蔣 斌 謝興旺 （武漢市第三醫(yī)院，武漢 430000）

結(jié)腸癌是常見的消化道腫瘤，隱蔽性強(qiáng)，預(yù)后差［1］。機(jī)體免疫是控制癌細(xì)胞增長的防線，Th17 細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群，Th17 在維持腸道內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其分泌的IL-17、IL-22 等細(xì)胞因子是結(jié)直腸癌的促進(jìn)因素［2-3］。張靜［4］研究顯示，老年結(jié)腸癌患者外周血中Th17 細(xì)胞比例顯著高于同期健康者，WANG 等［5］發(fā)現(xiàn)人參果濃縮物可通過抑制Th17 細(xì)胞分化預(yù)防結(jié)腸癌。Th17 分泌的IL-17 可通過促進(jìn)腫瘤血管生成、促腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［6-7］。因此抑制CD4+T 細(xì)胞的Th17 分化可能是結(jié)腸癌的治療途徑之一。沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silent information regulator 2，SIRT2）是SIRTs家族成員，屬于去乙?；?，參與新陳代謝、基因表達(dá)沉默、DNA 損傷修復(fù)等多種過程，SIRTs 家族與腸道相關(guān)疾?。c炎、結(jié)腸癌）關(guān)系密切，但SIRT2 在結(jié)腸癌中的研究較少，XU等［8］認(rèn)為硫肉豆蔻可通過阻斷Th17 分化和抑制SIRT2 誘導(dǎo)的代謝，改善結(jié)腸炎，且SIRT2 可能通過調(diào)控Th17 的分化發(fā)揮作用，SIRT2 能否在結(jié)腸癌中參與Th17 細(xì)胞分化仍未可知。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在 結(jié) 腸 癌 患者、結(jié)腸癌細(xì)胞系中均呈高表達(dá)，且生物信息學(xué)網(wǎng)站中預(yù)測SIRT2 與HIF-1α 存在靶向關(guān)系［9-10］。因此，本研究重點(diǎn)探討SIRT2 在腫瘤微環(huán)境中CD4+T細(xì)胞向Th17 細(xì)胞分化中的作用以及對HIF-1α 的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠、細(xì)胞及試劑 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26（CBP61189）購自南京科佰生物科技有限公司；SIRT2 過表達(dá)病毒由吉凱基因構(gòu)建；SuperScript ⅥVILOTMcDNA 合成試劑盒（11754250）、SYBR Green PCR Mastermix（1309155）購自ThermoFisher；Trizol（R0016）、CCK-8 試劑盒（C0038）、TUNEL 試劑盒（C1091）購自上海碧云天公司；SIRT2（ab211033）、HIF-1α（ab51608）、GAPDH（ab8245）、Ki67（ab9274 2）、CD4-PE（ab252151）、IL-17-FITC（ab279597）抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（ab6721）均購自美國Abcam 公 司；IL-17（ml1037866）、IL-6（ml002293-J）試劑盒購自上海酶聯(lián)公司；24 只C57BL/6 小鼠（雄性，6～8 周），許可證號：SCXK（湘）2019-0004，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及SIRT2 過表達(dá) 將CT26 細(xì)胞株置于DMEM 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于CO2培養(yǎng)箱中，及時更換培養(yǎng)液（24 h），融合至80%左右傳代。取對數(shù)生長期CT26 細(xì)胞于6 孔板內(nèi)，細(xì)胞量為1×105個/孔，待細(xì)胞貼壁后將完全培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，并加入轉(zhuǎn)染試劑10 μg polybrene，加入SIRT2 過表達(dá)病毒（病毒∶細(xì)胞=80∶1），每8 h 更換1 次培養(yǎng)基，72 h 后添加1 μg/ml 嘌呤霉素篩選穩(wěn)定SIRT2過表達(dá)細(xì)胞，即CT26/SIRT2細(xì)胞。

1.2.2 qRT-PCR檢測SIRT2 mRNA和HIF-1α mRNA水平 用Trizol 提取細(xì)胞總RNA。測定RNA 濃度，用試劑盒將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板用SYBR Green PCR Mastermix 進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。反應(yīng)條件為預(yù)熱50 ℃ 2 min，94 ℃ 10 min，然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，共40 個循環(huán)。引物序列NCBI 的Primer-Blast 軟件設(shè)計，生物公司合成。采用2-ΔΔCt相對定量的方法對SIRT2 mRNA、HIF-1α mRNA進(jìn)行定量。

1.2.3 Western blot 法檢測SIRT2、HIF-1α 蛋白水平 用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液冰上提取細(xì)胞蛋白并用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，將20 μg 細(xì)胞總蛋白上樣進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜。PVDF 膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，用特異性一抗SIRT2、HIF-1α（1∶1 000稀釋）在4 ℃孵育過夜，膜經(jīng)TBST緩沖液漂洗3次后，用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。膜經(jīng)TBST緩沖液漂洗3次后，用超級ECL發(fā)光試劑盒顯影并在成像系統(tǒng)上曝光，掃描結(jié)果經(jīng)圖像分析系統(tǒng)處理，測定各條帶光密度值進(jìn)行定量分析。

1.2.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖抑制率 將對數(shù)生長期CT26、CT26/SIRT2細(xì)胞接種至96孔板（2×103個/孔），每 組 設(shè) 置6 個 復(fù) 孔，培 養(yǎng)48 h 后 每 孔 加 入10 μl CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度（OD），以CT26細(xì)胞為對照，CT26/SIRT2細(xì)胞增殖抑制率（%）=ODCT26/SIRT2/ODCT26×100%。

1.2.5 結(jié)腸癌細(xì)胞移植瘤模型構(gòu)建 取對數(shù)生長期CT26、CT26/SIRT2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個/ml，注射10 μl于C57BL/6小鼠右后肢，每組各12 只，28 d 后處死，剝離小鼠腫瘤組織稱重，并觀測腫瘤體積，腫瘤體積=長徑×短徑2/2。

1.2.6 Ki67 染色觀察腫瘤組織細(xì)胞增殖情況 每組選取6只小鼠腫瘤組織，一部分用4%多聚甲醛固定腫瘤組織制備石蠟切片，抗原修復(fù)后，血清封閉1 h，加入Ki67 抗體4 ℃反應(yīng)過夜，PBS 洗滌3 次后，用生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，PBS 洗滌3 次后加入鏈霉素卵白素工作液、DAB 染色液，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。隨機(jī)選取5個視野，觀察Ki67細(xì)胞陽性表達(dá)。

1.2.7 TUNEL 染色觀察腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況取1.2.6 中石蠟切片，通過TUNEL 試劑盒進(jìn)行凋亡檢測，統(tǒng)計凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.8 腫瘤組織勻漿上清液IL-17、IL-6 表達(dá) 將1.2.6 中另一部分腫瘤組織勻漿后離心，吸取上清液，試劑盒檢測IL-17、IL-6水平。

1.2.9 腫瘤組織淋巴細(xì)胞獲取 每組選取剩余6只小鼠腫瘤組織，修剪為1 mm×1 mm×1 mm組織塊，以含1 mg/ml膠原酶Ⅳ的RPMI1640培養(yǎng)基消化30 min（37 ℃），消化完成后制備為單個細(xì)胞懸液。離心5 min（1 200 r/min），懸浮細(xì)胞，加入5 ml淋巴細(xì)胞分離液，1 000 r/min 離心20 min 并收集淋巴細(xì)胞層，PBS洗滌2次，保存。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞中Th17 細(xì)胞比例 向淋巴細(xì)胞懸液（100 μl，1×106個/ml）內(nèi)加入PE標(biāo)記的CD4抗體，4 ℃孵育40 min，PBS洗2遍，加入FITC 標(biāo)記的IL-17 抗體至終濃度為1 μg/ml，冰上孵 育20 min，PBS 洗 滌2 次，以 預(yù) 冷 的1 mmol/L EDTA-PBS 溶液懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×107個/ml。采用流式細(xì)胞分選儀分選出CD4+Th17 細(xì)胞，檢測Th17 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的比例。分選得到的Th17 細(xì)胞于含5 ml 預(yù)冷的RPMI 1640 培養(yǎng)基試管中保存，qRT-PCR 法與Western blot 法檢測Th17 細(xì)胞SIRT2、HIF-1α mRNA 與蛋白的表達(dá)，方法分別參照1.2.2、1.2.3。

2 結(jié)果

2.1 CT26/SIRT2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立 倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞呈綠色熒光，熒光表達(dá)率90%以上，與CT26 細(xì) 胞 相 比，CT26/SIRT2 細(xì) 胞SIRT2 mRNA 水平與蛋白水平升高，HIF-1α mRNA 與蛋白水平降低（P＜0.05，圖1、表1）。

表1 CT26、CT26/SIRT2 細(xì) 胞SIRT2、HIF-1α mRNA 與蛋白表達(dá)（±s，n=6）Tab.1 mRNA and protein expressions of SIRT2 and HIF-1α in CT26 and CT26/SIRT2 cells （±s，n=6）

表1 CT26、CT26/SIRT2 細(xì) 胞SIRT2、HIF-1α mRNA 與蛋白表達(dá)（±s，n=6）Tab.1 mRNA and protein expressions of SIRT2 and HIF-1α in CT26 and CT26/SIRT2 cells （±s，n=6）

Groups CT26 CT26/SIRT2 SIRT2 mRNA 1.02±0.12 2.54±0.31 11.201 0.000 tP Protein 0.83±0.10 1.72±0.22 9.021 0.000 HIF-1α mRNA 1.01±0.13 0.26±0.03 13.770 0.000 Protein 0.52±0.06 0.11±0.01 16.510 0.000

圖1 CT26/SIRT2細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況Fig.1 CT26/SIRT2 cells transfection

2.2 CT26、CT26/SIRT2 細(xì)胞增殖抑制率情況CT26、CT26/SIRT2組細(xì)胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 CT26、CT26/SIRT2細(xì)胞增殖抑制率（±s，n=6）Tab.2 Proliferation inhibition rate of CT26 and CT26/SIRT2 cells （±s，n=6）

表2 CT26、CT26/SIRT2細(xì)胞增殖抑制率（±s，n=6）Tab.2 Proliferation inhibition rate of CT26 and CT26/SIRT2 cells （±s，n=6）

Groups CT26 CT26/SIRT2 tP Proliferation inhibition rate/%100.00±0.00 98.75±12.34 0.248 0.809

2.3 小鼠瘤體體積與重量 與CT26 小鼠相比，CT26/SIRT2 小鼠剝離瘤體體積與重量均降低（P＜0.05，圖2、表3）。

表3 CT26、CT26/SIRT2小鼠瘤體體積與重量（±s，n=12）Tab.3 Tumor volume and weight of CT26 and CT26/SIRT2 mice （±s，n=12）

表3 CT26、CT26/SIRT2小鼠瘤體體積與重量（±s，n=12）Tab.3 Tumor volume and weight of CT26 and CT26/SIRT2 mice （±s，n=12）

Groups CT26 CT26/SIRT2 tP Volume/mm3 465.82±58.22 174.67±21.54 16.247 0.000 Weight/g 0.54±0.06 0.21±0.02 18.075 0.000

2.4 小鼠腫瘤組織細(xì)胞增殖、凋亡檢測 與CT26小鼠相比，CT26/SIRT2小鼠腫瘤組織Ki67陽性表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05，圖3、圖4、表4）。

表4 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡率（±s，n=6）Tab.4 Apoptosis rate of tumor tissues in CT26 and CT26/SIRT2 mice （±s，n=6）

表4 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡率（±s，n=6）Tab.4 Apoptosis rate of tumor tissues in CT26 and CT26/SIRT2 mice （±s，n=6）

Groups CT26 CT26/SIRT2 tP Apoptosis rate/%13.24±1.62 25.64±3.17 8.532 0.000

圖4 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況（×400）Fig.4 Apoptosis in tumor tissues of CT26 and CT26/SIRT2 mice （×400）

2.5 小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例 與CT26 小鼠相比，CT26/SIRT2 小鼠淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例降低（P＜0.05，圖5、表5）。

表5 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例（±s，n=6）Tab.5 Proportion of Th17 cells in tumor tissue lymphocytes of CT26 and CT26/SIRT2 mice （±s，n=6）

表5 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例（±s，n=6）Tab.5 Proportion of Th17 cells in tumor tissue lymphocytes of CT26 and CT26/SIRT2 mice （±s，n=6）

Groups CT26 CT26/SIRT2 t P Th17/%19.76±2.48 7.64±0.94 11.194 0.000

圖5 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織浸潤淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例Fig.5 Proportion of Th17 cells in tumor infiltrating lymphocytes of CT26 and CT26/SIRT2 mice

2.6 小鼠腫瘤組織勻漿上清液中IL-17、IL-6 水平 與CT26 小鼠比較，CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織勻漿上清液中IL-17、IL-6 水平均降低（P＜0.05，表6）。2.7 小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞中Th17 細(xì)胞SIRT2、HIF-1α mRNA 與蛋白表達(dá)情況 與CT26 小鼠相比，CT26/SIRT2小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞SIRT2 mRNA 和蛋白水平升高，HIF-1α mRNA 與蛋白水平降低（P＜0.05，圖6、表7）。

表6 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織勻漿上清液中IL-17、IL-6水平（±s，n=6，ng/ml）Tab.6 Levels of IL-17 and IL-6 in tumor tissue homogenate supernatant of CT26 and CT26/SIRT2 mice（±s，n=6，ng/ml）

表6 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織勻漿上清液中IL-17、IL-6水平（±s，n=6，ng/ml）Tab.6 Levels of IL-17 and IL-6 in tumor tissue homogenate supernatant of CT26 and CT26/SIRT2 mice（±s，n=6，ng/ml）

Groups CT26 CT26/SIRT2 t P IL-17 88.62±11.08 35.61±4.45 10.875 0.000 IL-6 137.62±17.21 51.08±6.38 11.549 0.000

表7 小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞中Th17 細(xì)胞SIRT2、HIF-1α mRNA與蛋白表達(dá)情況（±s，n=6）Tab.7 Th17 cells SIRT2 and HIF-1α in lymphocytes of mouse tumor tissue mRNA and protein expressions （±s，n=6）

表7 小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞中Th17 細(xì)胞SIRT2、HIF-1α mRNA與蛋白表達(dá)情況（±s，n=6）Tab.7 Th17 cells SIRT2 and HIF-1α in lymphocytes of mouse tumor tissue mRNA and protein expressions （±s，n=6）

Groups CT26 CT26/SIRT2 SIRT2 mRNA 1.01±0.13 2.54±0.32 10.850 0.000 t P Protein 0.66±0.08 1.59±0.19 11.050 0.000 HIF-1α mRNA 1.02±0.12 0.25±0.03 15.248 0.000 Protein 1.16±0.14 0.32±0.04 14.131 0.000

圖6 Western blot 檢測小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞SIRT2、HIF-1α蛋白Fig.6 SIRT2 and HIF-1α proteins of Th17 cells were detected by Western blot analysis

3 討論

結(jié)腸癌是消化道惡性腫瘤之一，多與飲食習(xí)慣、遺傳因素有關(guān)，前期癥狀不明顯，不易引起重視，晚期擴(kuò)展迅速、預(yù)后差，因此結(jié)腸癌重在防治。機(jī)體免疫系統(tǒng)在識別、殺傷癌細(xì)胞過程中發(fā)揮作用，正常情況下，機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮對異常細(xì)胞清除作用，但當(dāng)癌細(xì)胞數(shù)目過多或免疫能力受損時，癌細(xì)胞無須擴(kuò)張，即可加重疾病進(jìn)展。CD4+T 細(xì)胞是腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，其可分化為Th1、Th2、Th17、Treg 等細(xì)胞，其中Th17 細(xì)胞在維持腸內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)、抵御細(xì)胞外病原體、腫瘤血管生成方面發(fā)揮作用，Th17 細(xì)胞異常分化、分泌IL-17、IL-22 等細(xì)胞因子是結(jié)腸癌發(fā)生的重要因素［6-7］。SPS等［11］研究顯示，Ⅳ期結(jié)腸癌患者Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-23、IL-25水平顯著高于Ⅲ期結(jié)直腸癌患者；SUN 等［12］研究顯示，結(jié)腸癌中腫瘤外泌體通過傳遞LncRNA crnde-h 促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化并加速癌癥進(jìn)程；轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者Th17細(xì)胞積聚，且貝伐單抗耐藥性增強(qiáng)［13］。基于Th17 的過度分化在結(jié)腸癌中發(fā)揮的不良作用，降低Th17細(xì)胞分化是治療結(jié)腸癌的可行方向之一。

SIRT2 是SIRTs 家族成員，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。SIRTs 家族參與多系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展，在腸道疾病中，參與腸道炎癥、屏障修復(fù)等過程。LEE等［14］研究顯示，姜黃素通過共價修飾SIRT1 的半胱氨酸67 殘基抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的致癌性。SIRT2 在結(jié)腸癌中研究較少，其可調(diào)控黏連蛋白SMC1 磷酸化抑制結(jié)腸癌增殖［15］。本研究構(gòu)建穩(wěn)定SIRT2過表達(dá)的結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞株，記為CT26/SIRT2，并經(jīng)倒置顯微鏡、qRT-PCR 與Western blot 驗證轉(zhuǎn)染成功。CT26/SIRT2 細(xì)胞與CT26 細(xì)胞增殖抑制率相比并無顯著性差異，說明慢病毒轉(zhuǎn)染不影響CT26 的增殖能力，將CT26、CT26/SIRT2種植于小鼠皮下成瘤后，CT26/SIRT2 所形成的腫瘤體積及重量小于CT26 細(xì)胞所形成的，提示SIRT2 過表達(dá)可抑制瘤體的生長。CT26/SIRT2 小鼠分離瘤體淋巴細(xì)胞Th17 細(xì)胞比例以及所分泌的細(xì)胞因子水平均低于CT26 小鼠分離瘤體，提示腫瘤細(xì)胞SIRT2 過表達(dá)可能抑制Th17 分化，緩解炎癥損傷，但其調(diào)控Th17 的分化機(jī)理仍需繼續(xù)分析。檢測可知淋巴細(xì)胞Th17 細(xì)胞SIRT2 水平升高，其升高原因可能為腫瘤細(xì)胞內(nèi)SIRT2 激活增加IL-17、IL-6 分泌，進(jìn)一步激活腫瘤微環(huán)境中的SIRT2，進(jìn)而影響免疫，至于影響Th17 細(xì)胞分化的SIRT2 來自腫瘤細(xì)胞還是Th17 本身，尚需進(jìn)一步探討。

HIF-1α 經(jīng)miR-448 過表達(dá)后下調(diào)，伴隨著結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 侵襲、遷移速度減緩［10］；HIF-1α 下調(diào)可減緩結(jié)腸癌細(xì)胞生長代謝速度，降低結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲性［16］。以上研究均顯示HIF-1α 過表達(dá)在結(jié)腸癌中發(fā)揮不良作用。CHOU 等［17］研究顯示HIF-1α經(jīng)腫瘤抑制死亡相關(guān)蛋白激酶抑制后，降低Th17細(xì)胞的分化能力。此外，SIRT2 具有調(diào)控HIF-1α 的能力。HIF-1α 在調(diào)控Th17 分化中發(fā)揮重要作用，HIF-1α 可能被SIRT2調(diào)控參與Th17分化，最終影響結(jié)腸癌的免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)［18］。本研究中，CT26/SIRT2 細(xì)胞的HIF-1α 水平低于CT26 細(xì)胞，即SIRT2過表達(dá)可降低HIF-1α水平，CT26/SIRT2小鼠分離瘤淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞HIF-1α水平也顯著低于CT26小鼠。為此猜測SIRT2過表達(dá)可能通過調(diào)控HIF-1α參與對Th17 的調(diào)控，抑制瘤體增長，但SIRT2 是否通過降低HIF-1α表達(dá)發(fā)揮上述作用，仍需后續(xù)深入研究。

綜上所述，SIRT2 可抑制結(jié)腸癌微環(huán)境CD4+T細(xì)胞向Th17 細(xì)胞分化，并下調(diào)HIF-1α 表達(dá)。但受限于資金、時間等，本研究尚未對SIRT2調(diào)控HIF-1α的作用機(jī)制進(jìn)行深度探索，有待后續(xù)開展。