吳麗芳，魏曉梅，蔡 建

曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院/云南省高校特色果酒技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用工程研究中心，云南曲靖 655011

近年來(lái)，極端氣候頻繁出現(xiàn)，植物為了能夠適應(yīng)賴以生存的環(huán)境，從形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、細(xì)胞和分子水平等層面均會(huì)表現(xiàn)相應(yīng)的響應(yīng)?；钚匝酰≧OS）產(chǎn)生和積累是植物逆境脅迫下最初反應(yīng)[1]，正常環(huán)境下，植物細(xì)胞ROS產(chǎn)生與清除可通過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)維持在相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡水平，當(dāng)受脅迫時(shí)，這種平衡會(huì)遭到破壞而使ROS積累導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而使生物膜造成損害，光合受阻，呼吸作用異常，酶系統(tǒng)失活等[2-3]。為有效控制ROS過(guò)度積累引起的氧化應(yīng)激，植物已進(jìn)化出酶促系統(tǒng)（SOD、POD、CAT、APX、DHAR、MDHAR、GPX、GR、GOPX等）和非酶促系統(tǒng)（抗壞血酸、脯氨酸、谷胱甘肽等）以清除ROS[4-5]，有研究表示，適度干旱脅迫下，白刺花[6-7]、胡枝子[8]、樟樹[9]、油茶[10]等植物超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）出現(xiàn)上升趨勢(shì)，表現(xiàn)相互協(xié)調(diào)的作用方式；當(dāng)干旱加重，保護(hù)酶系統(tǒng)反而下降。然而，不同學(xué)者對(duì)不同的植物干旱脅迫下酶活性變化有一些差異，蒙古蕕[11]持續(xù)升高，而菜豆樹和鋸葉竹節(jié)樹[12]反而下降。脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白為干旱脅迫下植物細(xì)胞積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其可能作用機(jī)理是維持植物細(xì)胞較低的滲透勢(shì)，保持水分，以提高抗逆性[12]。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是膜質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，受SOD酶活性大小所調(diào)節(jié)[13]，含量高低反映了膜系統(tǒng)的受損程度，干旱脅迫下，增幅越大，抗旱性越差，反之，則抗旱性越強(qiáng)，其可作為衡量植物耐旱性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)參數(shù)[14]。

白刺花（Sophora davidii）又名鐵馬胡燒、狼牙刺、苦刺花，為豆科蝶形花亞科苦參屬（APGⅣ分類）灌木，在當(dāng)代其主要分布區(qū)位于云南、廣西、貴州、西藏、四川等地[15]。以往對(duì)白刺花抗旱性有許多報(bào)道，王海珍等[16]、王紅梅等[17]、李芳蘭等[18]、田方等[19]從形態(tài)特征、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、保護(hù)酶系等研究認(rèn)為，干旱脅迫時(shí)，白刺花保護(hù)酶系能相互配合協(xié)同作用，以降低膜脂過(guò)氧化，維持細(xì)胞膜完整性，具有較強(qiáng)的抗旱性。然而，以往的研究多集中于利用PEG模擬干旱環(huán)境對(duì)種子萌發(fā)或盆栽實(shí)驗(yàn)人工控水模擬水分脅迫得到的結(jié)果，對(duì)土壤自然缺水的連續(xù)觀測(cè)研究仍相對(duì)缺乏，研究土壤自然干旱的生理生化特征更接近于田間植物干旱的真實(shí)響應(yīng)。植物的抗逆性往往有協(xié)同效應(yīng)，劉海卿等[20]對(duì)白菜型冬油菜的研究中得出抗寒性強(qiáng)的品種一般抗旱性也比較強(qiáng)。董緒兵等[21]對(duì)黃瓜的研究中也得出類似結(jié)論，干旱預(yù)處理可誘導(dǎo)黃瓜幼苗對(duì)低溫脅迫的交叉適應(yīng)性。植物的“交叉適應(yīng)”在玉米[22]、葡萄[23]等已有報(bào)道，而有關(guān)白刺花干旱-低溫交叉適應(yīng)的研究尚未見報(bào)道?；诖耍狙芯坎捎门柙栽囼?yàn)法，研究白刺花實(shí)生苗自然干旱脅迫處理再進(jìn)行低溫處理后幼苗葉片相對(duì)含水量（relative water content，RWC）、MDA含量、脯氨酸（proline，Pro）含量及抗氧化酶系變化，旨在探討干旱-低溫協(xié)同響應(yīng)的生理機(jī)制，為抗旱與抗寒性的綜合評(píng)價(jià)提供可借鑒的方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

種子采集：白刺花種子于2020年11月采集于云南省曲靖市沾益縣西平鎮(zhèn)九孔橋陽(yáng)坡面，連殼采集帶回實(shí)驗(yàn)室脫殼，挑選無(wú)蟲眼飽滿的種子于2021年5—12月種植于曲靖師范學(xué)院玻璃溫室內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將白刺花種子劃破種皮經(jīng)次氯酸鈉消毒后播于直徑25 cm的黑色塑料育苗袋中，每袋裝腐葉土和紅壤土各3 kg，再伴微生物肥0.5 g，每袋定植2株，播后每2 d澆水1次。

1.2.2 干旱脅迫處理 待實(shí)生苗生長(zhǎng)90 d后采用自然干旱控水處理。在干旱試驗(yàn)前澆透水，盆土滲出水即為達(dá)到飽和。停灌后2、4、6、8、10、12、15 d對(duì)植株進(jìn)行采樣，常規(guī)管理為對(duì)照。采用隨機(jī)采樣的方法，分別測(cè)定葉片相對(duì)含水量、葉綠素、Pro、MDA、SOD、POD、CAT活性，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次。試驗(yàn)中，2~4 d為脅迫初期，6~10 d為脅迫中期，12~15 d為脅迫后期。

1.2.3 耐寒性脅迫處理 將經(jīng)過(guò)自然干旱處理過(guò)的植株復(fù)水后常規(guī)管理，再生長(zhǎng)90 d后采用人工控溫方法進(jìn)行低溫脅迫，設(shè)置5 ℃低溫于人工氣候箱培養(yǎng)，光周期16 h/8 h，光照強(qiáng)度為1500 lx，于處理5、10、20、30 d進(jìn)行采樣，以未經(jīng)干旱和低溫處理為對(duì)照，分別測(cè)定Pro、MDA、SOD、POD、CAT活性。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定 按照鄒琦[24]和李合生[25]植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)方法測(cè)定生理生化指標(biāo)，磺基水楊酸茚三酮比色法測(cè)定Pro含量；氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定SOD活性；愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定POD活性；紫外吸收法測(cè)定CAT活性；硫代巴比妥酸比色法測(cè)定MDA含量。紫外可見分光光度計(jì)比色法測(cè)定葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Car）的吸收值并計(jì)算Chla、Chlb、Car和Chla/Chlb、Chl/Car含量。稱重法測(cè)定葉片含水量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下白刺花幼苗生長(zhǎng)及葉片含水量變化

白刺花幼苗具有一定的干旱耐受能力，脅迫初期（2~4 d）幼苗長(zhǎng)勢(shì)良好，脅迫中期（6~10 d）部分葉片卷曲，脅迫后期（12~15 d）大部分植株葉片內(nèi)卷，基部葉片變黃下垂或脫落，葉尖生長(zhǎng)點(diǎn)枯萎，當(dāng)復(fù)水2 d后，植株又能恢復(fù)生長(zhǎng)。干旱缺水下白刺花葉片相對(duì)含水量變化見圖1，隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片相對(duì)含水量顯著減小，對(duì)照組（CK）與處理2 d內(nèi)無(wú)顯著差異，當(dāng)脅迫15 d時(shí)，葉片相對(duì)含水量最低，僅為25.83%。

2.2 干旱脅迫下白刺花葉片光合色素含量變化

光合色素是反映植物光合作用能力及營(yíng)養(yǎng)作用的重要指標(biāo)之一，表1為干旱脅迫下白刺花葉片光合色素Chla、Chlb、Car、Chl(a+b)、Chla/b、Chl/Car的變化，Chla、Chlb、Car、Chl(a+b)隨干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)先增后降變化，Chla出現(xiàn)拐點(diǎn)的時(shí)間在10 d，而Chlb在8 d，Car在6 d，Chla/b和Chl/Car出現(xiàn)增-減-增變化。

2.3 干旱脅迫對(duì)白刺花葉片抗氧化保護(hù)酶系的影響

從圖2A可以看出，隨著干旱時(shí)間延長(zhǎng)，白刺花葉片SOD活性呈先升后降趨勢(shì)，處理2~8 d內(nèi)，與CK比較，具有顯著性差異，其中8 d時(shí)SOD活性最高，達(dá)458.85 U/g，比對(duì)照增加142.53%；之后10~15 d緩慢下降，比對(duì)照分別增加107.49%、66.55%、53.72%。

圖2 干旱脅迫下白刺花葉片相關(guān)生理指標(biāo)變化Fig. 2 Changes of related physiological indexes of S. davidii leaves in different drought stress period

從圖2B可以看出，隨著干旱時(shí)間延長(zhǎng)，白刺花葉片POD活性變化與SOD活性變化相似，均呈先升后降的變化趨勢(shì)，2~8 d內(nèi)具有顯著性差異，8 d時(shí)POD活性最高，達(dá)5.30 U/g，比對(duì)照增加68.25%；10~15 d緩慢下降。

從圖2C可以看出，隨著干旱時(shí)間延長(zhǎng)，白刺花葉片CAT活性變化與POD活性、SOD活性變化相似，均呈先升后降的變化趨勢(shì)，各處理間具有顯著性差異，但其拐點(diǎn)出現(xiàn)在12 d，其活性高達(dá)105.29 U/g，比對(duì)照增加733.65%。

3種保護(hù)酶防御系統(tǒng)均表現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，它們協(xié)同清除體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基，減少逆境傷害，提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。SOD和POD活性拐點(diǎn)出現(xiàn)在8 d，而CAT稍滯后，在12 d出現(xiàn)拐點(diǎn)，且CAT活性變化比SOD和POD活性起伏大，推測(cè)3種保護(hù)酶防御系統(tǒng)協(xié)同作用，維持活性氧在相對(duì)低的變化范圍，以維持細(xì)胞膜的完整性。

2.4 干旱脅迫對(duì)白刺花葉片膜傷害程度的影響

從圖2D可以看出，隨著干旱時(shí)間延長(zhǎng)，白刺花葉片MDA含量具有顯著差異。隨著干旱脅迫程度的增強(qiáng)，MDA含量呈緩慢上升的趨勢(shì)，15 d時(shí)達(dá)到高峰，峰值為6.20 mmol/g，比對(duì)照增加108.75%。

2.5 干旱脅迫對(duì)白刺花葉片滲透調(diào)節(jié)的影響

Pro是植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，對(duì)原生質(zhì)具有保護(hù)與保水作用，干旱脅迫時(shí)能夠防止細(xì)胞體內(nèi)水分散失。如圖2E所示，Pro含量的變化呈先增后降的變化趨勢(shì)，脅迫初期上升緩慢，脅迫中期變化明顯。與CK相比，2~12 d具有顯著差異，10 d出現(xiàn)峰值，高達(dá)459.67 mg/g，比對(duì)照增加226.45%，之后緩慢下降。

2.6 低溫脅迫下白刺花葉片光合色素含量變化

低溫脅迫下白刺花葉片光合色素含量的變化與干旱脅迫不同（表2），隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Chla、Chlb和Chl(a+b)呈下降變化，Chla/b變化相反，呈上升趨勢(shì)，而Car呈先升后降趨勢(shì)。反映了低溫脅迫會(huì)降低植物的光合作用。

表2 低溫脅迫下白刺花葉片光合色素含量變化Tab. 2 Changes of photosynthetic pigment content of S. davidii leaves in different cold stress period mg/g

2.7 低溫脅迫對(duì)白刺花葉片抗氧化保護(hù)酶系的影響

從圖3A可以看出，隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，白刺花葉片SOD活性呈先升后降趨勢(shì)，各處理間具有顯著性差異，其中10 d時(shí)，SOD活性最高，達(dá)431.72 U/g。與干旱脅迫相比較，脅迫初期至中期（2~10 d）SOD活性上升較快，說(shuō)明經(jīng)干旱處理后再經(jīng)低溫脅迫，短期內(nèi)能夠積累較多的SOD，反映出對(duì)低溫較高耐性。

圖3 低溫脅迫對(duì)白刺花葉片相關(guān)生理指標(biāo)變化Fig. 3 Changes of related physiological indexes of S. davidii leaves in different cold stress period

從圖3B可以看出，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，白刺花葉片POD活性變化與SOD活性的變化相似，均呈先升后降的變化趨勢(shì)，除10~20 d無(wú)顯著差異外，其余時(shí)間下均具有顯著性差異，20 d時(shí)，POD活性最高，達(dá)5.70 U/g，與干旱脅迫相比較，脅迫初期（2~5 d）POD活性上升相對(duì)較快。

從圖3C可以看出，隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，白刺花葉片CAT活性變化與POD活性、SOD活性的變化相似，均呈先升后降的變化趨勢(shì)，各處理間具有顯著性差異，但其拐點(diǎn)出現(xiàn)在20 d，其活性高達(dá)129.4.29 U/g。與干旱脅迫相比較，脅迫初期變化較慢，10 d以后，積累較多。

低溫脅迫下3種保護(hù)酶防御系統(tǒng)變化與干旱脅迫相似，均表現(xiàn)先升后降變化，從脅迫初期中看出，低溫脅迫下SOD、POD和CAT活性物質(zhì)的上升比干旱脅迫快，說(shuō)明適當(dāng)干旱脅迫能夠提高白刺花的耐寒性。

2.8 低溫脅迫對(duì)白刺花葉片膜傷害程度的影響

MDA含量的高低可直接反映逆境脅迫下細(xì)胞膜過(guò)氧化的程度，由圖3D可以看出，隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，MDA含量呈緩慢上升的趨勢(shì)，且各脅迫時(shí)間下白刺花葉片MDA含量差異顯著，30 d達(dá)到頂峰，為7.01 mmol/g，比對(duì)照增加了126.13%。

2.9 低溫脅迫對(duì)白刺花葉片滲透調(diào)節(jié)的影響

Pro為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)和冰點(diǎn)，提高植物抗寒性。如圖3E所示，不同處理時(shí)間內(nèi)Pro含量的變化呈上升趨勢(shì)，各處理時(shí)間內(nèi)Pro含量具有顯著性差異。脅迫初期上升緩慢，脅迫中期至后期變化顯著。與對(duì)照相比，30 d時(shí)，增加了208.40%。

3 討論

植物在干旱脅迫時(shí)，外部葉片最初明顯表現(xiàn)失水萎蔫，相對(duì)含水量降低。白刺花實(shí)生苗生長(zhǎng)90 d進(jìn)行自然斷水后，處理早期無(wú)明顯變化，后期基部葉片脫落或變黃，葉尖下垂，葉片卷曲，復(fù)水2 d后能恢復(fù)生長(zhǎng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。高溫干旱與低溫冷害往往相伴存在，白刺花成熟植株為落葉灌木，而幼苗期冬季不落葉，為常綠植株，其葉片結(jié)構(gòu)及代謝生理對(duì)冬季低溫的適應(yīng)能力必發(fā)生較大變化以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)來(lái)支持正常的生長(zhǎng)發(fā)育?？寡趸赶翟谥参锬婢诚缕浞烙趸{迫傷害方面則發(fā)揮著重要作用，為適應(yīng)環(huán)境避免自身傷害，植物主動(dòng)或被動(dòng)調(diào)動(dòng)抗氧化酶系（SOD、POD、CAT）或非抗氧化酶系，它們之間以互相協(xié)調(diào)的作用方式共同清除活性氧和氧自由基，降低膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的MDA，減緩其傷害從而提高抗耐性[6]。在抗氧化酶中，SOD主要是把O2.-轉(zhuǎn)換成H2O2和O2，然后H2O2被POD和CAT清除[26]。因此，多數(shù)研究認(rèn)為，干旱脅迫初期，SOD、POD、CAT一般呈上升趨勢(shì)，隨著脅迫增強(qiáng)，超出其忍耐范圍，則會(huì)下降[6-10]。本研究也得出相一致的結(jié)論，干旱脅迫下白刺花幼苗葉片SOD、POD、CAT呈先升后降變化，SOD和POD干旱脅迫8 d時(shí)達(dá)到458.85 U/g和5.30 U/g峰值，而后開始下降；而CAT在脅迫初期（2 d時(shí)）與對(duì)照比較，無(wú)顯著差異，呈緩慢上升變化，12 d出現(xiàn)峰值，之后下降，3種酶出現(xiàn)高峰時(shí)間有差異，這說(shuō)明3種酶對(duì)不同干旱脅迫時(shí)期的敏感性不同，同時(shí)也反映出其在清除活性氧的作用途徑及功能上具有差異性，但它們之間為相互協(xié)調(diào)的作用方式[27]。干旱處理可誘導(dǎo)植物幼苗對(duì)低溫的抗性已有諸多報(bào)道，梁小紅等[28]對(duì)多年生黑麥草的干旱-低溫交叉適應(yīng)研究得出，中度干旱后可使低溫下的葉片相對(duì)含水量、葉綠素含量降幅減小，而脯氨酸和抗氧化酶活性增加。徐義群等[29]對(duì)茶樹的研究中也得出，經(jīng)PEG-6000預(yù)處理的茶苗低溫脅迫下，葉片中抗氧化酶活性、滲透物質(zhì)積累明顯增加。本研究中，干旱脅迫后再進(jìn)行低溫處理，白刺花葉片SOD、POD、CAT三種抗氧化酶與干旱脅迫時(shí)變化相似，均表現(xiàn)先升后降。與干旱脅迫相比較，脅迫初期至中期（2~10 d）SOD活性上升較快，10 d達(dá)到高峰。POD活性脅迫初期（2~5 d）上升相對(duì)較快，20 d高達(dá)5.70 U/g，CAT脅迫初期變化較慢，10 d以后明顯上升，20 d其活性高達(dá)129.4.29 U/g。

MDA是膜脂過(guò)氧化的終產(chǎn)物，含量的高低反映出細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用強(qiáng)弱和膜脂受破壞的程度。本研究中，隨著干旱脅迫增強(qiáng)，MDA含量緩慢上升，15 d達(dá)到高峰，為6.20 mmol/g，比對(duì)照增加108.75%。干旱-低溫脅迫下，脅迫初期（2 d內(nèi)），與對(duì)照比較無(wú)明顯差異，隨著脅迫時(shí)間增長(zhǎng)，MDA含量緩慢上升，30 d達(dá)到頂峰，為7.01 mmol/g，比對(duì)照增加126.13%。表明在長(zhǎng)時(shí)間脅迫下，植物的抗氧化酶系統(tǒng)保護(hù)能力減弱，加重細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化程度，致使MDA含量增加。

植物受逆境脅迫時(shí)，除了保護(hù)酶系統(tǒng)作為清除氧自由基和活性氧為保護(hù)屏障外，植物體內(nèi)也會(huì)主動(dòng)積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸和可溶性糖等來(lái)提高對(duì)細(xì)胞的保水和持水能力以對(duì)生物膜起保護(hù)作用[30]。本研究中，干旱脅迫下，Pro含量呈先增后降趨勢(shì)，脅迫初期上升緩慢，脅迫中期變化明顯，10 d達(dá)到高峰，為459.67 mg/g，之后緩慢下降。干旱-低溫脅迫下，各處理時(shí)間內(nèi)具有顯著差異，呈上升趨勢(shì)，30 d達(dá)到538.5 mg/g，表明白刺花通過(guò)積累脯氨酸提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，提高抗寒性，這與其他許多研究結(jié)果一致[21,28]。但脯氨酸在植物抗旱、耐寒性中的作用還存在爭(zhēng)議，在對(duì)擬南芥[31]、大麗花[32]等證實(shí)脯氨酸與植物的抗性能力成正比，而李燕等[33]對(duì)皂角干旱脅迫研究和WANNER等[34]對(duì)擬南芥抗冷性研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸含量的升高對(duì)抗性的提高沒有直接作用，可能是代謝上的被動(dòng)表現(xiàn)或生理機(jī)能紊亂，而非適應(yīng)性反應(yīng)。因此，脯氨酸作為抗旱生理指標(biāo)的調(diào)控機(jī)理仍需進(jìn)一步求證。