干雨露，豐 鋒，范紫云，向星星，于奕寧，陳燦強

（廣東海洋大學濱海農業(yè)學院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】迷你椒草（Cryptocoryneparva）屬于天南星科隱棒花屬觀賞水草，因葉片及佛焰苞的形態(tài)和色彩豐富而具有較高的觀賞價值，已被廣泛應用于水族箱造景；同時，其在濕地系統中也發(fā)揮著重要作用，如可降低水中的營養(yǎng)鹽含量、抑制藻類生長［1］，吸收和積累重金屬［2］以促進生態(tài)循環(huán)。目前，椒草種苗主要來源于組培快繁，但品種間差異較大，迷你椒草組培快繁存在增殖系數低、速度慢、易感染病原菌等問題。此外，在實際生產中也發(fā)現，高溫髙濕季節(jié)下試管苗移栽成活率極低，嚴重限制了試管苗在熱帶地區(qū)、高溫季節(jié)的推廣?！厩叭搜芯窟M展】近年來，在植物抗逆性提高的研究中，硅的作用逐漸被重視。硅作為有益植物生長的元素，可通過調節(jié)植物的氣孔來增強光合作用［3］，進而促進葉綠素合成、增強植物細胞壁機械強度、促進植株對有機物的吸收［4］。大量研究表明，硅可提高植物過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等保護酶活性來提高植物抗性［5-7］。王荔軍等［8］認為植物葉片表皮積累的硅具有紅外輻射能力，可以大幅降低葉片表皮溫度，提高植物耐熱能力。其次，施硅后可通過控制高溫下的水分蒸騰、減少水分流失，以緩解高溫環(huán)境給植物帶來的傷害［9］。但在轉錄組分析中發(fā)現，在植物未受到脅迫時，硅的添加對植物基因表達的影響微乎其微［10］，表明硅在植物受到脅迫時發(fā)揮更加重要的作用。此外，在組培過程中添加適當質量濃度的硅可在一定程度上減少試管苗褐化、玻璃化以及葉片畸形等情況的發(fā)生，對提高愈傷組織的誘導、增殖率以及組培苗的增殖和生根也有一定作用［11-12］?！颈狙芯壳腥朦c】目前，硅在作物栽培、組培擴繁及抗逆性等方面的研究持續(xù)升溫，但在組培中添加硅的研究較少，缺乏添加硅后對試管苗生理代謝方面的影響研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究針對試管苗移栽高溫環(huán)境存活率低的問題，通過添加硅酸鉀、硅酸鈉、硅酸鈣、二氧化硅4種不同的硅源，探究硅對椒草試管苗抗逆生理特性的影響，為后續(xù)試管苗移栽高溫環(huán)境提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試迷你椒草試管苗不定芽，來自廣東海洋大學濱海農業(yè)學院植物細胞工程實驗室。硅酸鉀、硅酸鈣、二氧化硅試劑均購于上海麥克林生化科技有限公司，硅酸鈉試劑購于廣東光華科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 硅對迷你椒草不定芽生理代謝的影響 采用單因素試驗方法，在培養(yǎng)基（MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AD 10.0 mg/L）中分別添加硅酸鉀、硅酸鈉、硅酸鈣、二氧化硅4 種硅源，至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L，以不添加硅為對照（CK），每個處理20 瓶，每瓶1 叢，置于25 ℃、光照2 000 Lx（12 h/d）的條件下培養(yǎng)，30 d 后統計增殖率。在不定芽接入培養(yǎng)基后的5、15、25 d 時，每個處理分別取樣（整株不定芽）5 g，存放于-40 ℃的冰箱待后續(xù)指標測定。

1.2.2 硅對高溫高濕脅迫下迷你椒草生理代謝的影響 篩選出最佳硅源及濃度后，將不定芽進行生根培養(yǎng)（1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L），以不添加硅處理為對照（CK）。25 d 后在自然環(huán)境中煉苗7 d 再移栽，每個處理10 株，重復3 次，隨后放入人工氣候箱（設置42 ℃、濕度95%、光照6 000 Lx），5 d 后取樣進行指標測定。

1.2.3 指標的測定 參照李合生［13］指標測定方法，采用蒽酮法測定可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍G-250 染色法測定可溶性蛋白含量，采用氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定過氧化物酶（POD）活性，采用電導率儀測定電導率，采用95%乙醇提取法測定葉綠素含量。

以稱重法計算增殖系數，公式如下：

增殖系數=增殖芽重-接種芽重

1.3 數據處理與分析

采用DPS 軟件和Duncans分析法對不同指標進行差異顯著性分析。使用SPSS 27.0 利用隸屬函數值和主成分分析賦予權重，得出不同硅處理綜合評價D值進行排序。隸屬函數值、各綜合指標權重和綜合評價D值的計算公式參考文獻［14］。

2 結果與分析

2.1 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽增殖的影響

由圖1 可知，添加硅酸鉀后，迷你椒草不定芽增殖率隨硅酸鉀濃度升高呈先上升后下降趨勢，0.6 g/L 硅酸鉀處理不定芽的增殖系數顯著高于其他處理，但與CK 相比差異不顯著，其他處理均低于CK。隨各硅源濃度增加，硅酸鈉處理中，不定芽增殖系數峰值出現在0.8 g/L（2.19）；硅酸鈣處理不定芽增殖系數呈現先升后降趨勢；二氧化硅處理中，迷你椒草不定芽增殖率呈現逐漸降低趨勢。

圖1 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽增殖的影響Fig.1 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on adventitious bud proliferation of Cryptocoryne parva

2.2 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽可溶性糖含量的影響

由圖2 可知，0.2、0.4、0.6 g/L 硅酸鉀處理后，迷你椒草不定芽可溶性糖含量隨處理時間延長呈先降后升趨勢，25 d 時各處理不定芽可溶性糖含量 較CK 分別增長53.84%、51.53%、95.39%、25.62%。硅酸鈉處理后，不定芽可溶性糖含量隨處理時間增加呈現先下降后上升趨勢，并在0.4 g/L硅酸鈉處理15 d、25 d 后達到最高，與CK 相比分別增加26.72%、97.92%。硅酸鈣條件下，在5 d 時除0.4 g/L 處理不定芽的可溶性糖含量高于CK，其他處理均低于CK。25 d 時0.4 g/L 處理達到最大值（12.87 mg/g）。二氧化硅條件下第25 d，所有處理不定芽的可溶性糖含量均隨二氧化硅濃度升高呈現先上升后下降趨勢，0.4 g/L 處理顯著高于其他處理，較CK 增長50.86%。

圖2 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽可溶性糖含量的影響Fig.2 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on soluble sugars content in adventitious buds of Cryptocoryne parva

2.3 不同硅源及硅濃度對迷你草不定芽可溶性蛋白含量的影響

由圖3 可知，添加不同硅源25 d 后，不定芽可溶性蛋白含量較CK 均有不同程度地增加。硅酸鉀處理后，不定芽可溶性蛋白含量隨培養(yǎng)時間延長呈緩慢上升趨勢，在0.8 g/L 處理15 d、25 d時顯著高于其他處理，此時硅酸鉀各處理較CK增長14.7%～27.67%。添加0.2 g/L 硅酸鈉5 d 后不定芽可溶性蛋白含量達到最大值（18.99 mg/g），較CK 增長42.46%，1.0 g/L 處理下隨培養(yǎng)時間增加可溶性蛋白含量減少，表明高濃度硅酸鈉不利于蛋白積累。硅酸鈣處理25 d 后，各處理不定芽可溶性蛋白含量與CK 相比培養(yǎng)差異不明顯，僅增長2.56%～7.88%。二氧化硅處理后，隨培養(yǎng)時間增加，不定芽可溶性蛋白含量先上升后下降，25 d 時各處理較CK 增長13.49%～26.68%。

圖3 不同硅源及硅濃度處理對迷你椒草不定芽可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on soluble proteins content in adventitious buds of Cryptocoryne parva

2.4 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽SOD活性的影響

從圖4 可以看出，不同濃度硅酸鉀處理下，迷你椒草不定芽的SOD 活性隨培養(yǎng)時間增加先上升后下降，0.4、0.6 g/L 硅酸鉀處理在15 d、25 d 時不定芽SOD 活性均顯著高于其他處理，25 d 時加硅處理不定芽的SOD 活性較CK 增加40.71%～137.67%。0.8、1.0 g/L 硅酸鈉處理下，迷你椒草試管苗不定芽的SOD 活性趨勢相同，即先上升后下降，并在15 d 時達到峰值；0.2、0.6 g/L硅酸鈉處理25 d 后其不定芽SOD 活性與CK 相比差異顯著，較CK 分別增長45.53%、41.99%。硅酸鈣處理下，迷你椒草試管苗的SOD 活性隨硅酸鈣濃度增加呈遞減趨勢，但隨培養(yǎng)時間增加其SOD 活性逐漸上升，25 d 時較CK 分別增長62.87%、58.1%、16.09%、31.68%。1.0 g/L 二 氧化硅處理15 d 后，不定芽SOD 活性下降、與CK無顯著差異，0.2 g/L 處理在15 d 時達到峰值、較CK 增長46.77%。

圖4 不同硅源及硅濃度處理對迷你椒草不定芽SOD 活性的影響Fig.4 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on SOD activities in adventitious buds of Cryptocoryne parva

2.5 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽POD活性的影響

由圖5 可知，施硅處理增加迷你椒草不定芽的POD 活性，且4 種硅處理下均隨硅濃度增加呈先上升后下降趨勢。0.6 g/L 硅酸鉀處理不定芽在整個階段表現均較好，其POD 活性分別比CK 增加62.82%、19.97%、39.01%。硅酸鈉處理15 d、25 d 時各處理間POD 活性差異較小，較CK 分別增加4.15%～35.71%、19.49%～38.36%，0.4 g/L處理在第5 d 顯著高于其他處理。硅酸鈣處理下，隨培養(yǎng)時間增加其不定芽POD 活性呈先下降后緩慢上升趨勢，在25 d 時除0.2 g/L 處理外，其他濃度處理均高于CK，分別增長63.52%、98.11%、85.85%、44.65%。二氧化硅條件下，所有處理不定芽的POD 活性在5 d 時大幅增長，15 d 時急聚下降，25 d 時隨二氧化硅濃度增加POD 活性逐漸下降，僅0.2、0.4、0.6 g/L 處理顯著高于CK。

圖5 不同硅源及硅濃度處理對迷你椒草不定芽POD 活性影響Fig.5 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on POD activities in adventitious buds of Cryptocoryne parva

2.6 不同硅源及硅濃度對迷你椒草不定芽MDA含量影響

由圖6 可知，在處理25 d 后，所有加硅處理的不定芽MDA 含量均顯著低于CK，硅酸鉀0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 處理分別較CK 降低9.67%、50.05%、56.20%、39.52%、46.43%。硅酸鈉處理后，隨培養(yǎng)時間增加不定芽MDA 含量均呈現先增后降趨勢，25 d 時較CK 降低31.72%～58.56%。硅酸鈣處理25 d 后，不定芽MDA 含量較CK 降低22.57%～49.12%。二氧化硅處理25 d 時，不定芽MDA 含量隨二氧化硅濃度增加呈先降后升，較CK 降低5.98%～48.73%。

圖6 不同硅源及硅濃度處理對迷你椒草不定芽MDA 含量的影響Fig.6 Effects of different silicon sources and silicon concentrations on MDA content in adventitious buds of Cryptocoryne parva

2.7 不同硅源及硅濃度下迷你椒草不定芽生理代謝綜合性評價分析

通過計算綜合指標的隸屬函數值，根據主成分因子的貢獻值大小，計算4 個綜合指標的權重，權重值分別為0.413、0.259、0.168、0.160（表1）。再根據隸屬函數值和權重大小，計算得到加硅各處理的綜合評價值（D值），并對其進行排序，經綜合評價排序得出硅酸鉀0.6 g/L處理是較好的，其次是硅酸鉀0.8 g/L、二氧化硅0.2 g/L。

表1 綜合指標值、隸屬函數值、生理指標評價D 值及排序Table 1 Comprehensive index values,membership function values,and D values and ranking of physiological index evaluation

2.8 硅對高溫高濕脅迫下迷你椒草生理代謝的影響

由表2 可知，加硅處理（硅酸鉀0.6 g/L）的迷你椒草移栽高溫高濕環(huán)境第5 d 時，各指標均顯著高于CK。加硅處理的可溶性蛋白和可溶性糖含量較CK 分別提高51.91%、98.77%，葉綠素含量較CK 提高91.67%。脅迫處理中，加硅處理抑制了迷你椒草電導率上升，顯著提高了SOD、POD 活性。

表2 硅對高溫高濕脅迫下迷你椒草生理代謝影響Table 2 Effects of silicon on physiological metabolism of Cryptocoryne parva under high temperature and humidity stress

3 討論

本試驗以迷你椒草不定芽為研究對象，通過在培養(yǎng)基中添加不同硅源，探究硅對試管苗生理代謝的影響。結果表明，添加0.6 g/L硅酸鉀25 d后，迷你椒草不定芽的增殖系數與CK 相比無顯著差異，但其他加硅處理的增殖率均低于CK，表明加硅處理對迷你椒草不定芽增殖無明顯作用，甚至低于對照。有研究指出添加硅后，植物體內硅、磷兩種元素的吸收會形成競爭關系，抑制植物對磷的吸收，導致增殖系數下降［15］。

硅酸鉀、硅酸鈉處理25 d 時，迷你椒草不定芽的可溶性糖含量均顯著高于CK；硅酸鉀0.6 g/L 處理不定芽可溶性糖含量顯著高于其他處理，較CK 增長95.39%；硅酸鈉0.4 g/L 處理不定芽可溶性糖含量較CK 增長97.92%；二氧化硅處理在25 d 時，隨處理濃度增加，不定芽可溶性糖含量先增后降；而硅酸鈣隨處理濃度增加，不定芽可溶性糖含量則呈下降趨勢，且在濃度0.6 g/L 時其含量顯著低于CK。季明德等［16］通過研究硅在蔗糖合成與分解反應中的作用，證明硅能促進植物對可溶性糖的積累，可溶性糖作為有機滲透調節(jié)物質不僅能為植物生長提供足夠能量，還具有一定信號功能，能提高植物的抗逆性［17-18］，但高濃度的硅對植物可溶性糖積累有抑制作用。可溶性蛋白可降低細胞冰點，緩解植物在逆境中的傷害［19］，添加硅處理不定芽的可溶性蛋白含量較CK 都有不同程度增長，且處理多呈先下降后上升趨勢，有研究發(fā)現前期硅能增加植物細胞壁的強度和韌性，保持內外滲透壓平衡，減弱可溶性蛋白的信號強度，導致可溶性蛋白累積量減少［20］，硅酸鉀0.6、0.8 g/L 在培養(yǎng)25 d 可溶性蛋白含量最高，兩個處理間無顯著差異，但分別較CK 增長27.34%、27.76%，差異極顯著。硅酸鈉處理不定芽的可溶性蛋白含量在培養(yǎng)25 d 較CK 增長5.75%～24.73%，硅酸鈣0.8 g/L 處理顯著高于其他處理,二氧化硅所有處理可溶性蛋白含量均顯著高于CK、增幅13.49%～26.63%，表明硅可促進迷你椒草可溶性蛋白積累。

SOD、POD 作為植株體內活性氧清潔劑，有利于提高植物在逆境中的耐受性［21-22］。POD 能催化過氧化氫氧化酚類的反應，對植物呼吸代謝起重要作用［21］，SOD 可將植物細胞中的O2轉化為H2O2，防止脅迫環(huán)境下對細胞損傷［23-24］。本研究結果表明，4 種硅的添加均可不同程度提高迷你椒草不定芽的POD、SOD 活性。硅酸鉀添加0.6 g/L 時，不定芽SOD 活性最高。硅酸鈉添加0.2 g/L 時，SOD 活性較CK 提高45.43%；0.8 g/L 時，POD 活性顯著高于其他濃度處理。硅酸鈣和二氧化硅處理不定芽的SOD 活性較CK 分別增長13.49%～62.87%、0.86%～75.85%；硅酸鈣0.6 g/L 處理不定芽的POD 活性為1 253.73 μg/g，二氧化硅0.2 g/L 處理不定芽的POD 活性顯著高于其他處理。MDA 是膜脂過氧化物產物，可作為判斷植物受傷害程度的依據［25］，本研究中所有施硅處理不定芽的MDA 含量均顯著低于CK，表明硅可以在一定程度上減輕活性氧自由基對植物的傷害。

將試管苗生根移栽后進行高溫高濕脅迫，結果表明加硅處理迷你椒草試管苗的葉綠素含量較CK 增長91.67%，加硅處理能保持膜系統的活力，維持柵欄組織中葉綠素體形態(tài)，促進光合速率提高［3］。加硅處理迷你椒草不定芽的可溶性糖、可溶性蛋白含量均顯著高于CK，SOD、POD 活性均高于CK，表明加硅處理能提高迷你椒草試管苗的抗逆性，但也有待后續(xù)更深入的研究。

4 結論

4 種硅源處理后，迷你椒草試管苗的可溶性糖、可溶性蛋白含量較CK 均有不同程度的增加，表明添加適宜濃度的硅可以提高植物碳水化合物代謝能力和體內SOD、POD 的活性。主成分分析及隸屬函數分析得出，在添加硅酸鉀0.6 g/L時各指標表現最好。加硅處理通過提高迷你椒草葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖含量，以及調節(jié)SOD、POD 活性，緩解高溫高濕脅迫帶來的傷害，增強試管苗抗逆境脅迫能力。