鄭乾明，王小柯，王紅林，解 璞，付慧敏，陳傳武*

1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院果樹科學研究所，貴州貴陽 550006；2. 廣西桂北特色經(jīng)濟作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用實驗室/廣西特色作物研究院，廣西桂林 541004

可溶性糖組分和含量是決定果實品質(zhì)的最關鍵因子，也是園藝作物育種和改良的重要研究方向。果實積累的可溶性糖主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇等，來自于源器官的光合作用，經(jīng)韌皮部裝載、長距離運輸和卸載，進入果實細胞參與代謝、轉(zhuǎn)運和儲存[1]。這一系列過程涉及糖的多次跨膜運輸，均需要糖轉(zhuǎn)運蛋白（或載體）介導。

植物糖轉(zhuǎn)運蛋白主要包括易化擴散載體超家族（major facilitator superfamily, MFS）的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（sucrose transporter, SUT）和單糖轉(zhuǎn)運蛋白（monosaccharide transporter, MST），以及新型SWEET家族[2]。SUT和MST通常含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，偶聯(lián)質(zhì)子介導糖的跨膜轉(zhuǎn)運[3-4]。2010年CHEN首次使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer, FRET）鑒定了AtSWEET1的葡萄糖轉(zhuǎn)運活性，該蛋白含7個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，依賴細胞內(nèi)外糖濃度梯度而非跨膜質(zhì)子梯度來完成跨膜轉(zhuǎn)運功能[5]。擬南芥SWEET家族的17個成員分為四類，Ⅰ和Ⅱ類均定位于細胞膜，轉(zhuǎn)運葡萄糖等單糖，參與花發(fā)育，種子萌發(fā)，宿主-病原體互作等；Ⅲ類定位于細胞膜，主要轉(zhuǎn)運蔗糖，參與蔗糖的韌皮部裝載，花蜜分泌，花、果實及種子發(fā)育等；IV類定位于液泡膜，轉(zhuǎn)運果糖、葡萄糖和蔗糖，控制果糖積累，調(diào)控耐寒性[6]。

近年來通過同源搜索獲得大量園藝作物的SWEET家族信息，且大量研究表明SWEET影響果實可溶性糖積累，參與果實發(fā)育和成熟。葡萄SWEET家族含有17個成員[7]，VvSWEET10主要在果實轉(zhuǎn)色期表達，參與己糖積累[8]。番茄SWEET家族含有29個成員[9]，SlSWEET7a在綠熟期果實果柄和維管束高表達，推測參與蔗糖的韌皮部裝載和卸載[10]。蘋果SWEET家族的13個成員與果實可溶性糖積累表現(xiàn)較高的相關性[11]，MdSWEET1在番茄中過表達提高果實蔗糖和果糖含量[12]。荔枝SWEET家族含有16個成員，其中8個在果肉（假種皮）中高表達[13]。棗SWEET家族含有19個成員，ZjSWEET2.2定位于細胞膜，與果實己糖積累負相關[14]。

甜橙基因組SWEET家族含有16個成員，其中12個在果實表達，包含在果實高表達的Cs7g02970基因[15]。Cs7g02970基因（命名CitSWEET15）在甜橙果實囊衣和汁胞高表達，與果實可溶性糖積累高度正相關，可能介導蔗糖跨細胞膜轉(zhuǎn)運至質(zhì)外體[16]。然而CitSWEET15的亞細胞定位和糖轉(zhuǎn)運活性尚不清楚，不能明確其生理功能。對此，本研究克隆了CitSWEET15基因的ORF序列，重點分析其蛋白的亞細胞定位和轉(zhuǎn)運活性，探討其在甜橙果實可溶性糖積累過程中的生理功能。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為廣西特色作物研究院種植的甜橙品種暗柳橙（Citrus sinensisOsbeck cv.‘Anliu’），選擇5株處于盛果期且長勢良好的成年結(jié)果樹，采集成熟葉片和盛開的花，以及花后80 d（80DAF）、110 d（110DAF）、140 d（140DAF）、170 d（170DAF）、200 d（200DAF）、230 d（230DAF）果實。樣品置于冰盒帶回實驗室，果實剝?nèi)スと」夂统墒旃麑崳?30 d）種子。所有樣品設置3次生物學重復，樣品液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 在甜橙基因組數(shù)據(jù)庫（http: //citrus.hzau.edu.cn/orange/）查詢Cs7g02970，即CitSWEET15，下載其cDNA和CDS序列。提取甜橙果肉總RNA（Aidlab, RN53），利用PrimeScriptTM 1stStrand cDNA Synthesis試劑盒（TaKaRa, 6110A）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以此為模板進行RT-PCR擴增，擴增引物序列為5′-ATGGCCATAATGTTCGAT-3′/5′-TCAAACAG CAACAGCACA-3′，利用高保真PCR酶擴增試劑（Vazyme Biotech，P515-1）進行擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳和回收，連接至測序載體pMD19-T測序。

1.2.2 序列分析 在甜橙基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI網(wǎng)站使用在線Blastn進行檢索，下載核苷酸序列。使用DNAMAN軟件將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，使用在線軟件ExPASy（https://web.expasy.org/）預測相對分子量和理論等電點，使用在線軟件TMHMM 2.0（https: //services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）預測跨膜結(jié)構(gòu)。使用Clustal W軟件進行氨基酸序列比對，利用MEGA 7.0軟件，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進行1000次重復的Bootstrap值檢驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測 提取成熟葉片、花、種子和果肉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用2×SYBR Green Fast qPCR Mix試劑（Biomarker,RK02001），在熒光定量PCR儀（BIO-RAD, CFX96）檢測基因的表達量。目標基因引物序列：5′-GGGAGTTGCATTTGGCATCT-3′/5′-GCACCGG AGCCAGGTACA-3′，內(nèi)參基因Actin引物序列：5′-CCAAGCAGCATGAAGATCAA-3′/5′-ATCTG CTGGAAGGTGCTGAG-3′。設置3次技術(shù)重復，基因的相對表達量使用2-??CT值計算。

1.2.4 亞細胞定位 以含有CitSWEET15基因CDS的質(zhì)粒為模板，以去除終止密碼子的引物（5′-ACAGCCCAAGCTTGCATGCCTGCAGATGGCCA TAATGTTCGAT-3′/5′-CCTCGCCCTTGCTCACCA TGGATCCAACAGCAACAGCACATCCA-3′），利用高保真2×Phanta?Max Master DNA聚合酶（Vazyme Biotech, P515）進行PCR擴增。經(jīng)PstII和BamHI（NEB）將載體酶切線性化后，使用ClonExpress?II One Step克隆試劑盒（Vazyme Biotech, C112）將擴增產(chǎn)物插入至目標載體16318-hGFP。構(gòu)建的融合表達載體和空載體分別轉(zhuǎn)化擬南芥葉肉原生質(zhì)體，具體操作步驟參考YOO等[17]的方法。

1.2.5 酵母表達載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化 以含有CitSWEET15基因CDS的質(zhì)粒為模板，使用引物（5′-GTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCAT GGCCATAATGTTCGAT-3′/5′-AATTGGGTACCG GGCCCCCCCTCGAGTCAAACAGCAACAGCA CA-3′）進行PCR擴增。使用EcoR I和XhoI（NEB）將載體線性化，利用ClonExpress?II One Step克隆試劑盒（Vazyme Biotech, C112）將擴增產(chǎn)物插入至酵母表達載體pDR196的多克隆位點。經(jīng)測序確認后將CitSWEET15-pDR196、載體pDR196（載體對照）和AtSWEET10-pDR196（陽性對照）分別轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌株W303a（W303-1A）。酵母轉(zhuǎn)化采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，使用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（Coolaber, SK2400），轉(zhuǎn)化后的單克隆進行PCR擴增驗證。

1.2.6 Esculin轉(zhuǎn)運檢測 酵母陽性單克隆使用SC/-ura（2%葡萄糖為碳源）液體培養(yǎng)基30 ℃震蕩過夜，至OD600為0.6~1.0。酵母細胞吸收Esculin和熒光強度檢測方法參考GORA等[18]的方法，略作修改。吸取酵母菌液，加入Esculin溶液（Solarbio, E8230）至終濃度1 mmol/L，30 ℃震蕩培養(yǎng)60 min。離心收集酵母細胞，使用磷酸鹽緩沖液清洗酵母細胞2次，再加入磷酸鹽緩沖液充分重懸。使用多功能酶標儀（Molecular Devices,SpectraMax iD3）檢測Esculin熒光強度，激發(fā)波長為367 nm，發(fā)射波長為454 nm。同時按照1∶2的比例稀釋酵母細胞，使用酶標儀（Thermo Scientific, Multiskan GO）檢測酵母重懸細胞的OD600值。計算每1個OD600值的酵母細胞的熒光強度值，每個基因或?qū)φ盏臄?shù)據(jù)均來自于4個獨立的酵母單克隆。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

經(jīng)RT-PCR擴增和測序表明，CitSWEET15的ORF長度為918 bp，編碼305個氨基酸。預測其等電點為6.29，相對分子量為34.15 kDa，含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域。CitSWEET15與擬南芥SWEET家族AtSWEET15的氨基酸序列一致率為55.5%，與其他16個成員的氨基酸序列一致率為28.5%~49.8%。對21個SWEETs的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CitSWEET15與PuSWEET15[19]、VvSWEET15[7]、LcSWEET15[13]和AtSWEET15為直系同源，并與AtSWEET9~AtSWEET15同屬于SWEET Ⅲ類。

2.2 序列分析

將甜橙CitSWEET15與已有基因組數(shù)據(jù)報道的柑橘類SWEET15基因比較序列差異，結(jié)果見表1。CitSWEET15與柑橘屬的克里曼丁橘和莽山野橘SWEET15基因的核苷酸序列一致率為99.90%，氨基酸序列一致率為100%。與金柑屬的金柑SWEET15基因的核苷酸和氨基酸序列一致率略低，分別為99.13%和98.03%。與柑橘屬的柚、宜昌橙和枸櫞SWEET15基因的核苷酸序列一致率為98.69%~99.02%，氨基酸序列一致率為97.38%~97.70%。

表1 CitSWEET15與其他柑橘類SWEET15基因的序列一致率Tab. 1 Sequence identities between CitSWEET15 and other Citrus SWEET15 genes

前人對SWEET III類成員AtSWEET13蛋白結(jié)構(gòu)解析表明，若干氨基酸殘基對蔗糖識別和轉(zhuǎn)運具有決定性作用[20]。將CitSWEET15及上述柑橘類SWEET15的氨基酸序列共同比對，結(jié)果見圖2。4個特異性識別蔗糖的位點（V/25、S/56、V/146和S/177）與AtSWEET13、AtSWEET15完全一致，3個與蔗糖轉(zhuǎn)運活性相關的位點（W/60、N/77和W/181）也與AtSWEET13、AtSWEET15完全一致，因此推測CitSWEET15和柑橘類SWEET15成員可能均具有蔗糖轉(zhuǎn)運活性。

2.3 基因表達分析

利用qRT-PCR檢測CitSWEET15基因在甜橙葉片、花、種子和果實不同發(fā)育時期果肉中的表達模式，結(jié)果如圖3所示。CitSWEET15基因在種子中表達量較葉片和花中高，在果肉中的表達量隨果實發(fā)育和成熟逐漸增加?；ê?0、110、140 d的果實中表達量較低，此后快速增加，在花后230 d的果實中的表達量達到最高。

圖3 CitSWEET15在甜橙不同組織和果實不同發(fā)育時期的表達模式Fig. 3 Expression patterns of CitSWEET15 among various tissues and fruit developmental stages of sweet orange

2.4 亞細胞定位檢測

為了解CitSWEET15的亞細胞定位，在其C端融合綠色熒光蛋白，瞬時轉(zhuǎn)化擬南芥葉肉原生質(zhì)體。如圖4所示，空載體p35S-GFP的綠色熒光分布于細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核。目標基因載體CitSWEET15-GFP的綠色熒光圍繞原生質(zhì)體外緣分布，與細胞膜被FM4-64染料標識后產(chǎn)生的紅色熒光重合。二者完全融合后產(chǎn)生黃色熒光，說明CitSWEET15定位于細胞膜。

圖4 CitSWEET15蛋白的亞細胞定位Fig. 4 Subcellular localization of CitSWEET15 protein

2.5 轉(zhuǎn)運功能驗證

使用具有熒光的蔗糖類似物Esculin為轉(zhuǎn)運底物，檢測表達CitSWEET15的酵母細胞轉(zhuǎn)運Esculin情況，比較熒光強度明確其轉(zhuǎn)運活性。酵母細胞經(jīng)Esculin孵育后，陽性對照AtSWEET10的熒光強度顯著高于空載體pDR196，強度約為空載體pDR196的1.3倍；CitSWEET15的熒光強度也顯著高于空載體pDR196，強度約為空載體pDR196的2.2倍（圖5）。以上說明CitSWEET15和陽性對照AtSWEET10均具有蔗糖轉(zhuǎn)運活性。

圖5 表達CitSWEET15的酵母細胞轉(zhuǎn)運蔗糖類似物Esculin檢測Fig. 5 Transportation test of sucrose analog Esculin by yeast cells expressing CitSWEET15

3 討論

近年來關于VvSWEET10[8]、ZjSWEET2.2[14]、PbSWEET15[19]、SlSWEET7a[10]和SlSWEET15[21]的研究表明，SWEET家族對果實可溶性糖積累具有重要作用。此前已分離甜橙SWEET家族，根據(jù)其表達模式篩選出若干參與果實可溶性糖積累的候選基因[15]。本研究選取在甜橙成熟果實高表達的CitSWEET15深入研究，其在柑橘類不同物種中的核苷酸和氨基酸序列一致性較高，且識別蔗糖的關鍵氨基酸位點與AtSWEET13等完全一致[20]。因此推測包括CitSWEET15在內(nèi)的SWEET15類基因在柑橘類物種中序列高度保守，可能都具有蔗糖轉(zhuǎn)運活性。

離體表達體系是檢測植物SWEET15類成員蔗糖轉(zhuǎn)運活性的有效方法，如通過HEK293T細胞表達結(jié)合FRET檢測AtSWEET15[22]和OsSWEET15的蔗糖轉(zhuǎn)運活性[23]；通過爪蟾卵母細胞表達結(jié)合放射性底物檢測AtSWEET15[24]和GmSWEET15b[25]的蔗糖轉(zhuǎn)運活性；通過酵母蔗糖利用缺陷菌株表達結(jié)合生長互補檢測PbSWEET15[19]和SlSWEET15[21]的蔗糖轉(zhuǎn)運活性，通過酵母蔗糖利用缺陷菌株表達結(jié)合放射性底物檢測MtSWEET15.3[26]的蔗糖轉(zhuǎn)運活性。本研究利用的Esculin（6,7-二羥基香豆素-b-D-葡糖苷）與蔗糖結(jié)構(gòu)類似，具有較強的自發(fā)熒光。此前已建立酵母表達結(jié)合Esculin熒光檢測驗證SUT類AtSUC2和馬鈴薯StSUT1轉(zhuǎn)運活性的簡單方法[18]。Esculin還用于示蹤葉肉原生質(zhì)體[27]、韌皮部[28]、花粉管[29]和花柄[30]的蔗糖轉(zhuǎn)運。SWEETⅢ類的AtSWEET10也具有Esculin轉(zhuǎn)運活性，基于此種特性建立檢測該類成員蔗糖轉(zhuǎn)運活性的簡單方法[27]。此外，蔗糖正常利用的酵母菌株也能用于Esculin的吸收檢測，其結(jié)果與使用蔗糖利用缺陷型菌株的結(jié)果基本一致[18]。因此，本研究使用常見的酵母蔗糖正常利用的W303a菌株為異源表達體系，通過檢測胞內(nèi)Esculin熒光強度來判斷目標基因的蔗糖轉(zhuǎn)運活性。CitSWEET15轉(zhuǎn)運Esculin，熒光強度約為對照的2.2倍，說明其具有蔗糖轉(zhuǎn)運活性。

目前報道的園藝作物SWEET15類基因普遍在果實和花等庫器官表達，參與庫器官可溶性糖積累。蘋果SWEET15基因MdSWEET3.9~11隨果實成熟顯著上調(diào)，與果糖和蔗糖相關性較高[11]。進一步研究發(fā)現(xiàn)蘋果MdSWEET15a位于染色體上的區(qū)域中包含與果實可溶性糖相關的數(shù)量性狀位點，其序列多態(tài)性對果實可溶性糖含量具有較大貢獻[31]。VvSWEET15在葡萄果實成熟期間高表達[7]；SWEET15基因SlNEC1主要在番茄的花、子葉和果實高表達[9]；LcSWEET15在荔枝的花、果肉（假種皮）和種子表達[13]，均表明SWEET15類基因在庫器官參與可溶性糖積累。此外，PbSWEET15[19]和EjSWEET15[32]分別隨梨和枇杷的果實蔗糖積累顯著上調(diào)，在梨果實高蔗糖積累的芽變品種中的表達量顯著高于親本，進一步說明SWEET15對果實可溶性糖積累的作用。蔗糖是柑橘植株光合產(chǎn)物運輸?shù)闹饕问絒33]，果實蔗糖的卸載采用共質(zhì)體和質(zhì)外體途徑，且以共質(zhì)體途徑為主[34]。CitSWEET15在甜橙果實成熟期間顯著上調(diào)表達，在高蔗糖積累的芽變品種中表達量顯著高于母本[16]。本研究發(fā)現(xiàn)CitSWEET15蛋白具有蔗糖轉(zhuǎn)運活性且定位于細胞膜，這也證明CitSWEET15介導的跨細胞膜蔗糖轉(zhuǎn)運（質(zhì)外體途徑）對甜橙果實成熟期間的蔗糖積累具有較大貢獻。同時，原位雜交表明CitSWEET15在甜橙果實囊衣和汁胞的表皮細胞高表達，推測其功能是將囊衣維管束和汁胞表皮細胞的蔗糖卸載到質(zhì)外體[16]。上述報道在組織水平上分析了CitSWEET15的表達，但其在細胞水平的表達仍需深入研究。

本研究對甜橙CitSWEET15開展序列比對、基因表達、亞細胞定位和轉(zhuǎn)運活性檢測等分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CitSWEET15在柑橘類物種中序列高度保守，定位于細胞膜，具有蔗糖轉(zhuǎn)運活性，參與果實成熟期間的質(zhì)外體蔗糖跨細胞膜轉(zhuǎn)運。下一步需從細胞水平精細檢測CitSWEET15在甜橙果實中的表達模式，深入了解其參與蔗糖通過質(zhì)外體途徑卸載進入果肉細胞的生理功能，明確其參與果實可溶性糖積累的分子機制。