(nèi)被誘導(dǎo)[40]。研究證明,3種CBF蛋白有著非常高(86%)的序列相似性,雖然都是受冷響應(yīng)的誘導(dǎo),但這3種CBF蛋白還存在著功能冗余[41]。CBF1、CBF3蛋白在功能上更相似,而CBF2蛋白在表達(dá)模式上相較于其他2個(gè)CBF有所不同。在發(fā)育早期,CBF1、CBF3會(huì)在植物的根、下胚軸、子葉中特異性表達(dá);而CBF2則是在下胚軸、子葉中表達(dá),在根中無(wú)法表達(dá)[42]。有研究證明,在CBF2突變體中,CBF1、CBF3基因的表達(dá)量增加,表現(xiàn)出對(duì)冷凍的耐受性增加,這表明CBF2是CBF1、CBF3表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子[43]。

CBF基因通過(guò)其AP2/ERF DNA結(jié)合域,與下游靶基因啟動(dòng)子中存在的CRT/DRE順式元件(A/GCCGAC)結(jié)合,并激活下游COR基因的轉(zhuǎn)錄以增加耐寒性[44]。冷調(diào)節(jié)(COR)基因在受到調(diào)節(jié)后,會(huì)生成一些抗凍多肽、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、與胚胎發(fā)生和脂質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)以及與激素反應(yīng)和細(xì)胞壁修飾有關(guān)的蛋白質(zhì)等,這些產(chǎn)物可以幫助植物在低溫脅迫下穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),從而增強(qiáng)其耐寒性[45]。

在冷響應(yīng)級(jí)聯(lián)通路的上游,存在bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的成員ICE1(Inducer of CBF Expression 1),它是一種MYC型堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子,在C端含有保守的bHLH結(jié)合結(jié)構(gòu)域,用以與下游的CBF3/DREB1A啟動(dòng)子中的典型MYC順式元件(CANNTG)結(jié)合,正向誘導(dǎo)CBF3/DREB1A調(diào)節(jié)子的表達(dá),而CBF1、CBF2基本上不受影響[46]。而ICE1的同源物ICE2與ICE1在序列上有高度一致性,編碼相同的bHLH結(jié)構(gòu)域序列。ICE1、ICE2均為氣孔形成的主要調(diào)節(jié)因子,并且在調(diào)節(jié)冷反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[47]。目前研究表明,ICE1、ICE2存在著功能冗余,在誘導(dǎo)CBF基因方面具有不同的方式。ICE1、ICE2通過(guò)誘導(dǎo)CBF2來(lái)分別調(diào)節(jié)CBF3、CBF1的表達(dá),降低植物的冷凍耐受性[48]。

2.1.2CBF轉(zhuǎn)錄調(diào)控的正調(diào)控作用 低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程涉及一系列轉(zhuǎn)錄途徑,一些組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子能夠在對(duì)寒冷的反應(yīng)中被激活表達(dá)。試驗(yàn)證明,這些轉(zhuǎn)錄因子會(huì)正向誘導(dǎo)下游CBF基因的轉(zhuǎn)錄。例如,ICE1是CBFs的正調(diào)節(jié)因子,它能夠與下游基因CBF3啟動(dòng)子中的MYC識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合,來(lái)調(diào)控CBF3表達(dá)。ice1突變體中CBF3的表達(dá)能力降低,與野生型相比,該突變體耐寒性大大降低,不能進(jìn)行冷馴化[46]。過(guò)表達(dá)ICE1則大大提高了CBF1、CBF2、CBF3、COR基因的表達(dá),增強(qiáng)了植物的抗凍性[49]。參與信號(hào)傳導(dǎo)的鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子(CAMTA)的轉(zhuǎn)錄因子家族也是CBF的正調(diào)控因子,會(huì)對(duì)溫度快速下降做出反應(yīng)[13]。其具有一個(gè)特異性DNA結(jié)合活性的CG-1結(jié)構(gòu)域,能夠正向調(diào)節(jié)CBF2啟動(dòng)子中的CM2元件,強(qiáng)烈誘導(dǎo)CBF1、CBF2的表達(dá)[50]。油菜素唑耐受因子1(Brassina-Zole-Resistant1,BZR1)是油菜類固醇信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,與靶基因啟動(dòng)子中的BRRE(CGTGT/CG)和E-box(CACGTG和CACTTG)基序結(jié)合,促進(jìn)CBFs、WRKY6、WRKY54以及脫落酸(ABA)受體PYL6等編碼基因的表達(dá),正向調(diào)控植物的耐寒性[51]。同時(shí),BZR1的蛋白質(zhì)水平和磷酸化狀態(tài)依賴油菜素內(nèi)脂(BR)信號(hào)傳導(dǎo)中上游的GSK3樣激酶BIN2(BR-Insensitive 2)的影響,在沒有BRs的情況下,具有活性的BIN2磷酸化BZR1并促進(jìn)其降解,增加植物的冷凍敏感性[52]。

2.1.3CBF轉(zhuǎn)錄調(diào)控的負(fù)調(diào)控作用 除了正向調(diào)控以外,信號(hào)通路中還存在多個(gè)降低植物抗凍性的CBFs負(fù)調(diào)節(jié)因子。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員MYB15被證實(shí)能夠與ICE1發(fā)生作用,并與CBF啟動(dòng)子元件結(jié)合。在冷脅迫下,MYB15表達(dá)上調(diào),過(guò)表達(dá)MYB15顯示CBF基因轉(zhuǎn)錄水平降低,而在MYB15突變體中顯示CBF3、CBF1、CBF2水平增加,表明MYB15參與了CBF基因的冷調(diào)節(jié)過(guò)程,降低了植物的低溫脅迫耐受性[53]。C2H2鋅指蛋白基因ZAT12(ZincFingerTranscriptionFactor12)通過(guò)抑制15個(gè)冷響應(yīng)基因和激活9個(gè)冷響應(yīng)基因的表達(dá),來(lái)調(diào)節(jié)冷馴化。ZAT12還下調(diào)CBFs基因的表達(dá),表明它在植物適應(yīng)低溫脅迫中起負(fù)調(diào)控作用[54]。乙烯信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子EIN3(Ethylene-Insensitive3)會(huì)對(duì)耐寒性產(chǎn)生負(fù)面影響。EIN3蛋白與CBF3啟動(dòng)子中特定的結(jié)合基序結(jié)合,阻止其轉(zhuǎn)錄,同時(shí)細(xì)胞分裂素信號(hào)通路中的A型調(diào)節(jié)因子ARR5、ARR7、ARR15被證實(shí)是EIN3的下游靶基因。在過(guò)表達(dá)EIN3的轉(zhuǎn)基因植物中,ARR5、ARR7、ARR15的轉(zhuǎn)錄和蛋白穩(wěn)定性受到明顯抑制,說(shuō)明EIN3通過(guò)聯(lián)合乙烯和細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)途徑,在冷應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮拮抗作用[55]。

2.2 非CBF依賴型機(jī)制

CBF及其靶基因?qū)τ诶涿{迫信號(hào)至關(guān)重要,但仍然發(fā)現(xiàn)有一些基因是不依賴CBF途徑的,它們功能的增加或缺失不會(huì)影響CBF基因功能的表達(dá),但會(huì)使植物的抗凍能力升高或下降。例如,HY5(ElongatedHypocotyl5)是一種參與光信號(hào)傳導(dǎo)的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子,當(dāng)受到低溫脅迫影響時(shí),E3泛素連接酶COP1(Constitutively Photomorphogenic 1)促進(jìn)HY5的穩(wěn)定表達(dá),通過(guò)非CBF依賴型途徑正向調(diào)節(jié)下游COR基因的表達(dá)[56]。SFR6(SensitivetoFreezing6)基因被證實(shí)通過(guò)CRT/DRE啟動(dòng)子序列基序調(diào)節(jié)下游的COR基因;在冷凍敏感突變體sfr6中,COR基因包括KIN1/2、LTI78、COR15A等的表達(dá)水平顯著降低[12];而在sfr6突變體中,CBF1、CBF2、CBF3的冷誘導(dǎo)表達(dá)則不受影響[57]。HOS9(HighExpressionofOsmoticallyResponsiveGene9)作為一種組成表達(dá)的基因,通過(guò)冷誘導(dǎo)表達(dá),會(huì)使RD29A和其他一些COR基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于野生型;而在突變體hos9-1中,CBF轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)沒有受到影響,卻仍表現(xiàn)出冷凍應(yīng)激的敏感性[58]。

2.3 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

低溫脅迫在植物中誘導(dǎo)廣泛的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾(PTM),對(duì)生成mRNA的質(zhì)量和數(shù)量造成影響,使基因功能發(fā)生改變,最終影響植物的低溫脅迫耐受性。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在冷馴化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。例如,STA1(Stabilized1)作為mRNA前體的剪接因子,參與mRNA的剪切以去除內(nèi)含子,使基因得以正常表達(dá)。而sta1-1突變體在冷誘導(dǎo)COR15A基因的剪接中存在缺陷,使得COR15A基因無(wú)法正常表達(dá),降低了植物的耐寒性,這說(shuō)明STA1的表達(dá)對(duì)植物的耐寒性起著關(guān)鍵作用[59]。核孔蛋白NUP160(Nucleoporin 160)在控制RNA核胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。擬南芥nup160突變體中CBF3的表達(dá)受到抑制,并且破壞細(xì)胞核的mRNA輸送過(guò)程,說(shuō)明NUP160在植物生長(zhǎng)、開花時(shí)間調(diào)節(jié)和低溫脅迫耐受性中起重要作用[60]。滲透反應(yīng)因子LOS4(Low expression of osmotically responsive gene 4)編碼DEAD-box RNA 解旋酶,該解旋酶參與RNA的代謝過(guò)程,LOS4突變體會(huì)負(fù)向調(diào)控CBFs表達(dá),降低RD29A和其他COR基因的表達(dá),從而負(fù)調(diào)節(jié)植物的抗寒性,說(shuō)明LOS4是CBF基因的正調(diào)節(jié)因子,并且在基因調(diào)控和植物耐寒性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[61]。

2.4 翻譯后調(diào)控

在翻譯后修飾(PTM)過(guò)程中,幾個(gè)基因與ICE、CBF、COR基因相互作用,以改變其活性、構(gòu)象、定位和穩(wěn)定性。磷酸化、泛素化和SUMO偶聯(lián)是植物調(diào)節(jié)低溫脅迫反應(yīng)途徑的主要PTM[62]。植物受到冷脅迫時(shí),ICE1受到翻譯后修飾,進(jìn)而影響CBF或其他下游基因的表達(dá)。

2.4.1 磷酸化修飾 磷酸化在植物冷適應(yīng)中起重要作用,是一種可逆的蛋白質(zhì)修飾,對(duì)激酶和磷酸酶具有高度依賴性[11]。最常見的磷酸酶OST1(Open Stomata 1)/SnRK2.6/SRK2E是 ABA 信號(hào)傳導(dǎo)中的絲氨酸/蘇氨酸 (Ser/Thr)蛋白激酶,可以磷酸化ICE1基因,幫助其增加轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性。同時(shí),OST1蛋白還通過(guò)干擾HOS1蛋白與ICE1蛋白的結(jié)合,來(lái)抑制HOS1介導(dǎo)的ICE1降解,雙重作用下增強(qiáng)CBF基因的活性,來(lái)緩解冷應(yīng)激效應(yīng)[63]。除OST1外,絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)級(jí)聯(lián)也通過(guò)磷酸化作用參與植物低溫脅迫反應(yīng)。MAPK是一組能被細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附等細(xì)胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。其級(jí)聯(lián)過(guò)程由MAPK激酶激酶(MAP Kinase Kinase Kinase,MAPKKK)、MAPK激酶(MAP Kinase Kinase,MAPKK)和MAPK組成[64]。在植物感知外界信號(hào)刺激后,首先MAPKKKs磷酸化并激活MAPKKs,激活的MAPKKs隨后磷酸化MAPKs,最后活化的MAPKs磷酸化特定的下游底物,如轉(zhuǎn)錄因子、激酶或其他酶等,共同調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育、生物和非生物脅迫反應(yīng)以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程[65]。響應(yīng)寒冷的級(jí)聯(lián)包括MEKK1、MKK2、MPK4和(或)MPK6激酶[66]。受到冷脅迫后MEKK1被上調(diào),MEKK1激活下游的MKK2,MKK2的直接下游靶標(biāo)MPK4被MKK2特異性磷酸化和激活,同時(shí)MPK3、MPK6也因冷處理而被激活[67]?；罨腗PK3/MPK6級(jí)聯(lián)通路通過(guò)在Ser94、Thr366、Ser403位點(diǎn)處磷酸化而促進(jìn)ICE1的降解,從而減少CBF基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)負(fù)調(diào)控,而MEKK1-MKK2-MPK4級(jí)聯(lián)則是正向調(diào)節(jié)冷反應(yīng),并會(huì)對(duì)MPK3、MPK6激酶活性造成抑制[68]。

2.4.2 泛素化和SUMO化修飾 泛素化是指泛素分子在一系列特異性酶作用下,將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類,選中特定的靶蛋白,對(duì)其進(jìn)行特異性修飾的過(guò)程[69]。泛素化修飾涉及泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3所連接的一系列酶促反應(yīng)。其中,E3-泛素連接酶通過(guò)與靶分子相互作用并為泛素化反應(yīng)提供支架而起最重要的作用[70]。HOS1(High Expression of Osmotically Responsive Gene 1)是一種功能性無(wú)名指蛋白,具有泛素E3連接酶活性,包含一個(gè)變異型RING指結(jié)構(gòu)域,靶向ICE1進(jìn)行泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解,負(fù)調(diào)控CBF的表達(dá),最終降低植物的耐寒性[71]。

另外一種蛋白翻譯后的修飾方式為SUMO化修飾。SUMO分子通過(guò)在E1活化酶、E2結(jié)合酶、E3連接酶級(jí)聯(lián)與靶蛋白偶聯(lián),調(diào)控靶蛋白的結(jié)構(gòu)與功能[72]。而SUMO修飾蛋白SENPs與SUMO分子共同調(diào)節(jié)受體蛋白的SUMO化狀態(tài),特異性地對(duì)底物蛋白進(jìn)行去SUMO化修飾,進(jìn)而改變細(xì)胞功能[73]。目前,SUMO化修飾在控制細(xì)胞周期、維持基因組完整性、控制亞細(xì)胞運(yùn)輸和調(diào)控轉(zhuǎn)錄機(jī)制等方面發(fā)揮著重要作用[74]。SIZ1(SUMO ligase)是一種SUMO E3連接酶,介導(dǎo)與ICE1的偶聯(lián),在低溫下增強(qiáng)ICE1的穩(wěn)定性,有助于誘導(dǎo)CBF3/DREB1A的表達(dá),正向調(diào)節(jié)植物的耐寒性[75]。

基于以上對(duì)植物響應(yīng)低溫脅迫信號(hào)相關(guān)研究進(jìn)行的綜述,歸納出植物響應(yīng)低溫脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子機(jī)制模式圖(圖1)。

3 利用基因工程改良植物抗冷性的相關(guān)研究進(jìn)展

受溫室效應(yīng)的影響,極端天氣頻頻發(fā)生。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中,農(nóng)林類作物常常遭受低溫侵襲,生理發(fā)育過(guò)程遭到破壞,作物生長(zhǎng)不良,最終造成結(jié)實(shí)率低、產(chǎn)量下降甚至植株死亡。隨著全球人口的不斷增加,人們對(duì)各種作物產(chǎn)品特別是糧食的需求越來(lái)越大[78]。利用基因工程手段改良植物的抗逆性,并培育抗寒能力優(yōu)越的品種,收獲更多的作物產(chǎn)量,對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展及社會(huì)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)具有重要意義。

研究表明,在水稻中過(guò)表達(dá)bZIP73、bZIP71,二者形成異二聚體,可以抑制ABA生物合成,促進(jìn)從花藥到花粉的可溶性糖轉(zhuǎn)運(yùn),從而提高水稻在生育期的抗寒性,最終提高結(jié)實(shí)率和籽粒產(chǎn)量[79]。過(guò)表達(dá)DREB1A的轉(zhuǎn)基因水稻,可以增加脯氨酸和各種糖類等滲透保護(hù)劑的含量,提高水稻對(duì)干旱、高鹽、低溫脅迫的耐受性[80]。水稻中表達(dá)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的OsMYB2則增強(qiáng)植物對(duì)鹽、低溫、脫水脅迫的耐受性,并提高種子萌發(fā)率,積累更多的可溶性糖和游離脯氨酸,以促進(jìn)滲透調(diào)節(jié),提高水稻抗寒性[81]。過(guò)表達(dá)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員SNAC2基因,則可以幫助水稻增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,提高對(duì)滲透脅迫的耐受性,并生成一系列過(guò)氧化物酶、鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、賴氨酸酮戊二酸還原酶、重金屬相關(guān)蛋白、鈉/氫交換劑、熱休克蛋白、GDSL樣脂肪酶等產(chǎn)物,最終使植株出現(xiàn)對(duì)寒冷、鹽、脫水脅迫耐受性顯著提高的表型[82]。研究表明,核小GTP酶RAN2在植物體內(nèi)主要起介導(dǎo)細(xì)胞核中GTP和細(xì)胞質(zhì)中GDP交換的作用,因此在水稻中過(guò)表達(dá)RAN2基因,可以促進(jìn)植物細(xì)胞核內(nèi)微管蛋白的正常輸出,從而維持穩(wěn)定的細(xì)胞分裂,最終提高水稻的抗寒性[83]。

研究表明,在玉米中過(guò)表達(dá)ZmbZIP4,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植物的側(cè)根數(shù)量明顯增加,植物的主根變得更長(zhǎng),其根系得到改善,并且生成了許多應(yīng)激反應(yīng)基因和脫落酸合成相關(guān)基因來(lái)增加植物抵抗非生物脅迫的能力[84]。過(guò)表達(dá)ZmMYB31基因則提高了玉米體內(nèi)相關(guān)冷應(yīng)激基因的表達(dá),并且降低了在冷脅迫中造成的離子外滲、ROS含量、低溫光抑制現(xiàn)象,從而在寒冷和過(guò)氧化物脅迫中發(fā)揮正向調(diào)控作用[85]。ZmICE1基因能夠抑制Glu/Asn生物合成基因天冬酰胺合成酶的表達(dá),來(lái)減少ROS的產(chǎn)生,并可以直接調(diào)控DREB1的表達(dá),且ZmICE1啟動(dòng)子與正調(diào)節(jié)因子ZmMYB39結(jié)合,均可顯著增加玉米的抗寒性;過(guò)表達(dá)ZmICE1對(duì)玉米產(chǎn)量相關(guān)性狀沒有明顯的負(fù)面影響,表明過(guò)表達(dá)ZmICE1基因既可培育耐寒玉米新品種,又不會(huì)對(duì)玉米產(chǎn)量造成影響[86]。

有關(guān)轉(zhuǎn)基因小麥和大麥的研究進(jìn)展表明,從小麥的HD-ZipⅠ基因中克隆出HDZI-3、HDZI-4啟動(dòng)子,成功優(yōu)化轉(zhuǎn)基因小麥和大麥中TaCBF5L、TaDREB3基因在非生物脅迫下的表達(dá),可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性,并減少轉(zhuǎn)基因?qū)χ参锇l(fā)育和籽粒產(chǎn)量的負(fù)面影響[87]?？寺〕鏊镜腤RKY71基因啟動(dòng)子和小麥的Cor39基因啟動(dòng)子優(yōu)化TaDREB3的表達(dá),構(gòu)建大麥轉(zhuǎn)基因株系;與野生型相比,過(guò)表達(dá)TaDREB3明顯提高了大麥的抗凍性,并提高了冷響應(yīng)基因的表達(dá)量,同時(shí)沒有對(duì)植物特性和籽粒產(chǎn)量產(chǎn)生負(fù)面影響[88]。從小麥中分離出DREB/CBF基因TaRAP2.1L,作為一種脅迫響應(yīng)型轉(zhuǎn)錄抑制因子,生成的TaRAP2.1L突變體植株可以激活DREB/CBF下游基因的表達(dá),從而增強(qiáng)小麥抗凍和抗干旱能力,同時(shí)沒有對(duì)小麥的生長(zhǎng)和生產(chǎn)造成負(fù)面影響[89]。

在番茄中過(guò)表達(dá)冷調(diào)節(jié)基因LeCOR413PM2(Cold-Regulated413-PlasmaMembrane2),可減輕植物細(xì)胞膜的損傷,降低植物體內(nèi)ROS的積累和PSⅡ的光抑制現(xiàn)象,而且可以維持體內(nèi)抗氧化酶的高活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量,從而提高轉(zhuǎn)基因番茄植株的耐寒性[90]。HY5-MYB15-CBFs轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)反應(yīng)已被研究證實(shí)在番茄的冷反應(yīng)中起重要作用,當(dāng)在番茄中過(guò)表達(dá)HY5或MYB15基因時(shí),均能激活CBF1、CBF2、CBF3的表達(dá),從而增強(qiáng)番茄作物的耐寒性[91]。在番茄中過(guò)表達(dá)油菜類固醇受體SlBRI1(BrassinosteroidInsensitive1),則可以降低MDA、ROS的積累,提高SOD、POD、CAT的活性。并且在過(guò)表達(dá)SlBRI1的轉(zhuǎn)基因植株中,ICE1、CBFs相關(guān)基因表達(dá)量明顯增高,說(shuō)明SlBRI1通過(guò)影響ICE1-CBF-COR途徑的轉(zhuǎn)錄水平,并正向影響ROS清除系統(tǒng)、光系統(tǒng)的光抑制以及植物激素的生物合成和信號(hào)傳導(dǎo),來(lái)增加番茄對(duì)寒冷壓力的耐受性[92]。而在番茄中過(guò)表達(dá)SlDREB3,可以幫助番茄在冷應(yīng)激下減輕ROS積累和因冷凍引起的細(xì)胞損傷,與此同時(shí),還可通過(guò)激活SlLEA基因的表達(dá),提高轉(zhuǎn)基因品系對(duì)低溫脅迫的耐受性[93]。

4 總結(jié)與展望

低溫脅迫作為一種主要的非生物脅迫,對(duì)植物影響巨大,是影響全球農(nóng)林作物生長(zhǎng)及生產(chǎn)的主要因素之一;對(duì)相關(guān)農(nóng)作物進(jìn)行耐低溫能力研究,對(duì)于糧食生產(chǎn)及社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。到目前為止,植物的耐寒機(jī)制研究已經(jīng)取得重大突破,其中ICE1-CBF-COR信號(hào)級(jí)聯(lián)通路在植物抗寒方面起著至關(guān)重要的作用。本綜述總結(jié)了植物在耐寒性方面所發(fā)揮的多重調(diào)控作用,包括CBF依賴型信號(hào)途徑和非CBF依賴型信號(hào)途徑,并著重介紹了關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CBF在植物感知低溫信號(hào)過(guò)程中發(fā)揮的功能及其依賴于CBF信號(hào)通路對(duì)于植物平衡生長(zhǎng)、發(fā)育和對(duì)低溫脅迫響應(yīng)方面的所發(fā)揮的作用。目前,基因工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用于改良植物性狀,將外源基因通過(guò)轉(zhuǎn)化插入植物的基因組中,定向改變植物的功能性狀,同時(shí)克服了傳統(tǒng)育種的周期長(zhǎng)、效率低等弊端[94]。本文歸納了多個(gè)農(nóng)業(yè)作物物種(水稻、小麥、番茄等)利用基因工程技術(shù)在抗寒性方面已經(jīng)取得的成就,旨在為今后改良植物抗性研究提供一定基礎(chǔ)。

由于低溫脅迫影響植物從體外到細(xì)胞的各個(gè)方面,形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò),需要從細(xì)胞、蛋白、代謝等水平對(duì)其進(jìn)行研究,因此仍需要進(jìn)一步研究揭示冷馴化過(guò)程中植物通過(guò)感知環(huán)境變化來(lái)調(diào)整自身發(fā)育的機(jī)制。隨著溫室效應(yīng)的逐年增強(qiáng),極端環(huán)境出現(xiàn)的頻率越來(lái)越高,因此對(duì)植物進(jìn)行更多的抗寒性研究,提高植物抗寒冷的能力,進(jìn)而培育出抗凍能力優(yōu)越的植物新品種和種質(zhì)資源,仍具有非常重要的意義。