羅幸凱，黃麗麗

南柴胡多糖理化性質(zhì)及拮抗白細(xì)胞黏附研究

羅幸凱，黃麗麗

寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院藥學(xué)部，浙江寧波 315000

探究南柴胡多糖（polysaccharide，BP）的理化性質(zhì)、溶液高級(jí)構(gòu)象及拮抗P-選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附能力。采用水提醇沉法制備BP，利用化學(xué)法（苯酚硫酸法、間羥基聯(lián)苯法、Bradford法）、高效液相色譜、傅里葉紅外光譜、剛果紅染色和圓二色譜分析BP的理化性質(zhì)及溶液高級(jí)構(gòu)象，利用細(xì)胞黏附和蛋白互作實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)BP拮抗P-選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附活性。BP是相對(duì)分子質(zhì)量為36.44kDa的酸性雜多糖，糖醛酸含量為19.33%，由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖5種單糖組成；BP在溶液狀態(tài)下，不存在三股螺旋結(jié)構(gòu)，分子具有明顯的不對(duì)稱性，但不對(duì)稱性受濃度和溫度影響；BP顯著抑制P-選擇素介導(dǎo)的HL-60與CHO-P細(xì)胞的黏附，并阻斷P-選擇素與P-選擇素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）的相互作用。BP是由5種單糖組成的酸性多糖，能阻斷P-選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞黏附作用，具有開發(fā)成為新型抗炎藥物的潛力。

南柴胡；多糖；理化性質(zhì)；溶液構(gòu)象；P-選擇素；抗炎

柴胡是一味傳統(tǒng)中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，至今已有上千年歷史?！吨袊?guó)藥典》2020年版規(guī)定本品為傘形科（北）柴胡（DC.）或狹葉（南）柴胡（Willd.）的干燥根，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣等功效[1]。南柴胡廣泛分布于內(nèi)蒙古、江蘇、安徽等地區(qū)，主要含有黃酮類、皂苷類、多糖類等活性化合物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、保肝等藥理活性[2-3]。但關(guān)于南柴胡多糖（polysscharide，BP）的高級(jí)構(gòu)象及其抗炎活性的研究報(bào)道較少，為豐富BP的結(jié)構(gòu)信息、發(fā)掘其生物活性，本研究運(yùn)用多種化學(xué)和光譜分析方法揭示BP的理化性質(zhì)及溶液高級(jí)構(gòu)象，并利用靜止黏附、平行板流動(dòng)小室和體外蛋白互作實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其拮抗P-選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞黏附能力，為促進(jìn)南柴胡資源的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 BP的制備

采用水提醇沉法制備BP。取適量脫脂南柴胡粉末，沸水浸提3次（:=1 : 20），每次3h。合并提取液，過濾，減壓濃縮。濃縮液中緩慢滴加95%乙醇至終濃度為80%，4℃靜置過夜，經(jīng)離心處理后收集沉淀，真空冷凍干燥。采用反復(fù)凍融法和Sevag法除去蛋白質(zhì)，得BP。

1.2 理化性質(zhì)分析

采用苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量；采用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸含量；蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法；采用TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜儀（德國(guó)Bruker公司），在4000～400cm–1波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描；利用Lambda 750紫外全波長(zhǎng)掃描儀（美國(guó)PerkinElmer公司）在190～900nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描多糖樣品；采用高效液相色譜法測(cè)定BP的相對(duì)分子量。以不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將多糖樣品的保留時(shí)間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得重均分子量；采用柱前衍生化及反相高效液相色譜法對(duì)單糖組成進(jìn)行分析。首先將多糖樣品進(jìn)行酸水解，產(chǎn)物經(jīng)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl- 5-pyrazolone，PMP）衍生化后進(jìn)樣，對(duì)比各單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的保留時(shí)間及峰面積，確定BP的單糖組成及摩爾比。

1.3 溶液高級(jí)構(gòu)象分析

將剛果紅試劑和BP配制成不同濃度（0～0.5mol/L）的NaOH溶液，在200～600nm范圍內(nèi)，進(jìn)行紫外-可見全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定溶液的最大吸收波長(zhǎng)λmax，以去離子水代替BP溶液作為對(duì)照。

采用Chirascan圓二色譜儀（英國(guó)Applied Photophysics公司）測(cè)定不同濃度和溫度下BP溶液構(gòu)象。檢測(cè)條件為掃描波長(zhǎng)范圍190～400nm，帶寬1.0nm，步進(jìn)值1.0nm。

1.4 拮抗P-選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附能力分析

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 中華倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞和人早幼粒白血病細(xì)胞（human myelocytic leukemia，HL-60）細(xì)胞購置于中科院上海細(xì)胞庫。通過將全長(zhǎng)人P-選擇素載體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，獲得穩(wěn)定表達(dá)P-選擇素的CHO-P細(xì)胞。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于Iscove Modified Dulbecco Media培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中補(bǔ)充10%熱滅活的胎牛血清，100units/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為37℃和5%CO2濃度。

1.4.2 靜止黏附實(shí)驗(yàn) 將CHO-P或CHO細(xì)胞接種到24孔板中過夜形成單層，分別與P-選擇素阻斷型抗體9E1、非阻斷型抗體AC1.2及BP（100μg/ml和200μg/ml）于37℃孵育30min。將HL-60細(xì)胞用鈣調(diào)蛋白-AM（5μm）進(jìn)行熒光標(biāo)記，并加入到CHO-P或CHO單層細(xì)胞中孵育1h。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌4次后，使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量各孔熒光強(qiáng)度。

1.4.3 平行板流動(dòng)小室實(shí)驗(yàn) 平行板流室分析BP阻斷HL-60細(xì)胞和CHO-P單層細(xì)胞動(dòng)態(tài)相互作用的能力。將CHO和CHO-P細(xì)胞分別接種在35mm培養(yǎng)皿中過夜形成細(xì)胞單層，分別加入9E1、AC1.2和BP（100μg/ml和200μg/ml），37℃孵育30min。將培養(yǎng)皿組裝在平行板流動(dòng)室（Glycotech公司，美國(guó)），并安裝在倒置顯微鏡上進(jìn)行觀測(cè)。用PBS洗滌后，將HL-60細(xì)胞注入流動(dòng)小室，并通過CCD隨機(jī)選擇視野記錄3min。利用NIH ImageJ軟件計(jì)算在CHO或CHO-P細(xì)胞上滾動(dòng)的HL-60細(xì)胞數(shù)量和相對(duì)滾動(dòng)速度。

1.4.4 體外蛋白結(jié)合測(cè)定 重組人P-選擇素/Fc嵌合蛋白（P-Fc，2μg）與20μl Protein G瓊脂糖凝膠在4°C下孵育1h后，加入BP（100μg/ml和200μg/ml）繼續(xù)孵育1h。HL-60細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞裂解液冰上裂解30min，于4°C環(huán)境中以8000轉(zhuǎn)/min的速度離心15min，將裂解液上清與包被P-Fc的Protein G凝膠孵育2h，經(jīng)離心反復(fù)洗滌后，加入上樣緩沖液并沸騰，免疫印跡法檢測(cè)P-選擇素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）及P-選擇素含量，使用ImageJ軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行量化分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BP的理化性質(zhì)分析

采用水提醇沉法獲得BP，收率為12.8%，BP的總糖含量為96.43%，其中糖醛酸含量為19.33%，而蛋白含量?jī)H占0.33%，同時(shí)260nm和280nm處無吸收峰（圖1A），表明BP中蛋白被有效除去。BP的相對(duì)分子質(zhì)量為36.44 kDa，是由5種單糖組成的酸性雜多糖：鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，摩爾比為0.23∶0.40∶1.00∶0.22∶0.32（圖1B）。

BP的紅外光譜結(jié)果如圖1C所示。3384cm–1處為分子內(nèi)羥基伸縮振動(dòng)，為多糖的特征吸收峰；2931cm–1處的較弱吸收峰為C-H的伸縮振動(dòng)；1746cm–1和1612cm–1吸收峰是由C=O和COO-的伸縮振動(dòng)引起；1412cm–1處有吸收峰，表明存在糖醛酸；1100～1020cm–1區(qū)間及765cm–1的吸收峰表明單糖殘基以吡喃環(huán)形式存在；831cm–1處的吸收峰，表明存在α-糖苷鍵。

2.2 BP的溶液高級(jí)構(gòu)象分析

剛果紅能夠與具有三股螺旋構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物。在一定NaOH濃度范圍，三股螺旋構(gòu)象可通過可見光譜中最大吸收波長(zhǎng)的紅移來確定。與剛果紅對(duì)照組相比，隨著NaOH濃度的增加，剛果紅-BP配合物的最大吸收波長(zhǎng)均未發(fā)生紅移（圖1D），說明BP中不存在三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圓二色譜（circular dichroism，CD）可靈敏地反映生物分子的空間結(jié)構(gòu)。在水溶液中，由于多糖分子之間存在相互作用，導(dǎo)致分子發(fā)生纏繞、折疊等無規(guī)則卷曲，使其產(chǎn)生不對(duì)稱性，從而在CD譜上呈現(xiàn)明顯Cotton效應(yīng)[4]。不同濃度BP的溶液構(gòu)象如圖1E所示，改變濃度并未影響B(tài)P的峰形，但振幅強(qiáng)度發(fā)生了顯著的變化，隨著BP濃度的增加，200nm附近的吸收峰及負(fù)Cotton效應(yīng)均大幅度增強(qiáng)，說明濃度升高會(huì)增加BP分子的不對(duì)稱性。這可能是由于隨著BP濃度的增加，多糖分子鏈間的作用力增強(qiáng)，從而使多糖分子鏈之間發(fā)生聚集和纏繞。溫度對(duì)BP溶液構(gòu)象有一定影響（圖1F），當(dāng)測(cè)定溫度達(dá)到55℃時(shí)，BP的CD譜峰型發(fā)生偏移，并且Cotton效應(yīng)增強(qiáng)、負(fù)Cotton效應(yīng)減弱。多糖溶液構(gòu)象受多糖分子間和分子內(nèi)的氫鍵鍵合這種典型的熱力學(xué)行為影響[5]。因此，BP溶液構(gòu)象的改變極有可能是由于維系分子構(gòu)象行為的氫鍵發(fā)生斷裂所致。

圖1 BP的理化性質(zhì)及溶液構(gòu)型分析

A.紫外可見光掃描圖譜；B.單糖組成分析；C.紅外光譜圖；D.剛果紅實(shí)驗(yàn)；E.圓二色譜（不同濃度）；E.圓二色譜（不同溫度）

2.3 拮抗P-選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞黏附能力

BP在100μg/ml和200μg/ml的濃度下，均可顯著抑制HL-60和CHO-P細(xì)胞之間的靜態(tài)黏附作用，黏附細(xì)胞比例分別下降到34.7%和11.3%，200μg/ml BP組的抑制作用接近P-選擇素阻斷型抗體9E1，見圖2A。利用平行板流小室評(píng)價(jià)BP在動(dòng)態(tài)條件下抑制細(xì)胞滾動(dòng)黏附的作用效果。BP處理顯著減少CHO-P細(xì)胞單層上滾動(dòng)黏附的HL-60細(xì)胞比例，在100μg/ml和200μg/ml濃度作用下分別減少到40.2%和6.2%，200μg/ml BP組與阻斷型單抗9E1的抑制效果接近（>0.05），圖2B。另外，使用NIH ImageJ軟件計(jì)算HL-60細(xì)胞的相對(duì)滾動(dòng)速度（圖2C），由于BP處理可抑制細(xì)胞間的黏附作用，與對(duì)照組相比，BP處理后HL-60細(xì)胞的相對(duì)滾動(dòng)速度顯著增加。

圖2 BP拮抗P-選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞黏附能力

A.靜止黏附細(xì)胞比例；B.滾動(dòng)黏附細(xì)胞比例；C.相對(duì)滾動(dòng)速度

注：CHO-P：穩(wěn)定表達(dá)P-選擇素的CHO細(xì)胞；與對(duì)照組比較，*<0.001

PSGL-1是白細(xì)胞特異性表達(dá)的糖基化蛋白，是P-選擇素介導(dǎo)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮起始招募和滾動(dòng)黏附的重要生理配體。P-選擇素與PSGL-1展現(xiàn)出較高的親和力，而經(jīng)過BP處理后，P-選擇素與PSGL-1之間的相互作用明顯減弱，100μg/ml和200μg/ml BP組分別降低55.3%和90.3%，見圖3。上述結(jié)果表明，BP通過直接阻斷P-選擇素與PSGL-1之間的相互作用來抑制P-選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞黏附作用。

圖3 BP阻斷P-選擇素與PSGL-1的相互作用

注：與對(duì)照組比較，*<0.001

3 討論

中藥南柴胡為傘形科狹葉柴胡的干燥根，味苦，性寒，歸肝、膽經(jīng)，在臨床上廣泛應(yīng)用于抗炎治療。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其主要活性成分為柴胡皂苷、黃酮類、柴胡多糖等。本研究采用水提醇沉法制備的BP是由鼠李糖、半乳糖糖醛酸、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖等組成的酸性雜多糖，摩爾比為0.23 : 0.40 : 1.00: 0.22 : 0.32。肖炳坤等[6]發(fā)現(xiàn)北柴胡多糖中單糖組分主要是阿拉伯糖和半乳糖，分別占比46.0%和34.5%，還含有少量的鼠李糖、半乳糖醛酸和木糖等單糖成分。顏軍等[7]從產(chǎn)自于四川省的柴胡中提取分離柴胡多糖，由木糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖5種單糖組成，其摩爾比為1.00 : 2.19 : 2.27 : 2.44 : 3.21。由此得出，不同產(chǎn)地和不同屬的柴胡在單糖組成上存在一定的差異。

多糖的生物活性與其溶液高級(jí)空間構(gòu)象密切相關(guān)[8]。β-（1-3）-D-葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)活性被認(rèn)為與其三股螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)，當(dāng)其變性后，免疫調(diào)節(jié)功能也隨之消失[9]。因此，對(duì)多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究將有助于闡釋其構(gòu)效關(guān)系。多糖在溶液中的構(gòu)象特征包括多糖分子的尺寸、形態(tài)、剛性/柔順性、無規(guī)線團(tuán)、單股螺旋、雙股螺旋和三股螺旋等[8]。盡管目前對(duì)柴胡多糖分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)已有一定了解，但空間構(gòu)象、溶液行為及聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的研究在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究通過剛果紅實(shí)驗(yàn)和CD技術(shù)，探究BP的溶液行為，豐富BP的溶液高級(jí)構(gòu)象信息。

中藥多糖在炎癥發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)階段均可展現(xiàn)抗炎能力，如抑制炎癥信號(hào)傳導(dǎo)，減少促炎細(xì)胞因子釋放，阻止白細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)[10]。作為重要的細(xì)胞黏附分子，P-選擇素參與活化的血管內(nèi)皮對(duì)中性粒細(xì)胞的招募及黏附作用，在炎癥發(fā)生、發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[11]。因此，干預(yù)P-選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附成為治療炎癥相關(guān)疾病的潛在策略。P-選擇素與其生理配體的結(jié)合可被多種天然多糖拮抗[12-13]。在本研究中BP作為P-選擇素高親和力配體以拮抗其與PSGL-1的結(jié)合，阻斷白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的識(shí)別與黏附，表明其具有開發(fā)成為抗炎功效的新型醫(yī)藥產(chǎn)品的潛質(zhì)。然而，由于BP的復(fù)雜化學(xué)組成與高級(jí)構(gòu)象，其構(gòu)效關(guān)系仍不清楚。后續(xù)研究中有必要表征BP的精細(xì)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾，以揭示BP與P-選擇素的分子識(shí)別和相互作用模式。

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Physicochemical properties and antagonistic capacity against cell adhesion of polysaccharide isolated from

Department of Pharmacy, Ningbo Medical Center Lihuili Hospital, Ningbo 315000, Zhejiang, China

To preparepolysaccharide (BP) to characterize its physical and chemical properties, advanced structure in solution, as well as antagonistic capacity against P-selectin-mediated cell adhesion.BP was prepared by hot water extraction method, chemical methods (phenol sulfuric acid method, meta-hydroxybiphenyl method, Bradford method), high performance liquid chromatography, Fourier infrared transform spectroscopy, Congo red staining and circular dichroism were used to analyze the physical and chemical properties of BP and the advanced structure in the solution, we also evaluated its antagonistic function against P-selectin-mediated neutrophil adhesion.BP is an acidic heteropolysaccharide with a molecular weight of 36.44kDa. It contains 19.33% uronic acid content and is composed of five monosaccharides: Xylose, rhamnose, glucose, galactose, and arabinose. In its aqueous state, BP lacks a triple-helix structure, exhibiting pronounced asymmetry at the molecular level. However, this asymmetry is influenced by both concentration and temperature; BP significantly inhibited the P-selectin-mediated adhesion of HL-60 and Cho-P cells, and blocked the interaction between P-selectin and its physiological ligand P-selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1).polysaccharide BP is an acidic polysaccharide composed of 5 kinds of monosaccharides, and BP can block P-selectin dependent cell adhesion, these results provide a novel therapeutical strategy for amelioration of inflammation-related disease.

; Polysaccharide; Physical and chemical properties; Solution conformation; P-selectin; Anti-inflammation

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.30.011

浙江省寧波市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（2022-F06）

黃麗麗，電子信箱：727751578@qq.com

（2022–10–28）

（2023–10–10）