鄭乾明,王小柯,王紅林,解 璞,付慧敏,陳傳武*
1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所,貴州貴陽 550006;2. 廣西桂北特色經(jīng)濟(jì)作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用實(shí)驗(yàn)室/廣西特色作物研究院,廣西桂林 541004
可溶性糖組分和含量是決定果實(shí)品質(zhì)的最關(guān)鍵因子,也是園藝作物育種和改良的重要研究方向。果實(shí)積累的可溶性糖主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇等,來自于源器官的光合作用,經(jīng)韌皮部裝載、長(zhǎng)距離運(yùn)輸和卸載,進(jìn)入果實(shí)細(xì)胞參與代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存[1]。這一系列過程涉及糖的多次跨膜運(yùn)輸,均需要糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(或載體)介導(dǎo)。
植物糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括易化擴(kuò)散載體超家族(major facilitator superfamily, MFS)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sucrose transporter, SUT)和單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monosaccharide transporter, MST),以及新型SWEET家族[2]。SUT和MST通常含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,偶聯(lián)質(zhì)子介導(dǎo)糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[3-4]。2010年CHEN首次使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer, FRET)鑒定了AtSWEET1的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性,該蛋白含7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域,依賴細(xì)胞內(nèi)外糖濃度梯度而非跨膜質(zhì)子梯度來完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能[5]。擬南芥SWEET家族的17個(gè)成員分為四類,Ⅰ和Ⅱ類均定位于細(xì)胞膜,轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖等單糖,參與花發(fā)育,種子萌發(fā),宿主-病原體互作等;Ⅲ類定位于細(xì)胞膜,主要轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖,參與蔗糖的韌皮部裝載,花蜜分泌,花、果實(shí)及種子發(fā)育等;IV類定位于液泡膜,轉(zhuǎn)運(yùn)果糖、葡萄糖和蔗糖,控制果糖積累,調(diào)控耐寒性[6]。
近年來通過同源搜索獲得大量園藝作物的SWEET家族信息,且大量研究表明SWEET影響果實(shí)可溶性糖積累,參與果實(shí)發(fā)育和成熟。葡萄SWEET家族含有17個(gè)成員[7],VvSWEET10主要在果實(shí)轉(zhuǎn)色期表達(dá),參與己糖積累[8]。番茄SWEET家族含有29個(gè)成員[9],SlSWEET7a在綠熟期果實(shí)果柄和維管束高表達(dá),推測(cè)參與蔗糖的韌皮部裝載和卸載[10]。蘋果SWEET家族的13個(gè)成員與果實(shí)可溶性糖積累表現(xiàn)較高的相關(guān)性[11],MdSWEET1在番茄中過表達(dá)提高果實(shí)蔗糖和果糖含量[12]。荔枝SWEET家族含有16個(gè)成員,其中8個(gè)在果肉(假種皮)中高表達(dá)[13]。棗SWEET家族含有19個(gè)成員,ZjSWEET2.2定位于細(xì)胞膜,與果實(shí)己糖積累負(fù)相關(guān)[14]。
甜橙基因組SWEET家族含有16個(gè)成員,其中12個(gè)在果實(shí)表達(dá),包含在果實(shí)高表達(dá)的Cs7g02970基因[15]。Cs7g02970基因(命名CitSWEET15)在甜橙果實(shí)囊衣和汁胞高表達(dá),與果實(shí)可溶性糖積累高度正相關(guān),可能介導(dǎo)蔗糖跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)外體[16]。然而CitSWEET15的亞細(xì)胞定位和糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性尚不清楚,不能明確其生理功能。對(duì)此,本研究克隆了CitSWEET15基因的ORF序列,重點(diǎn)分析其蛋白的亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)運(yùn)活性,探討其在甜橙果實(shí)可溶性糖積累過程中的生理功能。
供試材料為廣西特色作物研究院種植的甜橙品種暗柳橙(Citrus sinensisOsbeck cv.‘Anliu’),選擇5株處于盛果期且長(zhǎng)勢(shì)良好的成年結(jié)果樹,采集成熟葉片和盛開的花,以及花后80 d(80DAF)、110 d(110DAF)、140 d(140DAF)、170 d(170DAF)、200 d(200DAF)、230 d(230DAF)果實(shí)。樣品置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室,果實(shí)剝?nèi)スと」夂统墒旃麑?shí)(230 d)種子。所有樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),樣品液氮速凍后-80 ℃保存。
1.2.1 基因克隆 在甜橙基因組數(shù)據(jù)庫(http: //citrus.hzau.edu.cn/orange/)查詢Cs7g02970,即CitSWEET15,下載其cDNA和CDS序列。提取甜橙果肉總RNA(Aidlab, RN53),利用PrimeScriptTM 1stStrand cDNA Synthesis試劑盒(TaKaRa, 6110A)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以此為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增引物序列為5′-ATGGCCATAATGTTCGAT-3′/5′-TCAAACAG CAACAGCACA-3′,利用高保真PCR酶擴(kuò)增試劑(Vazyme Biotech,P515-1)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳和回收,連接至測(cè)序載體pMD19-T測(cè)序。
1.2.2 序列分析 在甜橙基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI網(wǎng)站使用在線Blastn進(jìn)行檢索,下載核苷酸序列。使用DNAMAN軟件將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列,使用在線軟件ExPASy(https://web.expasy.org/)預(yù)測(cè)相對(duì)分子量和理論等電點(diǎn),使用在線軟件TMHMM 2.0(https: //services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)。使用Clustal W軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),利用MEGA 7.0軟件,使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)行1000次重復(fù)的Bootstrap值檢驗(yàn)。
1.2.3 qRT-PCR檢測(cè) 提取成熟葉片、花、種子和果肉的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用2×SYBR Green Fast qPCR Mix試劑(Biomarker,RK02001),在熒光定量PCR儀(BIO-RAD, CFX96)檢測(cè)基因的表達(dá)量。目標(biāo)基因引物序列:5′-GGGAGTTGCATTTGGCATCT-3′/5′-GCACCGG AGCCAGGTACA-3′,內(nèi)參基因Actin引物序列:5′-CCAAGCAGCATGAAGATCAA-3′/5′-ATCTG CTGGAAGGTGCTGAG-3′。設(shè)置3次技術(shù)重復(fù),基因的相對(duì)表達(dá)量使用2-??CT值計(jì)算。
1.2.4 亞細(xì)胞定位 以含有CitSWEET15基因CDS的質(zhì)粒為模板,以去除終止密碼子的引物(5′-ACAGCCCAAGCTTGCATGCCTGCAGATGGCCA TAATGTTCGAT-3′/5′-CCTCGCCCTTGCTCACCA TGGATCCAACAGCAACAGCACATCCA-3′),利用高保真2×Phanta?Max Master DNA聚合酶(Vazyme Biotech, P515)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)PstII和BamHI(NEB)將載體酶切線性化后,使用ClonExpress?II One Step克隆試劑盒(Vazyme Biotech, C112)將擴(kuò)增產(chǎn)物插入至目標(biāo)載體16318-hGFP。構(gòu)建的融合表達(dá)載體和空載體分別轉(zhuǎn)化擬南芥葉肉原生質(zhì)體,具體操作步驟參考YOO等[17]的方法。
1.2.5 酵母表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化 以含有CitSWEET15基因CDS的質(zhì)粒為模板,使用引物(5′-GTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCAT GGCCATAATGTTCGAT-3′/5′-AATTGGGTACCG GGCCCCCCCTCGAGTCAAACAGCAACAGCA CA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用EcoR I和XhoI(NEB)將載體線性化,利用ClonExpress?II One Step克隆試劑盒(Vazyme Biotech, C112)將擴(kuò)增產(chǎn)物插入至酵母表達(dá)載體pDR196的多克隆位點(diǎn)。經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后將CitSWEET15-pDR196、載體pDR196(載體對(duì)照)和AtSWEET10-pDR196(陽性對(duì)照)分別轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌株W303a(W303-1A)。酵母轉(zhuǎn)化采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法,使用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(Coolaber, SK2400),轉(zhuǎn)化后的單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。
1.2.6 Esculin轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè) 酵母陽性單克隆使用SC/-ura(2%葡萄糖為碳源)液體培養(yǎng)基30 ℃震蕩過夜,至OD600為0.6~1.0。酵母細(xì)胞吸收Esculin和熒光強(qiáng)度檢測(cè)方法參考GORA等[18]的方法,略作修改。吸取酵母菌液,加入Esculin溶液(Solarbio, E8230)至終濃度1 mmol/L,30 ℃震蕩培養(yǎng)60 min。離心收集酵母細(xì)胞,使用磷酸鹽緩沖液清洗酵母細(xì)胞2次,再加入磷酸鹽緩沖液充分重懸。使用多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices,SpectraMax iD3)檢測(cè)Esculin熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng)為367 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為454 nm。同時(shí)按照1∶2的比例稀釋酵母細(xì)胞,使用酶標(biāo)儀(Thermo Scientific, Multiskan GO)檢測(cè)酵母重懸細(xì)胞的OD600值。計(jì)算每1個(gè)OD600值的酵母細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值,每個(gè)基因或?qū)φ盏臄?shù)據(jù)均來自于4個(gè)獨(dú)立的酵母單克隆。
經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序表明,CitSWEET15的ORF長(zhǎng)度為918 bp,編碼305個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)為6.29,相對(duì)分子量為34.15 kDa,含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。CitSWEET15與擬南芥SWEET家族AtSWEET15的氨基酸序列一致率為55.5%,與其他16個(gè)成員的氨基酸序列一致率為28.5%~49.8%。對(duì)21個(gè)SWEETs的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖1),結(jié)果發(fā)現(xiàn),CitSWEET15與PuSWEET15[19]、VvSWEET15[7]、LcSWEET15[13]和AtSWEET15為直系同源,并與AtSWEET9~AtSWEET15同屬于SWEET Ⅲ類。
將甜橙CitSWEET15與已有基因組數(shù)據(jù)報(bào)道的柑橘類SWEET15基因比較序列差異,結(jié)果見表1。CitSWEET15與柑橘屬的克里曼丁橘和莽山野橘SWEET15基因的核苷酸序列一致率為99.90%,氨基酸序列一致率為100%。與金柑屬的金柑SWEET15基因的核苷酸和氨基酸序列一致率略低,分別為99.13%和98.03%。與柑橘屬的柚、宜昌橙和枸櫞SWEET15基因的核苷酸序列一致率為98.69%~99.02%,氨基酸序列一致率為97.38%~97.70%。
表1 CitSWEET15與其他柑橘類SWEET15基因的序列一致率Tab. 1 Sequence identities between CitSWEET15 and other Citrus SWEET15 genes
前人對(duì)SWEET III類成員AtSWEET13蛋白結(jié)構(gòu)解析表明,若干氨基酸殘基對(duì)蔗糖識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)具有決定性作用[20]。將CitSWEET15及上述柑橘類SWEET15的氨基酸序列共同比對(duì),結(jié)果見圖2。4個(gè)特異性識(shí)別蔗糖的位點(diǎn)(V/25、S/56、V/146和S/177)與AtSWEET13、AtSWEET15完全一致,3個(gè)與蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性相關(guān)的位點(diǎn)(W/60、N/77和W/181)也與AtSWEET13、AtSWEET15完全一致,因此推測(cè)CitSWEET15和柑橘類SWEET15成員可能均具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。
利用qRT-PCR檢測(cè)CitSWEET15基因在甜橙葉片、花、種子和果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期果肉中的表達(dá)模式,結(jié)果如圖3所示。CitSWEET15基因在種子中表達(dá)量較葉片和花中高,在果肉中的表達(dá)量隨果實(shí)發(fā)育和成熟逐漸增加?;ê?0、110、140 d的果實(shí)中表達(dá)量較低,此后快速增加,在花后230 d的果實(shí)中的表達(dá)量達(dá)到最高。
圖3 CitSWEET15在甜橙不同組織和果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式Fig. 3 Expression patterns of CitSWEET15 among various tissues and fruit developmental stages of sweet orange
為了解CitSWEET15的亞細(xì)胞定位,在其C端融合綠色熒光蛋白,瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥葉肉原生質(zhì)體。如圖4所示,空載體p35S-GFP的綠色熒光分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。目標(biāo)基因載體CitSWEET15-GFP的綠色熒光圍繞原生質(zhì)體外緣分布,與細(xì)胞膜被FM4-64染料標(biāo)識(shí)后產(chǎn)生的紅色熒光重合。二者完全融合后產(chǎn)生黃色熒光,說明CitSWEET15定位于細(xì)胞膜。
圖4 CitSWEET15蛋白的亞細(xì)胞定位Fig. 4 Subcellular localization of CitSWEET15 protein
使用具有熒光的蔗糖類似物Esculin為轉(zhuǎn)運(yùn)底物,檢測(cè)表達(dá)CitSWEET15的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)Esculin情況,比較熒光強(qiáng)度明確其轉(zhuǎn)運(yùn)活性。酵母細(xì)胞經(jīng)Esculin孵育后,陽性對(duì)照AtSWEET10的熒光強(qiáng)度顯著高于空載體pDR196,強(qiáng)度約為空載體pDR196的1.3倍;CitSWEET15的熒光強(qiáng)度也顯著高于空載體pDR196,強(qiáng)度約為空載體pDR196的2.2倍(圖5)。以上說明CitSWEET15和陽性對(duì)照AtSWEET10均具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。
圖5 表達(dá)CitSWEET15的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖類似物Esculin檢測(cè)Fig. 5 Transportation test of sucrose analog Esculin by yeast cells expressing CitSWEET15
近年來關(guān)于VvSWEET10[8]、ZjSWEET2.2[14]、PbSWEET15[19]、SlSWEET7a[10]和SlSWEET15[21]的研究表明,SWEET家族對(duì)果實(shí)可溶性糖積累具有重要作用。此前已分離甜橙SWEET家族,根據(jù)其表達(dá)模式篩選出若干參與果實(shí)可溶性糖積累的候選基因[15]。本研究選取在甜橙成熟果實(shí)高表達(dá)的CitSWEET15深入研究,其在柑橘類不同物種中的核苷酸和氨基酸序列一致性較高,且識(shí)別蔗糖的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)與AtSWEET13等完全一致[20]。因此推測(cè)包括CitSWEET15在內(nèi)的SWEET15類基因在柑橘類物種中序列高度保守,可能都具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。
離體表達(dá)體系是檢測(cè)植物SWEET15類成員蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的有效方法,如通過HEK293T細(xì)胞表達(dá)結(jié)合FRET檢測(cè)AtSWEET15[22]和OsSWEET15的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性[23];通過爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)結(jié)合放射性底物檢測(cè)AtSWEET15[24]和GmSWEET15b[25]的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性;通過酵母蔗糖利用缺陷菌株表達(dá)結(jié)合生長(zhǎng)互補(bǔ)檢測(cè)PbSWEET15[19]和SlSWEET15[21]的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性,通過酵母蔗糖利用缺陷菌株表達(dá)結(jié)合放射性底物檢測(cè)MtSWEET15.3[26]的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。本研究利用的Esculin(6,7-二羥基香豆素-b-D-葡糖苷)與蔗糖結(jié)構(gòu)類似,具有較強(qiáng)的自發(fā)熒光。此前已建立酵母表達(dá)結(jié)合Esculin熒光檢測(cè)驗(yàn)證SUT類AtSUC2和馬鈴薯StSUT1轉(zhuǎn)運(yùn)活性的簡(jiǎn)單方法[18]。Esculin還用于示蹤葉肉原生質(zhì)體[27]、韌皮部[28]、花粉管[29]和花柄[30]的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)。SWEETⅢ類的AtSWEET10也具有Esculin轉(zhuǎn)運(yùn)活性,基于此種特性建立檢測(cè)該類成員蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的簡(jiǎn)單方法[27]。此外,蔗糖正常利用的酵母菌株也能用于Esculin的吸收檢測(cè),其結(jié)果與使用蔗糖利用缺陷型菌株的結(jié)果基本一致[18]。因此,本研究使用常見的酵母蔗糖正常利用的W303a菌株為異源表達(dá)體系,通過檢測(cè)胞內(nèi)Esculin熒光強(qiáng)度來判斷目標(biāo)基因的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。CitSWEET15轉(zhuǎn)運(yùn)Esculin,熒光強(qiáng)度約為對(duì)照的2.2倍,說明其具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。
目前報(bào)道的園藝作物SWEET15類基因普遍在果實(shí)和花等庫器官表達(dá),參與庫器官可溶性糖積累。蘋果SWEET15基因MdSWEET3.9~11隨果實(shí)成熟顯著上調(diào),與果糖和蔗糖相關(guān)性較高[11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蘋果MdSWEET15a位于染色體上的區(qū)域中包含與果實(shí)可溶性糖相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn),其序列多態(tài)性對(duì)果實(shí)可溶性糖含量具有較大貢獻(xiàn)[31]。VvSWEET15在葡萄果實(shí)成熟期間高表達(dá)[7];SWEET15基因SlNEC1主要在番茄的花、子葉和果實(shí)高表達(dá)[9];LcSWEET15在荔枝的花、果肉(假種皮)和種子表達(dá)[13],均表明SWEET15類基因在庫器官參與可溶性糖積累。此外,PbSWEET15[19]和EjSWEET15[32]分別隨梨和枇杷的果實(shí)蔗糖積累顯著上調(diào),在梨果實(shí)高蔗糖積累的芽變品種中的表達(dá)量顯著高于親本,進(jìn)一步說明SWEET15對(duì)果實(shí)可溶性糖積累的作用。蔗糖是柑橘植株光合產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)闹饕问絒33],果實(shí)蔗糖的卸載采用共質(zhì)體和質(zhì)外體途徑,且以共質(zhì)體途徑為主[34]。CitSWEET15在甜橙果實(shí)成熟期間顯著上調(diào)表達(dá),在高蔗糖積累的芽變品種中表達(dá)量顯著高于母本[16]。本研究發(fā)現(xiàn)CitSWEET15蛋白具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性且定位于細(xì)胞膜,這也證明CitSWEET15介導(dǎo)的跨細(xì)胞膜蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)(質(zhì)外體途徑)對(duì)甜橙果實(shí)成熟期間的蔗糖積累具有較大貢獻(xiàn)。同時(shí),原位雜交表明CitSWEET15在甜橙果實(shí)囊衣和汁胞的表皮細(xì)胞高表達(dá),推測(cè)其功能是將囊衣維管束和汁胞表皮細(xì)胞的蔗糖卸載到質(zhì)外體[16]。上述報(bào)道在組織水平上分析了CitSWEET15的表達(dá),但其在細(xì)胞水平的表達(dá)仍需深入研究。
本研究對(duì)甜橙CitSWEET15開展序列比對(duì)、基因表達(dá)、亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)等分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CitSWEET15在柑橘類物種中序列高度保守,定位于細(xì)胞膜,具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性,參與果實(shí)成熟期間的質(zhì)外體蔗糖跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。下一步需從細(xì)胞水平精細(xì)檢測(cè)CitSWEET15在甜橙果實(shí)中的表達(dá)模式,深入了解其參與蔗糖通過質(zhì)外體途徑卸載進(jìn)入果肉細(xì)胞的生理功能,明確其參與果實(shí)可溶性糖積累的分子機(jī)制。