劉明洋，楊 洪，代龍軍，王立豐，郭冰冰

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實驗站/中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，海南海口 571101

熱休克蛋白90（heat shock protein 90, HSP90）是一類重要的分子伴侶，其影響多種客戶蛋白的構(gòu)象來調(diào)節(jié)動物細(xì)胞的生長發(fā)育和先天免疫反應(yīng)[1]。此外，HSP90還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)參與植物在正常和脅迫條件下的生長發(fā)育[2]。過表達(dá)GmHSP90降低擬南芥在熱、滲透和鹽脅迫誘導(dǎo)下的損傷[3]。遺傳分析表明，HSP90是植物抗性R基因介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所必需的[4]。植物缺失HSP90蛋白會降低擬南芥RAR1對R基因介導(dǎo)的免疫功能[5]。同時，AtHSP90也被報道在高溫下調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。在短暫的熱休克處理中HSP90的mRNA水平增加，使擬南芥花朵停止發(fā)育的趨勢減弱，表明HSP90在植物生殖過渡和花的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[6]。HSP90還通過抑制某些目標(biāo)蛋白的突變來緩沖植物的表型變異。在擬南芥中抑制HSP90基因的表達(dá)后，擬南芥的tir1-1突變體會導(dǎo)致擬南芥根部生長缺陷[7]。此外，格爾德霉素（GDA）作為HSP90的體內(nèi)外抑制劑被廣泛應(yīng)用。外源施用格爾德霉素可導(dǎo)致多種發(fā)育表型，如生長遲緩和葉片卷曲[8-9]。為了使植物能夠適應(yīng)不斷變化的環(huán)境，植物激素及其相互間的信號傳遞在整合內(nèi)外信號中起著關(guān)鍵作用[10]。格爾德霉素抑制HSP90中ATP酶活性后會引起B(yǎng)ES1的過度磷酸化，并破壞油菜素內(nèi)酯（BR）響應(yīng)基因的表達(dá)，表明HSP90在BR信號通路中被證明是維持BES1去磷酸化狀態(tài)所必需的[11]。生長素和茉莉酸的激素受體成分也被確定為HSP90伴侶系統(tǒng)的客戶，這表明HSP90直接依賴于激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。HSP90基因在模式植物中的功能已得到廣泛研究，而其在橡膠樹中的功能鮮有報道。

大戟科橡膠樹（Hevea brasiliensisMüll. Arg.）是生產(chǎn)天然橡膠（順-1,4-聚異戊二烯，NR）最可靠的來源，天然橡膠的合成和儲存在橡膠樹乳管細(xì)胞[13]。橡膠樹的樹皮每2~3 d切除1次，切斷乳汁管環(huán)以使乳膠流出，每棵樹從乳汁管中排出幾十到幾百毫升的膠乳，用于可持續(xù)的橡膠生產(chǎn)[14]。然而，我國橡膠樹植膠區(qū)位于熱帶北緣和南亞熱帶地區(qū)，經(jīng)常遭受臺風(fēng)、寒潮和干旱的影響[15]。橡膠樹無性系維管形成層乳汁管環(huán)的分化不僅受環(huán)境條件的影響，還受基因控制。因此，選育抗逆高產(chǎn)的橡膠樹無性系是橡膠樹育種的重要目標(biāo)。為解析HSP90基因在橡膠樹中的抗逆功能，本研究分析乙烯、茉莉酸、生長素和油菜素內(nèi)酯激素以及機械傷害處理對HbHSP90.6基因表達(dá)的影響，并構(gòu)建植物順時表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草分析其亞細(xì)胞定位，為深入揭示橡膠樹膠乳HbHSP90.6基因在激素信號通路和脅迫反應(yīng)機制中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所用的橡膠樹種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊的10 a樹齡正常割膠巴西橡膠樹無性系熱研73397。用于瞬時基因表達(dá)試驗的本氏煙草種子來源于本實驗室。

1.1.2 菌株與試劑 所用綠色熒光融合表達(dá)載體pGREEN由本實驗室保存；Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自TRANS生物公司；農(nóng)桿菌GV3101菌株購自唯地生物公司；連接試劑盒（零背景pTOPO-Blun Simple閃電克隆試劑盒）購自金百特生物公司；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo；熒光定量試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和產(chǎn)物回收試劑盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit均購自Vazyme公司；質(zhì)粒提試劑盒E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I購自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 選取橡膠樹品種熱研73397的根、花、枝、莖、葉和膠乳作為HbHSP90.6基因克隆和不同組織的表達(dá)量分析材料。不同的激素和脅迫按照以下方法：配制1.5%（V/V）乙烯利（ethephon, ETH）、200 μmol/L茉莉酸（jasmonic acid, JA）、66 μmol/L吲哚-3-乙酸（3-indoleacetic acid, IAA）、1 μmol/L油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids,BR），用毛刷均勻涂在橡膠樹割線上下約2 cm割面上。橡膠樹的傷害處理是在割線下方3 cm處，沿割線每隔5 cm按下一個大頭釘，圖釘一直保留到采樣結(jié)束。以0.05%（V/V）乙醇溶液為對照，處理和對照分別在0、3、6、12、24 h同步采集膠乳，滴落的膠乳均用液氮速凍收集，后保存在-80 ℃冰箱中備用。以上每種處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 RNA的提取和cDNA的合成 膠乳總RNA的提取參照劉明洋等[16]的方法進(jìn)行提取，RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA方法按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒實驗步驟進(jìn)行，反轉(zhuǎn)獲得的cDNA均稀釋到100~200 ng/μL，保存在-20 ℃冰箱后用于基因克隆和熒光定量分析。

1.2.3 熒光定量PCR分析 采用軟件primer premier 6.0設(shè)計HbHSP90.6基因的qRT-PCR引物（QF: GGTATCGGCATGACCAAGG，QR: TCCG CTACAAGGTAAGCAGAGT），以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，HbActin基因為內(nèi)參（F: GATGTGG ATATCAGGAAGGA, R: CATACTGCTTGGAGCA AGA），采用SYBR Green法在Bio-Rad公司的CFX實時熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴增，分析擴增完成后所獲得的溶解曲線圖和Cq值?；蛳鄬Ρ磉_(dá)結(jié)果在Excel 2016軟件用2-ΔΔCT法[17]進(jìn)行分析計算。使用SPSS Statistics 25（IBM）進(jìn)行單因素ANOVA檢驗分析差異顯著性。采用Origin 2018（Origin Lab Corporation）軟件制圖。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）下載擬南芥、水稻的氨基酸序列用于多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；用NCBI Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?）分析保守結(jié)構(gòu)域；用ExPASy ProtParam（web. expasy.org/protparam/）在線軟件分析HbHSP90.6理化性質(zhì)；用DeepLoc1.0（www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.5HbHSP90.6基因克隆和植物瞬時表達(dá)載體構(gòu)建 在橡膠樹基因組中獲得HbHSP90.6基因序列，設(shè)計HbHSP90.6基因特異性引物（F: GC GCTCTTTGCTTCG, R: CCCTGAAATCGGGTA）。以反轉(zhuǎn)錄得到的橡膠樹熱研73397膠乳cDNA為模板，按照高保真酶試劑盒說明書進(jìn)行擴增，PCR擴增產(chǎn)物純化后連接pESI-Blunt vector平末端載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR檢測后挑取陽性克隆菌落送測序確認(rèn)。結(jié)合pGREEN載體圖譜及去除終止密碼子后的HbHSP90.6的核酸序列，通過CD designV1.04軟件設(shè)計帶有HindⅢ和BamHⅠ酶切位點插入片段的同源重組引物（GF:gtcgacggtatcgataagcttATGGCGGATGTGAAGATG GC, GR: tttactcatactagtggatccGTCTACTTCCTCC ATCTTGCTCTCC），以HbHSP90.6質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴增，同時對表達(dá)載體pGREEN進(jìn)行雙酶切。將擴增目的條帶和載體酶切產(chǎn)物按Vazyme膠回收試劑盒說明書（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）進(jìn)行回收純化，獲得的膠回收產(chǎn)物通過同源重組體系連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有Kana抗性的LB平板上培養(yǎng)。測序驗證后提取質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，菌液和甘油1∶1的比例混勻保存-80 ℃冰箱備用。

1.2.6HbHSP90.6基因亞細(xì)胞定位 將PCR檢測為陽性的農(nóng)桿菌單菌落加入5 mL LB液體培養(yǎng)基（50 mg/L Rif+100 mg/L Kana）28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8后收集菌體，再吸取100 μL基因的菌液到含有50 mL LB培養(yǎng)基（50 mg/L Rif+100 mg/L Kana）的三角瓶中振蕩過夜培養(yǎng)。在室溫條件下3200g離心10 min，棄上清收集菌體，用重懸液（1/2 MS，pH 5.7）重懸菌體，靜置2 min，棄上清，用侵染液（10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2、150 μmol/L乙酰丁香酮）重懸菌體至OD600=0.6，避光靜置2 h。選擇長勢一致的5~6周齡本氏煙草提前澆足水暗培養(yǎng)1 d，用1 mL無菌注射器吸取菌液從煙草葉片背面注射，煙草注射后24～48 h內(nèi)觀察，觀察時撕取葉片表皮用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）進(jìn)行染色，用0.9%生理鹽水洗滌后用蓋玻片蓋好，用蔡司LSM 880激光共聚焦顯微鏡在波長為488 nm的激發(fā)光下觀察綠色熒光信號，拍照并保存實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

序列分析表明HbHSP90.6的編碼區(qū)（CDS）為2112 bp（GenBank登錄號：OP375588）。理化性質(zhì)分析表明其分子量（MW）為80 774.85 Da，等電點（pI）為5.04，不穩(wěn)定系數(shù)為38.98，總平均親水性為-0.610，推測該蛋白是一個穩(wěn)定的親水蛋白。保守結(jié)構(gòu)域分析和多序列比對結(jié)果顯示，HbHSP90.6含有PTZ00272結(jié)構(gòu)域，且包含高度保守的MEEVD基序（圖1）。DeepLoc1.0預(yù)測分析顯示，HbHSP90.6蛋白92.8%定位在細(xì)胞質(zhì)（圖2）。

2.2 進(jìn)化分析

為揭示HbHSP90.6的進(jìn)化特征，將其已報道的擬南芥和水稻的HSP90蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果表明，HSP90蛋白被聚為5支，其中HbHSP90.6與擬南芥AtHSP90.1（NM_124642.4）和水稻OsHsp90-1（LOC_Os04g01740）聚在一起，同源性分別為92.34%和86.44%。

圖3 HbHSP90.6與擬南芥和水稻HSP90蛋白的進(jìn)化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of HbHSP90.6 and HSP90 proteins in Arabidopsis and rice

2.3 基因克隆和植物瞬時表達(dá)載體構(gòu)建

以橡膠樹熱研73397膠乳cDNA為模板進(jìn)行HbHSP90.6基因全長克隆，獲得單一條帶，長度為2196 bp（圖4B），經(jīng)測序驗證成功克隆HbHSP90.6基因。結(jié)合pGREEN表達(dá)載體圖譜（圖4A），以HbHSP90.6質(zhì)粒為模板PCR擴增得到的產(chǎn)物與雙酶切后的表達(dá)載體pGREEN進(jìn)行連接，經(jīng)菌落PCR驗證和測序，結(jié)果表明成功構(gòu)建35S::HbHSP90.6::GFP融合表達(dá)載體（圖4C）。

圖4 HbHSP90.6過表達(dá)載體構(gòu)建Fig. 4 Construction of HbHSP90.6 overexpression vector

2.4 HbHSP90.6基因表達(dá)分析

2.4.1HbHSP90.6基因的組織表達(dá)分析 采用實時熒光定量PCR對HbHSP90.6基因在橡膠樹的根、花、枝、莖、葉和膠乳中進(jìn)行基因表達(dá)分析。結(jié)果表明（圖5），HbHSP90.6在橡膠樹的不同組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量差異顯著，HbHSP90.6在膠乳中的基因表達(dá)量顯著高于根、花、枝、莖、葉，HbHSP90.6基因在膠乳中的表達(dá)量相對于花達(dá)到283倍，推測HbHSP90.6基因主要在膠乳中起作用。

圖5 HbHSP90.6基因在橡膠樹不同組織中的表達(dá)分析Fig. 5 Expression analysis of HbHSP90.6 gene in different tissues of rubber trees

2.4.2 機械傷害處理對HbHSP90.6基因表達(dá)的影響 機械傷害會引起橡膠樹膠乳細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，嚴(yán)重時會導(dǎo)致膠乳停止流動。通過qRT-PCR分析機械傷害對HbHSP90.6基因在膠乳中表達(dá)的影響，結(jié)果表明，傷害處理明顯上調(diào)了HbHSP90.6基因的表達(dá)，在12 h上調(diào)最顯著，是處理前的19倍左右（圖6）。

圖6 機械傷害處理對HbHSP90.6的表達(dá)調(diào)控分析Fig. 6 Analysis of regulation of HbHSP90.6 expression by mechanical wounding treatment

2.4.3 激素處理對HbHSP90.6基因表達(dá)的影響植物激素在橡膠樹膠乳代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用[18]。利用qRT-PCR分析HbHSP90.6基因在ETH、JA、IAA和BR處理下的表達(dá)模式（圖7）。結(jié)果表明，HbHSP90.6基因的表達(dá)顯著受乙烯利和茉莉酸調(diào)控，在6 h時表達(dá)量達(dá)到最高，分別是處理前的45倍和17倍。吲哚-3-乙酸處理后，HbHSP90.6基因的表達(dá)也顯著上調(diào)。油菜素內(nèi)酯處理后，HbHSP90.6基因表達(dá)量在處理12 h時顯著上調(diào)表達(dá)，是處理前的50倍。整體而言，4種植物激素對HbHSP90.6基因表達(dá)都呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)趨勢。

圖7 激素處理下HbHSP90.6的表達(dá)規(guī)律Fig. 7 Expression pattern of HbHSP90.6 under different hormone treatment

2.5 亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建成功的35S::HbHSP90.6::GFP融合表達(dá)載體侵染本氏煙草，在強啟動子的驅(qū)動下HbHSP90.6與GFP融合在本氏煙草中瞬時表達(dá)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察煙草表皮細(xì)胞的綠色熒光信號以及通過DAPI染色觀察細(xì)胞核的位置。結(jié)果顯示，488 nm的激發(fā)光下可觀察到綠色熒光信號在HbHSP90.6的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上均有分布，對照組GFP激發(fā)出的熒光信號在煙草細(xì)胞表皮中普遍存在（圖8）。

圖8 HbHSP90.6亞細(xì)胞定位Fig. 8 Subcellular localization of HbHSP90.6

3 討論

巴西橡膠樹是主要的天然橡膠生產(chǎn)植物，橡膠樹的健康生長是獲取膠乳的不斷來源。然而，橡膠樹生長環(huán)境錯綜復(fù)雜，面臨著各種環(huán)境脅迫的威脅，影響著橡膠樹的生理代謝過程，進(jìn)而影響膠乳的產(chǎn)量。HSP90是一種進(jìn)化高度保守的多效性分子伴侶，對真核生物在生理和應(yīng)激條件下的生存至關(guān)重要[19]。HSP90異構(gòu)體在細(xì)胞總蛋白中占1%~2%，在不同類型的應(yīng)激下，這一比例可增加到4%~6%[20-21]。在植物中，HSP90直接或間接地參與了從植物生長發(fā)育到非生物和生物脅迫反應(yīng)以及激素信號傳遞[22-24]。本研究從橡膠樹膠乳中克隆HbHSP90.6基因，該基因含有PTZ00272的結(jié)構(gòu)域和包含高度保守的MEEVD基序，屬于HSP90家族[25]。進(jìn)化樹分析表明HbHSP90.6基因的氨基酸序列與已報道的擬南芥AtHSP90.1（NM_124642.4）和水稻OsHsp90-1（LOC_Os04g01740）具有較高的同源性，推測同源性較高的基因可能執(zhí)行相似的生物學(xué)功能。組織表達(dá)分析顯示HbHSP90.6基因主要在膠乳中表達(dá)，推測HbHSP90.6基因可能參與乳管胞內(nèi)運輸和膠乳代謝調(diào)控。

膠乳開采是獲得天然橡膠的唯一途徑，采膠的方式割膠對橡膠樹是一種不可避免的機械傷害，機械傷害影響橡膠樹的乳管細(xì)胞的生長發(fā)育進(jìn)而影響膠乳的再生能力[26]。本研究結(jié)果顯示HbHSP90.6基因響應(yīng)機械傷害處理，推測HbHSP90.6基因參與機械傷害調(diào)控的橡膠樹生理與代謝活動反應(yīng)。植物激素在植物的生長發(fā)育過程中協(xié)調(diào)其他因子參與脅迫修復(fù)發(fā)揮重要作用。乙烯利和茉莉酸參與植物對病原菌攻擊的防御反應(yīng)，并且其是系統(tǒng)性損傷反應(yīng)的主要因素[27-28]。本研究結(jié)果顯示，HbHSP90.6基因在ETH和JA處理下呈現(xiàn)先上升后下調(diào)的趨勢，與HSP90在擬南芥中調(diào)控激素信號通路研究結(jié)果一致[29]。推測HbHSP90.6基因可能受ETH和JA信號通路調(diào)控參與植物抗病反應(yīng)過程。有研究已表明ETH和JA的刺激會引起膠乳細(xì)胞的生理和代謝發(fā)生顯著變化。應(yīng)用乙烯利到橡膠樹的樹干樹皮上可以顯著提高橡膠樹膠乳產(chǎn)量，而茉莉酸則是誘導(dǎo)橡膠樹乳管細(xì)胞分化和橡膠生物合成的關(guān)鍵信號分子[30]。因此，推測HbHSP90.6基因在橡膠樹產(chǎn)膠過程中發(fā)揮重要作用。生長素在植物生命周期的幾乎所有方面都發(fā)揮重要作用，尤其是在植物組織和器官中呈極性分布，在植物發(fā)育過程中具有類似的形態(tài)發(fā)生活性[31]。本研究結(jié)果顯示吲哚-3-乙酸處理后顯著誘導(dǎo)HbHSP90.6基因上調(diào)表達(dá)，表明HbHSP90.6基因參與生長素誘導(dǎo)的信號通路。油菜素內(nèi)酯是一種甾體植物激素，調(diào)節(jié)植物的各種發(fā)育過程以及生物和非生物脅迫反應(yīng)[32]。本研究結(jié)果顯示HbHSP90.6基因在BR處理下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢，這與前人在擬南芥中研究HSP90基因在BR信號傳導(dǎo)中的作用結(jié)果一致[33]。推測HbHSP90.6基因參與BR信號通路介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。BR信號是通過HSP90活性介導(dǎo)的，并且HSP90/BES1復(fù)合體在形成的亞細(xì)胞位點主動調(diào)節(jié)BR信號，結(jié)果顯示活性BR信號降低了細(xì)胞核中的BES1/ HSP90復(fù)合物，而在細(xì)胞質(zhì)中BES1/HSP90復(fù)合物明顯[34]。為了確定HbHSP90.6基因編碼蛋白的亞細(xì)胞室，通過構(gòu)建植物瞬時表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，激光共聚焦觀察結(jié)果顯示綠色熒光信號在HbHSP90.6的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上均有分布，與亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果一致。

綜上所述，本研究完成了橡膠樹膠乳HbHSP90.6基因的克隆、生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析及亞細(xì)胞定位。此結(jié)果為深入研究橡膠樹HbHSP90.6基因在激素信號介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路中的功能奠定堅實基礎(chǔ)。