邵 帥,石學(xué)穎,王 洋,丁 濤,姜經(jīng)航,江 梅

0 引 言

精子冷凍技術(shù)作為輔助生殖技術(shù)中的重要組成部分,廣泛應(yīng)用于供精的保存、自體精子保存以及放化療前生育力保護(hù)。玻璃化冷凍是將細(xì)胞中的水分置換成高濃度的冷凍保護(hù)劑,在冷凍過程中形成玻璃化狀態(tài),保存了細(xì)胞中的正常分子和離子分布,避免細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而達(dá)到保護(hù)精子細(xì)胞的目的[1]。由于微量精子像嚴(yán)重少精癥精子、睪丸穿刺和附睪穿刺精子不易獲取,質(zhì)量也差,精子的特殊結(jié)構(gòu),其內(nèi)部水分含量很低,常規(guī)冷凍方法不適用于精子冷凍;此方法使用高濃度滲透性保護(hù)劑具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)損傷,導(dǎo)致精子化學(xué)結(jié)構(gòu)改變和能量代謝紊亂[2-3]。

為了避免高滲透性冷凍保護(hù)劑對(duì)精子的毒性影響,近年來研究發(fā)現(xiàn)無滲透性冷凍保護(hù)劑玻璃化冷凍精子開始應(yīng)用,通過加入終濃度為0.25 mol/L 蔗糖玻璃化冷凍精子的方法,避免了滲透性冷凍保護(hù)劑的使用,與常規(guī)冷凍相比,有更高的回收率、活力以及更低的DNA碎片[4]。盡管在精子冷凍領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展,但精子解凍后的活力和受精率顯著下降,這在一定程度上是由于低溫保存誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,從而形成活性氧(ROS),精子質(zhì)膜的多不飽和脂肪酸易受ROS損傷,導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)和功能受損。因此,尋找合適的抗氧化劑減少自由基和氧化應(yīng)激,從而提高輔助生殖技術(shù)的生育潛力勢(shì)在必行。本研究通過在微量精液中加入褪黑素,觀察對(duì)無滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍影響研究。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2022 年4-9月在荊門市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的30例男性患者的精液樣本?；颊呓?～7 d后手淫取精,精液取出置于 37 ℃孵箱,完全液化后檢查,正常精液先進(jìn)行梯度離心(SAGE),然后加精子培養(yǎng)液(COOK)進(jìn)行洗滌,最后加精子培養(yǎng)液進(jìn)行上游,將上游后的精子密度調(diào)至( 1-5) × 106/mL待用。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡20～55歲;②世界衛(wèi)生組織 (WHO)《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版正常值(精子濃度≥15×106/mL,前向運(yùn)動(dòng)精子(PR)≥32%,PR+非前向運(yùn)動(dòng)精子≥40%,pH≥7.2,液化時(shí)間<60 min)、正常形態(tài)≥4%。排除標(biāo)準(zhǔn):精液量<1 mL。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(批準(zhǔn)號(hào):2022051215),患者知情同意,所有精液樣本處理后按醫(yī)療廢物處理。

1.2 方法

1.2.1 精子冷凍分組上游處理后每份精子分為4組,常規(guī)冷凍組:精子懸液中逐滴加入等體積的精子冷凍保護(hù)劑(Quinns Advantage Sperm Freezing Me-dium, SAGE),取60 μL加入 2 mL 的冷凍管中,然后置于液氮面上方 15 cm 熏蒸 30 min,投入液氮保存;微滴冷凍組:將精子懸液與等體積精子冷凍保護(hù)劑混合后共計(jì)60 μL,用拉細(xì)巴斯德吸管吸取精子混合液于管口形成10～15 μL液滴后即滴入液氮中,形成致密微滴后沉入液氮底部,將其裝入冷凍管后置于液氮中保存;無保護(hù)劑微滴冷凍組:將精子懸液加入等體積 0.5 mol/L蔗糖溶液共計(jì)60 μL,混合液中蔗糖終濃度為 0.25 mol/L,用拉細(xì)巴斯德吸管吸取精子混合液于管口形成10～15 μL液滴后即滴入液氮中,將其裝入冷凍麥管后置于液氮中保存;褪黑素+無保護(hù)劑微滴冷凍組:將精子懸液加入等體積 0.5 mol/L蔗糖溶液共計(jì)60 μL,混合液中加入褪黑素使其終濃度為0.01 mmol/L。用拉細(xì)巴斯德吸管吸取精子混合液于管口形成10～15 μL液滴后即滴入液氮中,形成致密微滴后便沉入液氮底部,將其裝入冷凍麥管后置于液氮中保存。

1.2.2 精子復(fù)蘇精子液氮凍存 24 h 后取出,常規(guī)冷凍立即將凍存管置于 37 ℃ 恒溫水浴箱中振蕩混勻直至完全液化,300g離心10 min留底部沉淀100 μL;微滴組將凍存管內(nèi)的冷凍微滴投入 37 ℃孵育的 3 mL精子培養(yǎng)液中,直至微滴全部溶解。300 g離心10 min留底部沉淀100 μL。計(jì)算機(jī)輔助精液分析法(CASA)檢測(cè)精子活力,計(jì)算精子復(fù)蘇率。

1.2.3 精子存活情況應(yīng)用伊紅-苯胺黑染色試劑盒測(cè)定存活精子百分率,分別取20 μL復(fù)蘇后精液與20 μL染色劑在室溫下混合,染色 30 s后,取20 μL精液涂片,干燥封片。計(jì)數(shù) 200個(gè)精子,頭部未染色的為活精子,而頭部染紅為死精子,計(jì)算存活精子百分率。

1.2.4 精子形態(tài)情況采用改良巴氏染色法,對(duì)精子頭部、頸部、尾部形態(tài)進(jìn)行評(píng)判,計(jì)算正常形態(tài)精子。

1.2.5 質(zhì)膜完整性檢測(cè)采用低滲腫脹試驗(yàn)檢測(cè)精子質(zhì)膜完整性。取20 μL精液加入到200 μL低滲試劑(含有果糖和檸檬酸)中, 37 ℃水浴中平衡30 min,取15 μL涂片,用光學(xué)顯微鏡觀察觀察彎尾的精子數(shù)。

1.2.6 頂體完整性采用改良巴氏染色法,Ⅰ型:頂體完整,頂體邊緣整齊,有時(shí)可見清晰的赤道板;Ⅱ型:頂體輕微膨脹,頂體膜疏松膨大;Ⅲ型:頂體破壞,精子質(zhì)膜嚴(yán)重受損,邊緣不整齊;Ⅳ型:頂體全部脫落,核裸露。Ⅰ型是頂體正常的精子,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型均為頂體不完整。計(jì)算頂體完整率。

1.2.7 DFI檢測(cè)DFI檢測(cè)采用精子DNA碎片檢測(cè)試劑盒 (深圳博銳德) , 按試劑盒說明書步驟操作,100倍油鏡下觀察, 比較精子核和核周圍暈輪大小, 評(píng)價(jià)精子DNA碎片率。根據(jù)單側(cè)暈輪厚度與精子頭部最小直徑比例進(jìn)行評(píng)判, 當(dāng)單側(cè)暈輪厚度≤1/3精子頭部最小直徑時(shí),表明精子存在DNA碎片。精子DNA碎片率>25%視為異常。

1.2.8 MDA、SOD和GSH-Px檢測(cè)采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定,按照說明書操作,各管分別加入精子懸液以及相應(yīng)的試劑,酶標(biāo)儀測(cè)定測(cè)各管吸光度值,通過公式計(jì)算含量。

2 結(jié) 果

2.1 褪黑素對(duì)復(fù)蘇后精子活力、復(fù)蘇率以及存活率的影響CASA和伊紅-苯胺黑染色結(jié)果顯示,4組復(fù)蘇后PR和存活率均低于冷凍前(P<0.01);微滴冷凍組、無保護(hù)劑微滴冷凍組復(fù)蘇后PR、復(fù)蘇率及復(fù)蘇后存活率高于常規(guī)冷凍組(P<0.05);無保護(hù)劑微滴冷凍組復(fù)蘇后精子存活率明顯高于微滴冷凍組(P<0.05);褪黑素+無保護(hù)劑微滴冷凍組復(fù)蘇后PR和復(fù)蘇率高于無保護(hù)劑微滴冷凍組(P<0.05)。見表1。

表1 褪黑素對(duì)精子復(fù)蘇后活力、復(fù)蘇率以及存活率的影響Table 1 Effects of melatonin on sperm motility, resuscitation rate and survival rate after

2.2 褪黑素對(duì)精子復(fù)蘇后正常形態(tài)率和頂體完整性的影響巴氏染色結(jié)果顯示,4組復(fù)蘇后正常形態(tài)率和頂體完整性明顯低于冷凍前(P<0.01);褪黑素+無保護(hù)劑微滴冷凍組復(fù)蘇后正常形態(tài)率和頂體完整性明顯高于其他3組(P<0.05)。見表2。

表2 褪黑素對(duì)精子復(fù)蘇后形態(tài)率和頂體完整性的影響Table 2 Effects of melatonin on morphological rate and acrosomal integrity of sperm after resuscitation

2.3 褪黑素對(duì)復(fù)蘇后精子質(zhì)膜完整率和DFI的影響低滲腫脹實(shí)驗(yàn)和SCD檢測(cè)結(jié)果顯示,4組復(fù)蘇后質(zhì)膜完整率均明顯低于冷凍前(P<0.01),DFI明顯高于冷凍前(P<0.01)。微滴冷凍組、無保護(hù)劑微滴冷凍組復(fù)蘇后質(zhì)膜完整率高于常規(guī)冷凍組(P<0.05);褪黑素+無保護(hù)劑微滴冷凍組復(fù)蘇后質(zhì)膜完整率高于微滴冷凍組(P<0.05),而DFI明顯低于微滴冷凍組(P<0.05)。見表3。

表3 褪黑素對(duì)復(fù)蘇后精子質(zhì)膜完整率和DFI的影響Table 3 Effects of melatonin on plasma membrane integrity and DFI of sperm after resuscitation

2.4 褪黑素對(duì)復(fù)蘇后精子氧化應(yīng)激水平的影響氧化應(yīng)激結(jié)果顯示,4組復(fù)蘇后MDA明顯高于冷凍前,SOD以及GSH-Px明顯低于冷凍前(P<0.01)。與常規(guī)冷凍組相比,無保護(hù)劑微滴冷凍組、褪黑素+無保護(hù)劑微滴冷凍組MDA明顯降低(P<0.05),SOD及GSH-Px明顯升高(P<0.01);與微滴冷凍組相比,褪黑素+無保護(hù)劑微滴冷凍組MDA明顯降低(P<0.05)。褪黑素+無保護(hù)劑微滴冷凍組SOD、 GSH-Px較其他3組明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 褪黑素對(duì)復(fù)蘇后精子氧化應(yīng)激水平的影響Table 4 Effect of melatonin on oxidative stress level of sperm after resuscitation

3 討 論

常規(guī)精子冷凍技術(shù)相對(duì)成熟,廣泛應(yīng)用于生殖中心和精子庫,然而像睪丸切開顯微取精、睪丸穿刺取精以及附睪穿刺取精的精子等由于精子數(shù)量少、活力差,常規(guī)精子冷凍保存方法不僅回收率低,而且存活率低[6-7]。精子冷凍過程中冰晶的形成、保護(hù)劑在降溫以及升溫中對(duì)細(xì)胞和膜滲透性損傷的毒性效應(yīng),都嚴(yán)重影響精子的活力、結(jié)構(gòu)功能。凍融過程產(chǎn)生大量的活性氧(ROS )一方面會(huì)導(dǎo)致主要的精子功能缺陷;另一方面ROS 導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,從而損傷線粒體膜以及導(dǎo)致膜完整性降低,并誘導(dǎo)精子凋亡、DNA 碎片化[8-9]。因此,復(fù)蘇后無活動(dòng)精子或精子損傷嚴(yán)重導(dǎo)致受精率低下,胚胎質(zhì)量下降,臨床妊娠率降低而流產(chǎn)率高等。對(duì)于稀少精子冷凍一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

針對(duì)微量精子冷凍中的高濃度的滲透性保護(hù)劑的毒性作用,本研究采取無滲透性冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍。無滲透性冷凍保護(hù)劑玻璃化冷凍是指不添加任何滲透性保護(hù)劑,通過添加蔗糖快速降溫,使精子迅速達(dá)到玻璃化狀態(tài),避免了冰晶形成對(duì)精子細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架的物理損傷[10]。針對(duì)冷凍過程中的精子損傷以及氧化應(yīng)激,本研究通過添加褪黑素,褪黑激素合成的吲哚胺激素,由于褪黑激素具有很強(qiáng)的抗氧化和抗凋亡特性,而且在男性生育力保存和男性生殖系統(tǒng)中的發(fā)揮了極大的作用[11-12]。因此,本實(shí)驗(yàn)以精子微滴進(jìn)行無滲透性保護(hù)劑玻璃化冷凍,通過添加褪黑素研究微滴無保護(hù)劑玻璃化冷凍玻璃化冷凍微量精子的可行性及安全性。

研究結(jié)果顯示無滲透性冷凍保護(hù)劑冷凍復(fù)蘇后的精子前向運(yùn)動(dòng)和復(fù)蘇率要明顯優(yōu)于常規(guī)精子冷凍組,略好于微滴玻璃化冷凍組,這與葛斌等[13]在無保護(hù)劑玻璃化冷凍技術(shù)凍存 PESA 精子中的實(shí)用性研究的結(jié)果相一致,說明此方法相對(duì)常規(guī)冷凍和微滴玻璃化冷凍而言有優(yōu)勢(shì);添加褪黑素的無保護(hù)劑冷凍組復(fù)蘇后的精子前向運(yùn)動(dòng)、復(fù)蘇率、正常形態(tài)率以及DFI均明顯優(yōu)于其他冷凍組,這與Mehaisen GMK等[14]研究顯示添加褪黑素能夠?qū)鋬龅墓u精子質(zhì)量起保護(hù)作用,降低冷凍過程脂質(zhì)過氧化、DNA 斷裂和凋亡的研究結(jié)果一樣。說明褪黑素在精子冷凍過程中能夠發(fā)揮保護(hù)作用,避免冷凍損傷。無保護(hù)劑微滴冷凍組和添加褪黑素冷凍組的復(fù)蘇存活率均高于微滴冷凍組和常規(guī)冷凍組,可能與蔗糖作在冷凍過程中提高了細(xì)胞外的滲透壓,避免細(xì)胞內(nèi)水分向外流出而造成細(xì)胞脫水而皺縮,減少了細(xì)胞內(nèi)冰晶形成,從而避免細(xì)胞遭受破壞[15]。精子質(zhì)膜和頂體是在精子冷凍和解凍過程中最易受損傷的部位,也是影響精子受精能力的重要因素之一。精子質(zhì)膜和頂體的完整性對(duì)精子維持自身新陳代謝、精子獲能和頂體反應(yīng)等能力有直接關(guān)系。添加褪黑素的無保護(hù)劑冷凍組復(fù)蘇后的精子質(zhì)膜和頂體的完整性均明顯優(yōu)于其他冷凍組,Fadl AM等[14]研究也顯示添加 1.0 mmol/L 褪黑素的精液稀釋劑可改善冷凍精液的運(yùn)動(dòng)性、活力、質(zhì)膜和頂體完整性,能夠提高受精率和出生率。在冷凍過程中,滲透壓變化通過改變鹽濃度來影響膜完整性和精子穩(wěn)態(tài)[16]。褪黑素能夠減少脂質(zhì)過氧化和調(diào)節(jié)滲透平衡和 pH 值,增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑的合成,對(duì)抗氧化酶的活性和增加SOD、GPx、GSH和過氧化氫酶的蛋白質(zhì)有積極作用[17]。本研究也顯示褪黑素能夠降低MDA活性表達(dá),增加SOD以及GSH-Px活性表達(dá),從而發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用。其機(jī)制可能與褪黑素增加線粒體呼吸鏈復(fù)合物成分的mRNA表達(dá)和復(fù)合物I、II、III和IV的活性,改善了冷凍精子的 OXPHOS,其具體機(jī)制可能通過PI3K/AKT以及HGF/c-Met信號(hào)通路發(fā)揮作用[18-20]。本研究使用正常精液進(jìn)行稀釋成微量精子進(jìn)行冷凍復(fù)蘇,不能直接反應(yīng)嚴(yán)重少精弱癥精子、睪丸穿刺、附睪穿刺以及睪丸切開顯微取精精子的冷凍復(fù)蘇后狀態(tài),有一定局限性。后期需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證無滲透性微滴玻璃化冷凍對(duì)睪丸穿刺精子冷凍復(fù)蘇的影響,以便為嚴(yán)重少精弱癥精子、睪丸穿刺、附睪穿刺以及睪丸切開顯微取精精子的冷凍起一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述,無滲透性微滴玻璃化冷凍有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),能夠有效保存微量精子,而添加褪黑素能夠明顯提高精子的PR、活力、正常形態(tài)、DFI、質(zhì)膜和頂體完整性,其原因可能與降低MDA,增加SOD以及GSH-Px表達(dá)有關(guān)。添加褪黑素進(jìn)行無保護(hù)劑微滴法玻璃化冷凍可能是一種安全有效的冷凍方法。