駱彩霞，張 涵,，劉樟揚(yáng)，趙鋼軍，喻 敏，劉敏敏**，吳海濱,3**

1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528225；2. 廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州 510640；3. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510000

絲瓜為葫蘆科（Cucurbitaceae）絲瓜屬（Luffaspp.）一年生攀援性草本植物，共有9個(gè)種，栽培種為有棱絲瓜（L. acutangulaRoxb.）和普通絲瓜（Luffa. cylindricaRoem.）[1]。絲瓜果實(shí)富含賴氨酸、苯丙氨酸等人體必需氨基酸、維生素B1/B2/C等抗氧化物質(zhì)，是一種重要的藥食兼用的多功能蔬菜[2-3]。

植物受到如高溫、干旱、鹽漬、寒冷等非生物脅迫或者病、蟲、機(jī)械損傷等生物脅迫時(shí)，細(xì)胞代謝平衡被破壞，導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS）累積造成氧化脅迫（oxidative stress），使膜損傷、蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷等，嚴(yán)重?fù)p害生物系統(tǒng)的穩(wěn)定性[4-5]。植物細(xì)胞通過(guò)酶促活性氧清除系統(tǒng)和非酶活性氧清除系統(tǒng)清除或者降低ROS含量[5-6]。過(guò)氧化物酶（peroxidase, POD）可以還原植物細(xì)胞體內(nèi)的ROS，生成H2O和O2，是植物酶促活性氧清除系統(tǒng)重要的組成部分[7-9]。

在多個(gè)物種中已經(jīng)鑒定出POD家族成員，包括擬南芥[10]，水稻[11]、大豆[12]、茶樹[13-14]、蘋果[15]等。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥過(guò)氧化物酶RCI3受冷脅迫誘導(dǎo)，正調(diào)節(jié)擬南芥耐滲透脅迫和鹽脅迫[16]。大豆中23個(gè)POD家族基因在耐旱系和干旱敏感系間顯著差異表達(dá)，其中GsPOD40通過(guò)增強(qiáng)干旱脅迫下大豆的光合作用和抗氧化酶活性，從而減輕ROS誘導(dǎo)的氧化損傷，增強(qiáng)大豆的耐旱性[12]。蘋果中，大部分POD基因受ABA、PEG、NaCl脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其中超表達(dá)MdPOD15，可緩解非生物脅迫對(duì)蘋果愈傷組織的損傷[15]。朱海生等[17]利用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）方法擴(kuò)增了1個(gè)絲瓜POD基因，并表示其可能與絲瓜果肉褐化有關(guān)。

然而，到目前為止，從基因組層面鑒定絲瓜POD家族基因，及其對(duì)鹽脅迫響應(yīng)研究鮮有報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定絲瓜POD家族成員，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化、順式作用元件及其在鹽脅迫下表達(dá)模式分析，為探究POD基因家族調(diào)控絲瓜鹽脅迫時(shí)的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試絲瓜品種為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所培育的高代自交系S1174。

1.2 方法

1.2.1 絲瓜POD家族成員鑒定 從Pfam（http://pfam.xfam.org/）下載POD家族的保守結(jié)構(gòu)域PF00141，利用TBtools[18]檢索本課題組裝的有棱絲瓜基因組（未發(fā)表）的蛋白序列，得到絲瓜POD家族成員的候選序列。為保證候選序列的準(zhǔn)確性，在NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）手動(dòng)檢索，去除不含有POD家族保守域的序列。利用ProtProm（http://web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)POD家族成員的分子量、等電點(diǎn)和親水性等理化性質(zhì)。

1.2.2 POD家族成員染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化、基序、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件分析 使用在線軟件MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）進(jìn)行染色體定位可視化分析。利用MEGA 7.0軟件的鄰接法構(gòu)建絲瓜和擬南芥POD蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹（Bootstrap=1000）。利用TBtools軟件[18]進(jìn)行染色體共線性分析。利用在線軟件MEME Suite（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）進(jìn)行氨基酸序列基序分析。使用在線軟件GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析絲瓜POD家族成員的基因結(jié)構(gòu)。使用在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant care/html/）進(jìn)行基因啟動(dòng)子的順式元件分析。

1.2.3 NaCl處理 挑選飽滿種子，催芽后，將露白種子播種于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2周后，分別進(jìn)行200、500 mmol/L NaCl脅迫處理，對(duì)照加等量清水，每個(gè)處理8株，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。脅迫處理7 d后，取葉片，快速用ddH2O清洗2遍，液氮速凍，存入超低溫冰箱備用。

1.2.4 POD活性測(cè)定 利用POD活性測(cè)定試劑盒（索萊寶，北京）測(cè)定絲瓜葉片POD活性。主要步驟如下：稱取液氮研磨的粉末樣品0.1 g，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，離心取上清。于EP管中按次序分別加入試劑一120 μL、試劑二30 μL、試劑三30 μL、蒸餾水60 μL、樣本5 μL，立即混勻并計(jì)時(shí)，取200 μL于酶標(biāo)板中，記錄470 nm下30 s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和1 min 30 s時(shí)的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算△A=A2-A1。計(jì)算POD活性：POD（U/g）=9800×△A/W，W：樣品質(zhì)量。

1.2.5 RNA提取及表達(dá)分析 使用Primer Premier 5在基因非保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物。使用RNA提取試劑盒（全式金，北京）提取樣品的總RNA，使用TransScript?II Green Two-Step qRT-PCR SuperMix（全式金，北京）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL：2 μL cDNA，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，10 μL 2×prefectStart Green qPCR SuperMix，7.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次；3次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的表達(dá)量。對(duì)差異表達(dá)基因在OmicShare平臺(tái)（https://www.omicshare.com/tools/）進(jìn)行表達(dá)趨勢(shì)分析，設(shè)定模塊數(shù)量為20，P為0.01，獲得顯著性和非顯著性基因表達(dá)模式。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲瓜POD基因家族成員鑒定及其蛋白的理化性質(zhì)分析

通過(guò)TBtools比對(duì)篩選，結(jié)合CDD工具檢測(cè)保守結(jié)構(gòu)域，最終從絲瓜中鑒定出94個(gè)POD家族基因。最長(zhǎng)的POD蛋白（Lac05g017090）含有688個(gè)氨基酸殘基，最短的（Lac05g003440）含有89個(gè)氨基酸殘基，平均為309個(gè)；分子質(zhì)量最大為75 617.64（Lac05g017090），最小為10 276.5（Lac 05g003440）；理論等電點(diǎn)（pI）介于4.58（Lac02g 012390）~10.34（Lac00g002910）之間。其中pI>7的POD蛋白有57個(gè)，達(dá)60.64%，表明絲瓜POD蛋白家族大部分富含堿性氨基酸；其中82個(gè)蛋白具有親水性，12個(gè)蛋白不具有親水性（表1）。94個(gè)POD家族成員不均勻地分布在絲瓜13條染色體，其中，7號(hào)染色體分布的最多，為20個(gè)；12號(hào)最少，為1個(gè)（圖1）。

圖1 絲瓜4、7、12號(hào)染色體上的POD家族成員Fig. 1 POD family members on chromosome 4, 7 and 12

表1 絲瓜POD基因家族成員信息Tab. 1 The POD gene family identified from luffa genome

2.2 POD家族成員進(jìn)化分析

利用MEGA 7軟件對(duì)94個(gè)絲瓜POD家族成員和73個(gè)擬南芥POD家族成員的氨基序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。2個(gè)物種的POD家族成員分成了3個(gè)類群Group I、Group Ⅱ、Group Ⅲ，其中Group I只有1個(gè)POD蛋白家族成員（Lac10g 028260），Group Ⅲ成員最多，包含6個(gè)亞組，共161個(gè)成員。Group Ⅲ-A全部為擬南芥家族成員，Group Ⅲ-F的成員最多（45個(gè)），包括30個(gè)絲瓜、15個(gè)擬南芥POD家族成員。

圖2 絲瓜和擬南芥POD家族成員進(jìn)化分析Fig. 2 Evolution analysis of POD family members in Luffa and Arabidopsis

絲瓜和擬南芥的POD家族基因之間的共線性分析結(jié)果顯示（圖3），2個(gè)物種之間有12對(duì)共線性基因，絲瓜中有33個(gè)POD家族基因與擬南芥的37個(gè)POD家族基因存在共線性關(guān)系。其中，AT1G24110基因在絲瓜中有4個(gè)共線性基因Lac03g015670、Lac06g003720、Lac09g002650、Lac09g018070。而AT1G05240、AT1G30870、AT2G 18140、AT2G37130、AT3G21770、AT3G50990、AT4G35000、AT4G36430、AT5G58390、AT5G66390在絲瓜中分別有2個(gè)共線性基因。Lac04g020260和Lac11g009150基因在擬南芥中分別有4個(gè)共線性基因AT2G18140、AT3G50990、AT4G36430、AT5G 66390和AT2G18140、AT3G50990、AT4G36430、AT5G66390。以上結(jié)果表明絲瓜中POD家族基因發(fā)生了擴(kuò)張。

圖3 絲瓜和擬南芥POD家族成員共線性分析Fig. 3 Collinearity analysis of orthologous POD gene pairs between Luffa and Arabidopsis

2.3 絲瓜POD家族基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

利用GSDS在線軟件對(duì)POD家族成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，POD基因家族具有相似的基因結(jié)構(gòu)，外顯子數(shù)量介于1~14個(gè)之間，大多數(shù)含有3個(gè)或者4個(gè)外顯子。

蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明，絲瓜POD家族成員都含有plant peroxidases保守結(jié)構(gòu)域，其中Lac01g005270和Lac05g017090含有2個(gè)plant peroxidases保守結(jié)構(gòu)域（圖4）。保守基序分析表明，不同的絲瓜POD家族成員含有的基序數(shù)量不同，其中Lac09g020210只含有1個(gè)基序，Lac01g005270和Lac05g017090含有20個(gè)基序（圖5）。

圖4 絲瓜POD家族成員保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 4 Analysis of conserved domains of POD family members in Luffa

圖5 絲瓜POD家族成員保守基序分析Fig. 5 Analysis of motifs of POD family members in Luffa

2.4 絲瓜POD家族成員的順式作用元件分析

對(duì)絲瓜POD家族成員啟動(dòng)子序列順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，POD基因普遍存在與植物激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式元件（圖6）。植物激素響應(yīng)元件包括脫落酸響應(yīng)元件（ABRE，236個(gè)），生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AuxRE，66個(gè)），赤霉素響應(yīng)元件（GARE，82個(gè)），乙烯響應(yīng)元件（ERE，154個(gè)），水楊酸響應(yīng)元件（SARE，45個(gè)），茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（MeJRE，264個(gè)）。脅迫響應(yīng)元件包括低溫響應(yīng)元件（LTR，53個(gè)），低氧脅迫響應(yīng)元件（ARE，264個(gè)），光響應(yīng)元件（LRE，1054個(gè)），干旱響應(yīng)元件（104個(gè)）包括參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)（MBS）和脫水反應(yīng)元件（DRE），防御和脅迫響應(yīng)元件（DSRE，56個(gè)）。

圖6 絲瓜POD家族成員啟動(dòng)子順式元件分析Fig. 6 Analysis of cis-elements in promoters of POD family members in Luffa

2.5 鹽脅迫處理后絲瓜葉片POD活性升高

為了研究POD在絲瓜幼苗受鹽脅迫時(shí)的作用，本研究測(cè)定了鹽脅迫后絲瓜葉片中POD活性的變化。結(jié)果表明，在受到鹽脅迫后，絲瓜葉片中POD活性升高，隨著鹽處理濃度的增加，POD活性增加，達(dá)到極顯著水平（圖7）。

圖7 鹽脅迫后絲瓜葉片POD活性Fig. 7 POD activity of Luffa leaves after salt stress

2.6 絲瓜POD家族成員鹽脅迫表達(dá)分析

采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)絲瓜POD家族成員在不同濃度鹽脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在200、500 mmol/L NaCl溶液處理下，56個(gè)基因受NaCl脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，包括6個(gè)基因（Lac07 g019770、Lac08g017630、Lac08g017630、Lac09g 021570、Lac10g006770、Lac11g002020）在200、500 mmol/L脅迫處理下極度上調(diào)表達(dá)（>100倍），另外有14個(gè)基因在絲瓜葉片中不表達(dá)（圖8）。對(duì)80個(gè)檢測(cè)到的基因進(jìn)行表達(dá)趨勢(shì)分析，獲得8種基因表達(dá)趨勢(shì)模式，有2種顯著的基因表達(dá)趨勢(shì)模式（P<0.01）（圖9）。其中profile7模式中，17個(gè)基因在200、500 mmol/L脅迫處理下表達(dá)量依次升高，profile6模式中，18個(gè)基因受鹽脅迫后表達(dá)量升高，且在200、500 mmol/L脅迫處理下表達(dá)量相似（圖9）。另外，11個(gè)基因只在500 mmol/L脅迫處理時(shí)表達(dá)量上升（profile4），10個(gè)基因只在200 mmol/L脅迫處理下表達(dá)量上升（profile5），8個(gè)基因在200 mmol/L脅迫處理下無(wú)變化，而在500 mmol/L脅迫處理下表達(dá)量下降（profile3）。

圖8 絲瓜POD家族成員鹽脅迫表達(dá)分析Fig. 8 Gene expression levels of POD family members after salt stress in Luffa

3 討論

POD是一種對(duì)環(huán)境條件十分敏感的氧化酶類，其主要作用是清除氧代謝中產(chǎn)生的活性氧，是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一[8-9]。植物在受到逆境脅迫時(shí)，導(dǎo)致ROS累積，隨后過(guò)氧化物酶活性升高，增強(qiáng)植物清除活性氧的能力，降低ROS對(duì)細(xì)胞功能的傷害[5,19]。油棕幼苗經(jīng)過(guò)緩慢低溫脅迫可以提高POD活性，進(jìn)而提高油棕幼苗抗寒性[20]。在抗病木薯種質(zhì)受到細(xì)菌性萎蔫病侵染后，POD活性顯著高于感病品種，POD與多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性可作為木薯抗病性鑒定的輔助指標(biāo)[21]。本研究中，絲瓜受到鹽脅迫后，POD活性增強(qiáng)，并且隨NaCl濃度升高而活性增強(qiáng)，其可能參與絲瓜鹽脅迫下活性氧的清除，降低活性氧對(duì)細(xì)胞的傷害，增強(qiáng)絲瓜對(duì)鹽脅迫的抵抗能力。本研究進(jìn)一步從絲瓜基因組層面，鑒定到94個(gè)POD家族成員，全面分析了POD家族成員的理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育、染色體定位、基因共線性、基因結(jié)構(gòu)、順式元件，以及對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)，為進(jìn)一步研究POD家族成員生物功能奠定基礎(chǔ)。

理化性質(zhì)分析表明，絲瓜POD家族成員大部分為親水性蛋白（82/94）；一半富含酸性氨基酸，一半富含堿性氨基酸，這與茶樹[13]、石榴[22]、大豆[12]研究相似?；蚪Y(jié)構(gòu)和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，所有的絲瓜POD家族成員都含有典型的過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)域，以及大部分成員含有全部的10個(gè)基序（66/94），推測(cè)其可能在維持細(xì)胞內(nèi)ROS平衡起功能，不同的蛋白基序可能決定了其參與不同的調(diào)控途徑，執(zhí)行不同的生物學(xué)功能[23-24]。

基因復(fù)制是基因組進(jìn)化和功能分化的關(guān)鍵動(dòng)力之一[25]。在進(jìn)化歷史過(guò)程中，大多數(shù)高等植物都經(jīng)歷了多倍體化，是植物提高環(huán)境適應(yīng)性的普遍現(xiàn)象[26]。在棉花[27]、二穗短柄草[28]、葡萄[23]中POD家族基因進(jìn)化過(guò)程中，發(fā)生基因串聯(lián)重復(fù)或者片段重復(fù)，是POD家族基因演化的主要驅(qū)動(dòng)力之一。本研究中，在絲瓜7號(hào)染色體上有連續(xù)16個(gè)POD家族基因，5號(hào)染色體上有連續(xù)7個(gè)POD家族基因，表明POD家族基因在絲瓜中存在物種特異性擴(kuò)張?；蚬簿€性分析表明絲瓜和擬南芥物種之間存在12對(duì)共線性基因，其中部分?jǐn)M南芥POD基因在絲瓜中存在多個(gè)同源基因，表明絲瓜POD家族存在串聯(lián)重復(fù)基因或者片段重復(fù)基因。

許多研究表明，植物過(guò)氧化物酶參與植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的各種細(xì)胞過(guò)程，以及植物對(duì)非生物和生物脅迫的響應(yīng)。玉米中根中的膜結(jié)合過(guò)氧化物酶（pmPOX1、pmPOX2a、pmPOX2b和pmPOX3）受茉莉酸甲酯、水楊酸和病原體誘導(dǎo)表達(dá)[29]。葡萄中，30個(gè)POD基因受NaCl、drought、和ABA誘導(dǎo)表達(dá)[29]。蘋果中，超過(guò)94.1%（48/51）POD基因受ABA、PEG、NaCl脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[15]，谷子中POD家族成員受干旱和ABA誘導(dǎo)表達(dá)[30]。通過(guò)對(duì)基因啟動(dòng)子順式作用元件分析表明，絲瓜POD家族成員啟動(dòng)子含有大量的與激素誘導(dǎo)、非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，表明其可能受非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)絲瓜POD家族成員鹽脅迫后基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，56個(gè)基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其中6個(gè)基因極度上調(diào)表達(dá)（>100倍），可能這些基因參與絲瓜受到鹽脅迫后的過(guò)氧化物酶的合成，進(jìn)而參與細(xì)胞ROS的清除。

綜上所述，本研究首次從絲瓜基因組鑒定出94個(gè)絲瓜POD家族成員，并對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、基因定位、基因共線性分析以及鹽脅迫響應(yīng)分析。其中56個(gè)POD基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其可能參與絲瓜對(duì)鹽脅迫響應(yīng)。本研究為更深入研究絲瓜POD基因家族的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。