余凌竹 ，魯 建 ，譚言飛

（1.四川大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，成都 610064；2.四川大學(xué) 國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心，成都 610064）

目前，我國(guó)正處于建設(shè)創(chuàng)新型國(guó)家的關(guān)鍵歷史時(shí)期[1]。研究生是科技創(chuàng)新的重要后備力量和生力軍，研究生科研能力的訓(xùn)練是國(guó)家培養(yǎng)具有創(chuàng)新思維和創(chuàng)新能力的科研創(chuàng)新人才的重要途徑，提高研究生教學(xué)質(zhì)量已成為高校深化教育教學(xué)改革的核心目標(biāo)[2]。綜合型實(shí)驗(yàn)教學(xué)作為學(xué)生實(shí)踐能力和科研能力培養(yǎng)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，在考查學(xué)生綜合運(yùn)用知識(shí)的能力以及訓(xùn)練學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作技能等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)以按部就班的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和教師講解為主，實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系僵化，內(nèi)容單一，缺乏對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的探索性、趣味性和實(shí)用性，不能充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性，實(shí)驗(yàn)教學(xué)淪為“依葫蘆畫瓢”的機(jī)械學(xué)習(xí)，并不能培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考、探索以及解決實(shí)際問(wèn)題的能力[3]。近年，四川大學(xué)以國(guó)家“雙創(chuàng)”示范基地建設(shè)為契機(jī)，啟動(dòng)了創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育改革行動(dòng)計(jì)劃，通過(guò)大學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)改革項(xiàng)目的實(shí)施，擬建設(shè)一批創(chuàng)新性、研究型綜合實(shí)驗(yàn)，旨在縮短學(xué)生在所學(xué)的專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)同科研、生產(chǎn)實(shí)踐中解決實(shí)際問(wèn)題能力之間的差距，提高學(xué)生科研、實(shí)踐和創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力，為從事國(guó)家需求為導(dǎo)向的科學(xué)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[4-6]。

研究型綜合實(shí)驗(yàn)是一種以理論講解、實(shí)踐指導(dǎo)、實(shí)驗(yàn)探索和綜合能力提升相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法，以教師為主導(dǎo)，學(xué)生為主體，以培養(yǎng)研究型創(chuàng)新人才為目的的新型的實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式[7-8]。研究型實(shí)驗(yàn)教學(xué)將科研需求導(dǎo)向，科研的思維方法和技能融入實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，增加實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的探索性和研究性，增加實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)施的意義，激發(fā)學(xué)生的科研熱情和創(chuàng)新意識(shí)，培養(yǎng)學(xué)生自行解決問(wèn)題的能力，滿足學(xué)生個(gè)性化發(fā)展的需求。本學(xué)院的生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)作為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)學(xué)科，是一門由化學(xué)、材料、高分子、生物醫(yī)學(xué)和電子傳感技術(shù)等學(xué)科高度交叉的新工科，具有很強(qiáng)的特殊的專業(yè)性要求，而學(xué)生通常具有不同的學(xué)科背景，在進(jìn)入研究生階段從事科學(xué)研究之前，尚缺乏針對(duì)性的研究型綜合實(shí)驗(yàn)，突破學(xué)生專業(yè)限制，實(shí)現(xiàn)多學(xué)科知識(shí)、實(shí)驗(yàn)技能和科技創(chuàng)新的融合。為此，本文科學(xué)設(shè)計(jì)“功能化磁性復(fù)合納米材料富集磷酸化肽”的研究型綜合實(shí)驗(yàn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科學(xué)研究探索相結(jié)合，提高了學(xué)生主動(dòng)探索的積極性，滿足學(xué)生科研自主化，開拓性和創(chuàng)新性的發(fā)展要求。

1 功能化磁性復(fù)合納米材料富集磷酸化肽綜合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)依據(jù)

蛋白質(zhì)是組成生命體細(xì)胞、組織的重要成分，人體的很多具體功能是通過(guò)蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。大多數(shù)的蛋白質(zhì)在翻譯合成過(guò)程中通過(guò)各種官能團(tuán)（如甲基、乙?；?、糖基以及磷酸基等）的共價(jià)結(jié)合來(lái)添加修飾，形成超過(guò)300 種的蛋白翻譯后修飾（post-translational modification,PTMs）形式[9]。其中，蛋白磷酸化是一種最常見的蛋白翻譯后修飾的方式，指在蛋白激酶的催化作用下，特定的氨基酸（主要是絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸）上修飾磷酸基團(tuán)的過(guò)程[10]。據(jù)估計(jì)，在真核細(xì)胞中近30%的蛋白質(zhì)存在磷酸化。可逆的蛋白磷酸化作為調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程的信號(hào)開關(guān)，調(diào)控著諸如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝，細(xì)胞增長(zhǎng)、黏附和遷移等多種生物學(xué)行為[11-12]。此外，蛋白磷酸化也是生命系統(tǒng)內(nèi)功能障礙的指示劑。異常的蛋白磷酸化與心腦血管疾病、帕金森癥、阿茲海默癥、糖尿病以及癌癥等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。因此，對(duì)磷酸化蛋白的鑒定和分析在揭示磷酸化蛋白組學(xué)相關(guān)的生物學(xué)和病理學(xué)過(guò)程，以及相關(guān)疾病的預(yù)防和早期診斷等方面具有重要的研究意義，成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的前沿。質(zhì)譜法由于具有高靈敏度、高檢測(cè)通量以及快速的數(shù)據(jù)處理能力，已成為磷酸化蛋白研究中最常用的檢測(cè)方式。利用質(zhì)譜檢測(cè)磷酸化蛋白主要是基于自下而上（bottom-up）的生物質(zhì)譜分析策略，即對(duì)蛋白質(zhì)混合物酶解后的肽段進(jìn)行分析，再追溯其相關(guān)蛋白質(zhì)信息。然而，由于磷酸化肽在生物體中含量低（通常為10-9mol/L），在質(zhì)譜中的離子化效率差以及受到非磷酸化分子對(duì)磷酸化肽信號(hào)的抑制作用，采用質(zhì)譜法直接檢測(cè)磷酸化肽面臨諸多困難。因此，在質(zhì)譜檢測(cè)之前，對(duì)磷酸化肽進(jìn)行高效和特異性的富集是目前磷酸化蛋白組學(xué)研究的前提。

磁性納米粒子具有優(yōu)異的磁響應(yīng)性、良好的生物相容性、低毒性以及特殊的靶向性等性質(zhì)，在核磁共振成像、腫瘤治療、靶向藥物載體、基因治療載體以及生物分離等研究領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景[15]?；诖欧蛛x的磁性納米材料，可以簡(jiǎn)化分離過(guò)程，減少材料和樣品的損失，極大地增加富集效率和樣品的回收利用，通過(guò)對(duì)其進(jìn)一步修飾特異性鍵合磷酸化肽的親和分子而制備的功能化磁性復(fù)合納米材料，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽的快速、高效和特異性的分離和富集，為深入地研究磷酸化蛋白組學(xué)提供可能。本文圍繞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究這一前沿性的研究課題，再結(jié)合在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景的功能化磁性復(fù)合納米材料的制備而設(shè)計(jì)的研究型綜合性實(shí)驗(yàn)-功能化磁性復(fù)合納米材料富集磷酸化肽，囊括了材料、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等交叉學(xué)科領(lǐng)域，旨在開拓學(xué)生的科研視野，實(shí)現(xiàn)多學(xué)科的交叉融合，培養(yǎng)具有創(chuàng)新思維和獨(dú)立實(shí)踐能力的科研創(chuàng)新人才。

2 功能化磁性復(fù)合納米材料富集磷酸化肽綜合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

1）學(xué)習(xí)羧基修飾的磁性Fe3O4納米材料的制備以及氨基功能化的方法，掌握掃描電鏡、激光粒度儀及熱重分析的原理及操作技能。

2）了解基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜分析原理及其在磷酸化肽檢測(cè)方面的應(yīng)用。

3）激發(fā)學(xué)生聚焦生物醫(yī)學(xué)研究前沿，融合多門學(xué)科和所學(xué)知識(shí)開展面向需求引導(dǎo)的科學(xué)研究。

2.2 實(shí)驗(yàn)原理

2.2.1 功能化磁性復(fù)合納米材料制備原理

現(xiàn)有Fe3O4納米材料的制備方法包括共沉淀法、溶膠-凝膠法、高溫分解法、微乳液法、超聲波化學(xué)法以及水熱/溶劑熱法等[16]。其中，溶劑熱法是以有機(jī)試劑為溶劑，利用高壓反應(yīng)釜在高溫高壓條件下合成磁性納米材料的方法。以氯化鐵、檸檬酸鈉和醋酸銨為原料，在乙二醇為溶劑的高溫高壓反應(yīng)下可獲得羧基修飾的磁性Fe3O4納米材料。

乙二胺核的樹狀大分子（polyamidoamine dendrimer,PAMAM）具有良好的空間排布結(jié)構(gòu)、好的化學(xué)穩(wěn)定性以及由分支單元形成的大量空腔，在成像、藥物傳遞、基因治療、催化和納米醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[17]。PAMAM 樹狀大分子表面帶有大量的一級(jí)胺和二級(jí)胺。通過(guò)酰胺反應(yīng)可以將帶有大量氨基的PAMAM 樹狀大分子固定到羧基修飾的磁性Fe3O4納米材料上，獲得PAMAM 樹狀大分子功能化的磁性復(fù)合納米材料。

2.2.2 功能化磁性復(fù)合納米材料富集磷酸化肽的原理

基于親和材料富集磷酸化肽的機(jī)理可以分為螯合作用、靜電相互作用以及氫鍵?；诓煌淖饔脵C(jī)理衍生出固定金屬離子親和色譜法，金屬氧化物親和色譜法和基于氨基的親和色譜法[18]。PAMAM 功能化的磁性復(fù)合納米材料表面帶有大量正電荷的氨基（pKa≥9），可以利用氨基與磷酸基團(tuán)（pKa=1～2）間可逆的氫鍵和靜電相互作用特異性富集磷酸化肽，實(shí)現(xiàn)在弱酸性條件下對(duì)磷酸化肽的富集，在強(qiáng)酸性條件下釋放，再結(jié)合Fe3O4納米材料的磁分離性，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽的快速、高效和特異性的分離和富集。

2.2.3 基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定磷酸化肽的原理

基質(zhì)輔助激光解析（matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI）的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，用激光照射晶體時(shí)，基質(zhì)分子吸收激光的能量并將其轉(zhuǎn)移到被酸化的分析物中，由于激光引起的快速加熱，導(dǎo)致基質(zhì)的解析和分析物的電離及氣化，基質(zhì)/樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離，結(jié)合時(shí)間分析質(zhì)量分析器（time-of-flight mass spectrometry,TOF），獲得肽段的精確質(zhì)量。將肽段進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜解析或與文獻(xiàn)比對(duì)，確定磷酸化肽段。

2.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

2.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑

六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O）（99%），醋酸銨（NH4Ac）（99%），PAMAM（乙二胺核，3 代）（20 wt%于甲醇中），α-酪蛋白（99%），2,5-二羥基苯甲酸（DHB）（98%），三氟乙酸（TFA）（99%），N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）（98%）購(gòu)買于Sigma Aldrich 公司。1-羥基苯并三唑（HOBt）（98%）購(gòu)買于Aladdin 試劑公司。檸檬酸鈉（Na3CT），乙二醇（EG），醋酸（HAc），N,N-二甲基甲酰胺（DMF），乙腈，乙醇，分析純，購(gòu)買于成都科龍?jiān)噭┕?。脫脂牛奶?gòu)買于本地超市，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用去離子水（RO）。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

激光粒度分析儀（Nano-ZS90，Malvern），掃描電鏡（S-4800，Hitachi），熱重分析儀（STA449C Jupiter，Netzsch），基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Auto Flex Ⅲ，Bruker），震動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（PPMS，Quantum Design），磁力攪拌/加熱器（RCT basic，IKA），超聲波清洗器（SB-52 DTD，寧波新藝超聲設(shè)備公司），數(shù)顯搖床（MS 3 digital，IKA），渦旋振蕩器（Genius 3，IKA），烘箱（202-00A，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）和電子天平（ME104，梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2.3.3 其他實(shí)驗(yàn)用品

高溫反應(yīng)釜，聚四氟乙烯內(nèi)膽，燒杯，移液槍，磁鐵和EP 管購(gòu)買于探索平臺(tái)。

2.4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.4.1 功能化磁性復(fù)合納米材料的制備

1）采用溶劑熱法制備Fe3O4納米材料

將0.69 g 的FeCl3·6H2O、0.24 g 的Na3CT 和1.98 g 的NH4Ac 加入到包含36 mL 乙二醇的聚四氟乙烯內(nèi)膽中。將上述分散液于室溫下劇烈攪拌1 h。隨后，將該聚四氟乙烯內(nèi)膽轉(zhuǎn)移到高溫反應(yīng)釜中，放入烘箱在200 ℃下加熱16 h。反應(yīng)結(jié)束后，反復(fù)用乙醇和水洗滌產(chǎn)物多次并利用外部磁場(chǎng)進(jìn)行分離。最后，將制備的Fe3O4納米球重新分散到15 mL 去離子水中備用。

2）采用酰胺反應(yīng)制備PAMAM 功能化的磁性復(fù)合納米材料

將0.25 mL 的Fe3O4懸浮液、135 mg 的EDCI、95 mg 的HOBt 和295 μL 的DIPEA 加入包含0.5 mL的水和6.5 mL 的DMF 的混合溶液中。將上述懸浮液在2 000 r/min 下振蕩1 h 以激活羧基。然后，將150 μL 的PAMAM 加入上述溶液中，繼續(xù)振蕩24 h。反應(yīng)結(jié)束后，將得到的功能化磁性復(fù)合納米球用DMF 和去離子水洗滌多次并通過(guò)外部磁性進(jìn)行分離。最后，將制備的磁性復(fù)合納米球分散在0.5 mL 水中備用，如圖1（a）所示。

圖1 材料合成及富集過(guò)程示意圖

2.4.2 功能化磁性復(fù)合納米材料的表征

1）激光粒度儀表征（dynamic light scattering,DLS/Zeta 電位）

將少量樣品分散在去離子水中，超聲分散。取1.5 mL 上述分散液于比色皿中，觀測(cè)樣品的水合直徑及粒徑分布情況，重復(fù)3 次測(cè)試；將少量樣品分散在去離子水中，超聲分散。取1 mL 上述分散液于電位池中，考察樣品的表面電位，重復(fù)3 次測(cè)試。

2）掃描電鏡表征（scanning electron microscopy,SEM）

將單晶硅片置于乙醇溶液中超聲10 min 進(jìn)行清潔。隨后，取10 mL 的500 μg/mL 的樣品分散液于硅片上，自然干燥后，放入掃描電鏡中，對(duì)樣品表面微觀形貌進(jìn)行觀察。

3）磁性能表征（vibrating sample magnetometer,VSM）

取5～10 mg 粉末樣品裝入一端封口的1 cm 塑料管中。再利用棉花堵住另一端管口，形成密閉的腔室。室溫下，將該塑料管放入磁強(qiáng)計(jì)中檢測(cè)，獲得樣品的磁化曲線和飽和磁化強(qiáng)度。磁場(chǎng)強(qiáng)度測(cè)定范圍為0～16×105A/m。

4）熱重分析（thermogravimetric analysis,TGA）

稱取10 mg 粉末樣品于氧化鋁坩堝中，將其放入熱重分析儀中。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以10 K/min的升溫速度將樣品從35 ℃升至900 ℃，最終得到樣品在升溫過(guò)程中的重量變化，評(píng)估材料表面修飾PAMAM 樹狀大分子的含量。

2.4.3 功能化磁性復(fù)合納米材料對(duì)磷酸化肽的富集和質(zhì)譜檢測(cè)

1）模型蛋白和生物樣品消解液制備

將1 mg 的α-酪蛋白溶解在1 mL 的NH4HCO3（25 mmol/L，pH=8.3）溶液中，然后與胰蛋白酶以1∶40（w/w）的比例混合后在37 ℃下孵育16 h，獲得α-酪蛋白消解液。將55 μL 的脫脂牛奶溶解到1 mL 的NH4HCO3溶液中，隨后在140 00 r/min下離心20 min，取上清液在100 ℃下煮沸15 min使蛋白質(zhì)變性，待完全冷卻后，加入60 μg 的胰蛋白酶在37 ℃下消解16 h，獲得脫脂牛奶消解液。最后，將上述制備的消解液放入-20 ℃的冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2）將α-酪蛋白消解液用富集緩沖液（70%ACN-H2O,0.1 mol/L HAc）稀釋成10-6mol/L 濃度。取100 μg 功能化的磁性復(fù)合納米材料加入上述溶液中，在室溫下孵育45 min 達(dá)到吸附平衡。利用外部磁場(chǎng)將富集后的材料與溶液分離，移除上清液，并用富集液洗滌（200 μL/次）3 次去除非特異性吸附的肽段。最后，在上述材料中加入20 μL的洗脫液（50% ACN-H2O,2% TFA），劇烈振蕩20 min 將捕獲的磷酸化肽洗脫下來(lái)用于質(zhì)譜測(cè)試，如圖1（b）所示。

3）質(zhì)譜檢測(cè)

取1.5 μL 洗脫液與1.5 μL DHB 基質(zhì)（25 mg/mL,ACN∶H2O∶H3PO4=70∶29∶1，v/v/v）混合后滴加到靶板上，自然干燥后放入質(zhì)譜儀中進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試時(shí)使用正離子模式，測(cè)試范圍從1 000～3 500 Da。將材料富集α-酪蛋白消解液后的洗脫液同富集前的α-酪蛋白消解液質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)比，并將鑒定的肽段與α-酪蛋白消解液中標(biāo)準(zhǔn)的磷酸化肽段進(jìn)行對(duì)比，如表1 所示。確定富集磷酸化肽的數(shù)量，對(duì)材料在模型蛋白中富集磷酸化肽的性能進(jìn)行評(píng)估。

表1 α-酪蛋白和β-酪蛋白消解液中磷酸化肽分子量對(duì)照表[19-22]

4）實(shí)際生物樣本中磷酸化肽的富集

將100 μg 功能化的磁性復(fù)合納米材料加入200 μL 由富集液稀釋的脫脂牛奶消解液中，經(jīng)上述相同的富集、洗滌和洗脫過(guò)程后，將洗脫液用于質(zhì)譜檢測(cè)。脫脂牛奶消解液中的磷酸化肽主要來(lái)源于α-酪蛋白和β-酪蛋白，將檢測(cè)的肽段分子量與表1 進(jìn)行對(duì)照，確定富集磷酸化肽的數(shù)量，將脫脂牛奶消解液富集前和富集后的洗脫液的質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)比，評(píng)估材料在實(shí)際生物樣本中富集磷酸化肽的性能。必要時(shí)將該材料應(yīng)用于真實(shí)病人血清和唾液樣本中磷酸化肽的富集，通過(guò)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，尋找疾病相關(guān)潛在生物標(biāo)志物，為磷酸化蛋白組學(xué)相關(guān)生物學(xué)過(guò)程和病理學(xué)過(guò)程研究提供可能。

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究型綜合實(shí)驗(yàn)聚焦生物醫(yī)學(xué)前沿，融合了材料、化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等多學(xué)科理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能，使學(xué)生掌握磁性復(fù)合納米材料制備方法及相關(guān)表征原理和目的，并根據(jù)這種新型磁性復(fù)合納米材料建立針對(duì)磷酸化肽的快速、高效和特異性的分離和富集方法，結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)對(duì)目標(biāo)磷酸化肽段進(jìn)行鑒定和分析。該實(shí)驗(yàn)以解決現(xiàn)有生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域難點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題為出發(fā)點(diǎn)，以豐富傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，提高學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)技能和科研創(chuàng)新能力為目的，鼓勵(lì)學(xué)生參與科學(xué)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)施和改進(jìn)，滿足了學(xué)生科研自主化、開拓性和創(chuàng)新性的發(fā)展要求。通過(guò)對(duì)磁性復(fù)合納米材料的進(jìn)一步改性，該項(xiàng)目可拓展至藥物的靶向遞送、核磁共振成像、腫瘤熱療以及基因治療載體等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。此外，通過(guò)探索PAMAM 修飾比例以及緩沖液條件對(duì)材料富集性能的影響等開放性研究?jī)?nèi)容，大大增強(qiáng)了學(xué)生對(duì)綜合型實(shí)驗(yàn)以及科學(xué)研究的興趣，為培養(yǎng)具有創(chuàng)新思維和獨(dú)立實(shí)踐能力的科研創(chuàng)新人才奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)和方向。