趙若男，玉萬(wàn)國(guó)，陳振林，宋慕波，劉英健*

1. 賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西賀州 542899；2. 廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州 545616

荸薺（Eleocharis dulcis）也稱(chēng)馬蹄，是禾本目莎草科荸薺屬的一種淺水植物[1]。作為中國(guó)特色水生蔬菜，荸薺在廣西、福建、海南等地均有大面積種植[2]。荸薺的球莖與蓮藕的根莖、馬鈴薯的塊莖、洋蔥的鱗莖等都屬于地下變態(tài)莖[3]。膨大的荸薺球莖可供食用，口感清脆、汁多味甜，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1,4]。荸薺球莖的膨大過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程，需要經(jīng)歷4個(gè)階段[5]。球莖膨大的第一個(gè)階段是匍匐莖階段，此階段球莖頂端開(kāi)始膨大，淀粉積累較少；之后是膨大初期，此時(shí)球莖開(kāi)始生長(zhǎng)，淀粉逐漸積累；接下來(lái)是膨大中期，球莖生長(zhǎng)速度減緩；最后是膨大后期，此階段球莖生長(zhǎng)速度又加快，淀粉快速積累[6-8]。球莖的發(fā)育直接關(guān)系到荸薺的產(chǎn)量。因此，開(kāi)展荸薺球莖膨大的分子機(jī)理研究對(duì)優(yōu)化荸薺育種有重要意義。

近期研究中發(fā)現(xiàn)CONSTANS-Like（COL）基因家族成員可能在變態(tài)莖發(fā)育過(guò)程中起主要的調(diào)控作用。COL屬于鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族，已知其家族成員在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色[9-10]。COL基因包含2~3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，靠近N端有1個(gè)或者2個(gè)B-box Zinc finger結(jié)構(gòu)域，另外一個(gè)是靠近C端的由約43個(gè)氨基酸組成的CCT保守結(jié)構(gòu)域[5,11]。目前，COL基因家族已經(jīng)在許多物種中相繼報(bào)道。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了17個(gè)COL基因家族成員[12]，在水稻（Oryza sativa）中至少有16個(gè)[13]，大麥（Hordeum vulgare）中有9個(gè)[13]，煙草（Nicotiana tabacum）中有15個(gè)[14]，杜仲（Eucommia ulmoides）有8個(gè)COL基因[9]。以往研究發(fā)現(xiàn)，COL基因家族不同成員的功能各不相同。在擬南芥中的一系列研究發(fā)現(xiàn)，AtCOL4通過(guò)脫落酸依賴(lài)性信號(hào)參與植物非生物脅迫反應(yīng)，增強(qiáng)植物的耐受性[15]。過(guò)表達(dá)AtCOL9可以延遲擬南芥開(kāi)花[16]。AtCOL3是側(cè)根發(fā)育和形成的正調(diào)控因子，另外在短日光條件下，抑制芽的伸長(zhǎng)，促進(jìn)分支芽的形成[17]。AtCOL7在擬南芥分支形成和下胚軸的伸長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[18]。煙草中有3個(gè)COL基因在低溫環(huán)境中表現(xiàn)出較大的差異，NtCOL13b在葉片中有較高的表達(dá)量，而NtCOL16c和NtCOL16d剛好相反[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，COL基因在植物貯藏器官發(fā)育中扮演著重要角色。蓮藕NnCOL5基因參與根莖的膨大，尤其在根莖膨大中期（S3時(shí)期）表達(dá)量最高，并且在馬鈴薯中過(guò)表達(dá)NnCOL5可明顯促進(jìn)塊莖單薯重和淀粉顯著升高[19]。通過(guò)反義基因技術(shù)證實(shí)馬鈴薯（Solanum tuberosum）中的1個(gè)COL家族成員在塊莖膨大發(fā)育過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用[20]。雖然在部分植物變態(tài)莖的發(fā)育過(guò)程中證實(shí)了COL基因的重要作用，但荸薺球莖中僅對(duì)淀粉合成過(guò)程中關(guān)鍵酶編碼基因進(jìn)行了克隆[21-24]，膨大過(guò)程中COL基因的作用尚未有相關(guān)研究。

鑒于此，本研究從前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選并克隆荸薺球莖膨大相關(guān)COL基因，并對(duì)該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)利用熒光定量PCR分析該基因在球莖膨大過(guò)程中以及在不同組織中的表達(dá)模式。為進(jìn)一步研究COL家族基因在荸薺膨大這一過(guò)程的分子機(jī)制和基因功能研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料選取廣西地方品種桂林荸薺，采自廣西賀州市八步區(qū)荸薺種植田，根據(jù)荸薺球莖不同發(fā)育時(shí)期（S1~S4時(shí)期，球莖最寬處直徑分別約為10、20、35、50 mm）進(jìn)行取樣。同時(shí)采集球莖膨大后期的根、葉片、荸薺皮和荸薺肉樣品。液氮速凍于-80 ℃超低溫冰箱備用。植物RNA提取試劑盒購(gòu)自華越洋生物科技（北京）有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、載體PMD18-T、DH5α大腸桿菌感受態(tài)均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 荸薺基因組DNA、總RNA和cDNA的合成 從-80 ℃超低溫冰箱中取出步驟1.1所儲(chǔ)存的樣品，按照植物基因組DNA提取試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行荸薺樣品DNA、總RNA的提取。用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和含量。對(duì)合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄從而獲得cDNA第一鏈，-20 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 荸薺COL5基因的克隆 前期取荸薺葉、莖、根和球莖不同膨大時(shí)期的組織采用Pacbio平臺(tái)進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Pacbio full-length cDNA sequencing），測(cè)序共獲得154 398個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列信息。在此荸薺轉(zhuǎn)錄組中篩選得到的CwCOL5基因序列信息設(shè)計(jì)引物（CwCOL5-F：5′-ATGGGAATAGAAAAAGGAGCCAAGT-3′，CwCOL5- R：5′-TCAAAATGTCGGCACCACACTGTAC-3′）。

分別以荸薺球莖組織的DNA、cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序見(jiàn)表1和表2。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，切膠，使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，將回收產(chǎn)物連接至PMD18-T載體后轉(zhuǎn)入DN5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)菌液PCR后，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行送測(cè)。

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序Tab. 2 PCR amplification reaction procedure

1.2.3 荸薺COL5基因生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析參考董偉清等[24]和宋慕波等[25]的方法進(jìn)行。利用ORF finder、BLASTN、BLASTP、DNAMAN、ProtParam Tool、ExPaSy-SOPMA、SWISS-MODEL、SignalP 4.1 Server、Conserved Domains、TMHMM Server v.2.0以及NetPhos 2.0 Server軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用ClustaW 1.83和Mega 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 荸薺COL5基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析 依據(jù)獲得的CwCOL5基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物（CwCOL5-F: 5′-ACGCTAAGTCTGGCTATAGCTCTCT-3′，CwCOL5-R: (5′-AT GCATAGCGGATTGTCTTCTC-3′），該引物位于COL家族序列保守度低的區(qū)域，以避免該家族其它成員的干擾。以荸薺不同膨大時(shí)期（S1~S4時(shí)期）和不同組織（荸薺皮、荸薺根、荸薺肉和荸薺葉片）的cDNA為模板，以18s rRNA（登錄號(hào)：MG742686）為內(nèi)參，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。測(cè)定方法參考何芳練等[22]的方法進(jìn)行，采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，使用Origin 2018和Adobe Photoshop 2021軟件進(jìn)行圖片處理及美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 荸薺COL5基因的克隆

在荸薺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選被注釋為COL家族成員的轉(zhuǎn)錄本片段，其中編號(hào)為isoform_7928的轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)蛋白與同為莎草科的蒿草（Carex littledalei）COL家族成員同源性高達(dá)87%。在NCBI中的序列比對(duì)結(jié)果顯示，該基因片段與其他物種的COL基因核苷酸序列同源性較高，其中與油棕（Elaeis guineensis）和生姜（Zingiber officinale）的核苷酸同源性分別為78.82%、77.97%。以該片段設(shè)計(jì)特異性引物，分別以荸薺球莖組織的DNA、cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆分別得到長(zhǎng)度約為1000 bp和1200 bp的片段（圖1）。經(jīng)回收測(cè)序結(jié)果表明，以cDNA為模板擴(kuò)增得到的cDNA片段長(zhǎng)為1017 bp，編碼338個(gè)氨基酸（圖2），將其命名為CwCOL5，登錄號(hào)為ON934922。以荸薺基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的DNA片段長(zhǎng)為1275 bp，其含有1個(gè)長(zhǎng)度為257 bp的內(nèi)含子（圖3）。

圖1 CwCOL5基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of PCR amplification products of CwCOL5 gene

圖2 CwCOL5基因ORF序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 2 CwCOL5 gene ORF sequence and its encoded amino acid sequence

圖3 CwCOL5基因結(jié)構(gòu)圖Fig. 3 Structure diagram of the CwCOL5 gene

2.2 CwCOL5基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 CwCOL5蛋白理化性質(zhì)分析 利用ExPaSy-SOPMA軟件對(duì)CwCOL5氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，CwCOL5蛋白質(zhì)由338個(gè)氨基酸組成，其中丙氨酸（Ala）和絲氨酸（Ser）占比最高，分別為9.8%和9.5%，其次是精氨酸（Arg），為8.3%，不含吡咯賴(lài)氨酸（Pyl）、曬半胱氨酸（Sec）。分子式為C1592H2515N477O508S17，總原子數(shù)5109，理論等電點(diǎn)為5.89，相對(duì)分子質(zhì)量為37 010.39，有43個(gè)帶正電荷（Asp+Lys）的氨基酸殘基，有48個(gè)帶負(fù)電荷（Asp+Glu）的氨基酸殘基。親疏水性分析發(fā)現(xiàn)（圖4），CwCOL5蛋白質(zhì)第218位氨基酸殘基疏水性最強(qiáng)（Score=1.467），第279位氨基酸殘基親水性最強(qiáng)（Score=-3.789），總平均親水值（GRAVY）為-0.462，不穩(wěn)定系數(shù)為45.63，推測(cè)為親水性不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.2.2 CwCOL5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 利用Plant-mPLoc server在線軟件對(duì)CwCOL5蛋白質(zhì)序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細(xì)胞核。對(duì)CwCOL5蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白有31個(gè)磷酸化位點(diǎn)，絲氨酸（Ser）23個(gè)，蘇氨酸（Thr）5個(gè)，酪氨酸（Tyr）3個(gè)，其中第292位絲氨酸預(yù)測(cè)得分最高，為0.996。利用SignalP 4.1 Server軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽，并利用TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，CwCOL5編碼的蛋白質(zhì)無(wú)信號(hào)肽，且不含跨膜結(jié)構(gòu)域。

CwCOL5蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白具有113個(gè)（33.43%）α-螺旋、13個(gè)（3.85%）β-折疊、178個(gè)（52.66%）無(wú)規(guī)則卷曲和34個(gè)（10.06%）延伸鏈。使用Swiss-Model軟件對(duì)CwCOL5蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，以系統(tǒng)自動(dòng)匹配度最高的7wsj.2.A為參考建模時(shí)發(fā)現(xiàn)，其三級(jí)結(jié)構(gòu)模型中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.2.3 CwCOL5保守結(jié)構(gòu)域分析 將CwCOL5基因編碼的蛋白氨基酸序列提交至Pfam網(wǎng)站在NCBI進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），CwCOL5編碼的蛋白序列有2個(gè)高度保守的B-box Zinc finger和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域。從結(jié)構(gòu)域位置來(lái)分析，CCT結(jié)構(gòu)域位于CwCOL5蛋白的C端，基序長(zhǎng)為43個(gè)氨基酸，2個(gè)B-box Zinc finger位于N端且緊密相鄰。

圖5 CwCOL5蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig. 5 CwCOL5 protein domain prediction

2.2.4 多序列比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 使用GENEDOC對(duì)CwCOL5蛋白質(zhì)序列同在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的19個(gè)其他植物COL蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析（圖6）。結(jié)果中黑色部分表示蛋白序列同源性最高，其次是深灰色、淺灰色。荸薺COL5與其他植物同源蛋白氨基酸有較高的一致性，在C端和N端的序列都相對(duì)保守。采用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建CwCOL5氨基酸序列與擬南芥、煙草、番茄（Solanum lycopersicum）、高粱（Sorghum bicolor）、小米（Setaria italica）、大麥等19個(gè)物種COL氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖7），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依據(jù)擬南芥COL蛋白可以分為2個(gè)不同的分支，其中荸薺CwCOL5蛋白與ATCOL5等物種COL蛋白親緣關(guān)系較近。

圖6 CwCOL5氨基酸序列比對(duì)Fig. 6 CwCOL5 amino acid sequence alignment

圖7 CwCOL5蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig. 7 CwCOL5 protein phylogenetic evolutionary tree

2.3 CwCOL5基因在球莖膨大過(guò)程中的表達(dá)分析

為了解CwCOL5基因在荸薺球莖膨大4個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況，根據(jù)序列結(jié)果設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，CwCOL5基因S4時(shí)期的表達(dá)量顯著低于S1、S2、S3時(shí)期（P<0.05），S3時(shí)期的表達(dá)量最高（圖8）。

圖8 CwCOL5基因在荸薺球莖膨大過(guò)程中的表達(dá)分析Fig. 8 Expression analysis of CwCOL5 gene during corm enlargement in Chinese water-chestnut

2.4 荸薺CwCOL5基因組織表達(dá)模式分析

由圖9可知，CwCOL5基因在荸薺肉、根、葉片和荸薺皮中均有并表達(dá)，其中，在葉片和荸薺皮中的表達(dá)非常顯著且表達(dá)水平相當(dāng)（P<0.05），在荸薺肉和根部位表達(dá)水平相當(dāng)。

圖9 CwCOL5基因在荸薺不同組織中的表達(dá)Fig. 9 Expression of CwCOL5 gene in different tissues of Chinese water-chestnut

3 討論

荸薺在我國(guó)長(zhǎng)江流域以及廣西、廣東等南方各?。▍^(qū)）都有大面積種植，被廣泛用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1,4]。研究發(fā)現(xiàn)COL（CONSTANS-Like）基因是植物儲(chǔ)存器官發(fā)育的重要調(diào)控基因[26-27]。然而，荸薺球莖作為一種典型的貯藏器官和變態(tài)莖，其球莖膨大調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究較少。本研究克隆得到可能參與荸薺球莖膨大調(diào)控的CwCOL5基因，該序列ORF長(zhǎng)度為1017 bp，可編碼338個(gè)氨基酸，其DNA序列長(zhǎng)1275 bp，包含1個(gè)內(nèi)含子。CwCOL5基因結(jié)構(gòu)特征以及長(zhǎng)度均與蓮藕COL5和馬鈴薯COL相似[20,28]。

目前研究認(rèn)為CO-FT通路在植物變態(tài)莖發(fā)育的調(diào)控中起重要作用，而在該通路中COL基因家族扮演重要角色[29-30]。在擬南芥中，COL基因家族蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為3組，第I組包含2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域；第II組只包含1個(gè)B-box域和1個(gè)CCT域；而第III組包含1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域、1個(gè)次級(jí)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域[13,19,25]。CwCOL5與擬南芥COL基因家族第I組的結(jié)構(gòu)相同。馬鈴薯COL蛋白包含2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域，也屬于第I組[20]。COL蛋白在許多植物中參與光信號(hào)的感受與轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而影響植物開(kāi)花，例如過(guò)表達(dá)AtCOL5時(shí)，F(xiàn)T、SOC1相關(guān)開(kāi)花基因表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致擬南芥可以在短時(shí)間內(nèi)開(kāi)花[31]。然而，有研究表明COL在馬鈴薯和蓮藕中參與了馬鈴薯塊莖膨大以及淀粉含量積累的調(diào)控[19]。因此，本課題組推測(cè)與AtCOL5和NnCOL5近緣的CwCOL5可能參與荸薺球莖的發(fā)育調(diào)控。

CwCOL5在荸薺不同組織和球莖不同發(fā)育階段均有明顯表達(dá)，CwCOL5在荸薺葉片和荸薺皮中表達(dá)量較高，在荸薺果肉中的表達(dá)量相對(duì)較低。馬鈴薯COL基因在葉片中的表達(dá)高于其他組織[32]，水稻、大豆、楊樹(shù)中的COL基因作用的主要部位也是在葉片[30,33-34]，本研究發(fā)現(xiàn)CwCOL5的表達(dá)模式與上述結(jié)果大體一致。在球莖發(fā)育過(guò)程中CwCOL5在球莖膨大前期表達(dá)量快速上升，而在膨大后期顯著下調(diào)，這一表達(dá)模式與馬鈴薯StCOL、蓮藕NnCOL5相似[19,31]。基于上述結(jié)果，推測(cè)CwCOL5可能參與了荸薺球莖膨大過(guò)程，但球莖膨大過(guò)程存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，CwCOL5與CO-FT途徑其它關(guān)鍵基因如FKF1、CDF1和SP6A等的相互影響有待進(jìn)一步研究。