劉明洋,楊 洪,代龍軍,王立豐,郭冰冰
農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實驗站/中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所,海南海口 571101
熱休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)是一類重要的分子伴侶,其影響多種客戶蛋白的構(gòu)象來調(diào)節(jié)動物細(xì)胞的生長發(fā)育和先天免疫反應(yīng)[1]。此外,HSP90還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)參與植物在正常和脅迫條件下的生長發(fā)育[2]。過表達(dá)GmHSP90降低擬南芥在熱、滲透和鹽脅迫誘導(dǎo)下的損傷[3]。遺傳分析表明,HSP90是植物抗性R基因介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所必需的[4]。植物缺失HSP90蛋白會降低擬南芥RAR1對R基因介導(dǎo)的免疫功能[5]。同時,AtHSP90也被報道在高溫下調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。在短暫的熱休克處理中HSP90的mRNA水平增加,使擬南芥花朵停止發(fā)育的趨勢減弱,表明HSP90在植物生殖過渡和花的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[6]。HSP90還通過抑制某些目標(biāo)蛋白的突變來緩沖植物的表型變異。在擬南芥中抑制HSP90基因的表達(dá)后,擬南芥的tir1-1突變體會導(dǎo)致擬南芥根部生長缺陷[7]。此外,格爾德霉素(GDA)作為HSP90的體內(nèi)外抑制劑被廣泛應(yīng)用。外源施用格爾德霉素可導(dǎo)致多種發(fā)育表型,如生長遲緩和葉片卷曲[8-9]。為了使植物能夠適應(yīng)不斷變化的環(huán)境,植物激素及其相互間的信號傳遞在整合內(nèi)外信號中起著關(guān)鍵作用[10]。格爾德霉素抑制HSP90中ATP酶活性后會引起B(yǎng)ES1的過度磷酸化,并破壞油菜素內(nèi)酯(BR)響應(yīng)基因的表達(dá),表明HSP90在BR信號通路中被證明是維持BES1去磷酸化狀態(tài)所必需的[11]。生長素和茉莉酸的激素受體成分也被確定為HSP90伴侶系統(tǒng)的客戶,這表明HSP90直接依賴于激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。HSP90基因在模式植物中的功能已得到廣泛研究,而其在橡膠樹中的功能鮮有報道。
大戟科橡膠樹(Hevea brasiliensisMüll. Arg.)是生產(chǎn)天然橡膠(順-1,4-聚異戊二烯,NR)最可靠的來源,天然橡膠的合成和儲存在橡膠樹乳管細(xì)胞[13]。橡膠樹的樹皮每2~3 d切除1次,切斷乳汁管環(huán)以使乳膠流出,每棵樹從乳汁管中排出幾十到幾百毫升的膠乳,用于可持續(xù)的橡膠生產(chǎn)[14]。然而,我國橡膠樹植膠區(qū)位于熱帶北緣和南亞熱帶地區(qū),經(jīng)常遭受臺風(fēng)、寒潮和干旱的影響[15]。橡膠樹無性系維管形成層乳汁管環(huán)的分化不僅受環(huán)境條件的影響,還受基因控制。因此,選育抗逆高產(chǎn)的橡膠樹無性系是橡膠樹育種的重要目標(biāo)。為解析HSP90基因在橡膠樹中的抗逆功能,本研究分析乙烯、茉莉酸、生長素和油菜素內(nèi)酯激素以及機械傷害處理對HbHSP90.6基因表達(dá)的影響,并構(gòu)建植物順時表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草分析其亞細(xì)胞定位,為深入揭示橡膠樹膠乳HbHSP90.6基因在激素信號通路和脅迫反應(yīng)機制中的功能奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 植物材料 本研究所用的橡膠樹種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊的10 a樹齡正常割膠巴西橡膠樹無性系熱研73397。用于瞬時基因表達(dá)試驗的本氏煙草種子來源于本實驗室。
1.1.2 菌株與試劑 所用綠色熒光融合表達(dá)載體pGREEN由本實驗室保存;Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自TRANS生物公司;農(nóng)桿菌GV3101菌株購自唯地生物公司;連接試劑盒(零背景pTOPO-Blun Simple閃電克隆試劑盒)購自金百特生物公司;多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo;熒光定量試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和產(chǎn)物回收試劑盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit均購自Vazyme公司;質(zhì)粒提試劑盒E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I購自O(shè)MEGA公司。
1.2.1 材料處理 選取橡膠樹品種熱研73397的根、花、枝、莖、葉和膠乳作為HbHSP90.6基因克隆和不同組織的表達(dá)量分析材料。不同的激素和脅迫按照以下方法:配制1.5%(V/V)乙烯利(ethephon, ETH)、200 μmol/L茉莉酸(jasmonic acid, JA)、66 μmol/L吲哚-3-乙酸(3-indoleacetic acid, IAA)、1 μmol/L油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids,BR),用毛刷均勻涂在橡膠樹割線上下約2 cm割面上。橡膠樹的傷害處理是在割線下方3 cm處,沿割線每隔5 cm按下一個大頭釘,圖釘一直保留到采樣結(jié)束。以0.05%(V/V)乙醇溶液為對照,處理和對照分別在0、3、6、12、24 h同步采集膠乳,滴落的膠乳均用液氮速凍收集,后保存在-80 ℃冰箱中備用。以上每種處理均設(shè)3次重復(fù)。
1.2.2 RNA的提取和cDNA的合成 膠乳總RNA的提取參照劉明洋等[16]的方法進(jìn)行提取,RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA方法按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒實驗步驟進(jìn)行,反轉(zhuǎn)獲得的cDNA均稀釋到100~200 ng/μL,保存在-20 ℃冰箱后用于基因克隆和熒光定量分析。
1.2.3 熒光定量PCR分析 采用軟件primer premier 6.0設(shè)計HbHSP90.6基因的qRT-PCR引物(QF: GGTATCGGCATGACCAAGG,QR: TCCG CTACAAGGTAAGCAGAGT),以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,HbActin基因為內(nèi)參(F: GATGTGG ATATCAGGAAGGA, R: CATACTGCTTGGAGCA AGA),采用SYBR Green法在Bio-Rad公司的CFX實時熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴增,分析擴增完成后所獲得的溶解曲線圖和Cq值?;蛳鄬Ρ磉_(dá)結(jié)果在Excel 2016軟件用2-ΔΔCT法[17]進(jìn)行分析計算。使用SPSS Statistics 25(IBM)進(jìn)行單因素ANOVA檢驗分析差異顯著性。采用Origin 2018(Origin Lab Corporation)軟件制圖。
1.2.4 生物信息學(xué)分析 在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)下載擬南芥、水稻的氨基酸序列用于多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析;用NCBI Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?)分析保守結(jié)構(gòu)域;用ExPASy ProtParam(web. expasy.org/protparam/)在線軟件分析HbHSP90.6理化性質(zhì);用DeepLoc1.0(www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/)在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。
1.2.5HbHSP90.6基因克隆和植物瞬時表達(dá)載體構(gòu)建 在橡膠樹基因組中獲得HbHSP90.6基因序列,設(shè)計HbHSP90.6基因特異性引物(F: GC GCTCTTTGCTTCG, R: CCCTGAAATCGGGTA)。以反轉(zhuǎn)錄得到的橡膠樹熱研73397膠乳cDNA為模板,按照高保真酶試劑盒說明書進(jìn)行擴增,PCR擴增產(chǎn)物純化后連接pESI-Blunt vector平末端載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)PCR檢測后挑取陽性克隆菌落送測序確認(rèn)。結(jié)合pGREEN載體圖譜及去除終止密碼子后的HbHSP90.6的核酸序列,通過CD designV1.04軟件設(shè)計帶有HindⅢ和BamHⅠ酶切位點插入片段的同源重組引物(GF:gtcgacggtatcgataagcttATGGCGGATGTGAAGATG GC, GR: tttactcatactagtggatccGTCTACTTCCTCC ATCTTGCTCTCC),以HbHSP90.6質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴增,同時對表達(dá)載體pGREEN進(jìn)行雙酶切。將擴增目的條帶和載體酶切產(chǎn)物按Vazyme膠回收試劑盒說明書(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit)進(jìn)行回收純化,獲得的膠回收產(chǎn)物通過同源重組體系連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在含有Kana抗性的LB平板上培養(yǎng)。測序驗證后提取質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,菌液和甘油1∶1的比例混勻保存-80 ℃冰箱備用。
1.2.6HbHSP90.6基因亞細(xì)胞定位 將PCR檢測為陽性的農(nóng)桿菌單菌落加入5 mL LB液體培養(yǎng)基(50 mg/L Rif+100 mg/L Kana)28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8后收集菌體,再吸取100 μL基因的菌液到含有50 mL LB培養(yǎng)基(50 mg/L Rif+100 mg/L Kana)的三角瓶中振蕩過夜培養(yǎng)。在室溫條件下3200g離心10 min,棄上清收集菌體,用重懸液(1/2 MS,pH 5.7)重懸菌體,靜置2 min,棄上清,用侵染液(10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2、150 μmol/L乙酰丁香酮)重懸菌體至OD600=0.6,避光靜置2 h。選擇長勢一致的5~6周齡本氏煙草提前澆足水暗培養(yǎng)1 d,用1 mL無菌注射器吸取菌液從煙草葉片背面注射,煙草注射后24~48 h內(nèi)觀察,觀察時撕取葉片表皮用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行染色,用0.9%生理鹽水洗滌后用蓋玻片蓋好,用蔡司LSM 880激光共聚焦顯微鏡在波長為488 nm的激發(fā)光下觀察綠色熒光信號,拍照并保存實驗結(jié)果。
序列分析表明HbHSP90.6的編碼區(qū)(CDS)為2112 bp(GenBank登錄號:OP375588)。理化性質(zhì)分析表明其分子量(MW)為80 774.85 Da,等電點(pI)為5.04,不穩(wěn)定系數(shù)為38.98,總平均親水性為-0.610,推測該蛋白是一個穩(wěn)定的親水蛋白。保守結(jié)構(gòu)域分析和多序列比對結(jié)果顯示,HbHSP90.6含有PTZ00272結(jié)構(gòu)域,且包含高度保守的MEEVD基序(圖1)。DeepLoc1.0預(yù)測分析顯示,HbHSP90.6蛋白92.8%定位在細(xì)胞質(zhì)(圖2)。
為揭示HbHSP90.6的進(jìn)化特征,將其已報道的擬南芥和水稻的HSP90蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果表明,HSP90蛋白被聚為5支,其中HbHSP90.6與擬南芥AtHSP90.1(NM_124642.4)和水稻OsHsp90-1(LOC_Os04g01740)聚在一起,同源性分別為92.34%和86.44%。
圖3 HbHSP90.6與擬南芥和水稻HSP90蛋白的進(jìn)化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of HbHSP90.6 and HSP90 proteins in Arabidopsis and rice
以橡膠樹熱研73397膠乳cDNA為模板進(jìn)行HbHSP90.6基因全長克隆,獲得單一條帶,長度為2196 bp(圖4B),經(jīng)測序驗證成功克隆HbHSP90.6基因。結(jié)合pGREEN表達(dá)載體圖譜(圖4A),以HbHSP90.6質(zhì)粒為模板PCR擴增得到的產(chǎn)物與雙酶切后的表達(dá)載體pGREEN進(jìn)行連接,經(jīng)菌落PCR驗證和測序,結(jié)果表明成功構(gòu)建35S::HbHSP90.6::GFP融合表達(dá)載體(圖4C)。
圖4 HbHSP90.6過表達(dá)載體構(gòu)建Fig. 4 Construction of HbHSP90.6 overexpression vector
2.4.1HbHSP90.6基因的組織表達(dá)分析 采用實時熒光定量PCR對HbHSP90.6基因在橡膠樹的根、花、枝、莖、葉和膠乳中進(jìn)行基因表達(dá)分析。結(jié)果表明(圖5),HbHSP90.6在橡膠樹的不同組織中均有表達(dá),但表達(dá)量差異顯著,HbHSP90.6在膠乳中的基因表達(dá)量顯著高于根、花、枝、莖、葉,HbHSP90.6基因在膠乳中的表達(dá)量相對于花達(dá)到283倍,推測HbHSP90.6基因主要在膠乳中起作用。
圖5 HbHSP90.6基因在橡膠樹不同組織中的表達(dá)分析Fig. 5 Expression analysis of HbHSP90.6 gene in different tissues of rubber trees
2.4.2 機械傷害處理對HbHSP90.6基因表達(dá)的影響 機械傷害會引起橡膠樹膠乳細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激,嚴(yán)重時會導(dǎo)致膠乳停止流動。通過qRT-PCR分析機械傷害對HbHSP90.6基因在膠乳中表達(dá)的影響,結(jié)果表明,傷害處理明顯上調(diào)了HbHSP90.6基因的表達(dá),在12 h上調(diào)最顯著,是處理前的19倍左右(圖6)。
圖6 機械傷害處理對HbHSP90.6的表達(dá)調(diào)控分析Fig. 6 Analysis of regulation of HbHSP90.6 expression by mechanical wounding treatment
2.4.3 激素處理對HbHSP90.6基因表達(dá)的影響植物激素在橡膠樹膠乳代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用[18]。利用qRT-PCR分析HbHSP90.6基因在ETH、JA、IAA和BR處理下的表達(dá)模式(圖7)。結(jié)果表明,HbHSP90.6基因的表達(dá)顯著受乙烯利和茉莉酸調(diào)控,在6 h時表達(dá)量達(dá)到最高,分別是處理前的45倍和17倍。吲哚-3-乙酸處理后,HbHSP90.6基因的表達(dá)也顯著上調(diào)。油菜素內(nèi)酯處理后,HbHSP90.6基因表達(dá)量在處理12 h時顯著上調(diào)表達(dá),是處理前的50倍。整體而言,4種植物激素對HbHSP90.6基因表達(dá)都呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)趨勢。
圖7 激素處理下HbHSP90.6的表達(dá)規(guī)律Fig. 7 Expression pattern of HbHSP90.6 under different hormone treatment
將構(gòu)建成功的35S::HbHSP90.6::GFP融合表達(dá)載體侵染本氏煙草,在強啟動子的驅(qū)動下HbHSP90.6與GFP融合在本氏煙草中瞬時表達(dá)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察煙草表皮細(xì)胞的綠色熒光信號以及通過DAPI染色觀察細(xì)胞核的位置。結(jié)果顯示,488 nm的激發(fā)光下可觀察到綠色熒光信號在HbHSP90.6的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上均有分布,對照組GFP激發(fā)出的熒光信號在煙草細(xì)胞表皮中普遍存在(圖8)。
圖8 HbHSP90.6亞細(xì)胞定位Fig. 8 Subcellular localization of HbHSP90.6
巴西橡膠樹是主要的天然橡膠生產(chǎn)植物,橡膠樹的健康生長是獲取膠乳的不斷來源。然而,橡膠樹生長環(huán)境錯綜復(fù)雜,面臨著各種環(huán)境脅迫的威脅,影響著橡膠樹的生理代謝過程,進(jìn)而影響膠乳的產(chǎn)量。HSP90是一種進(jìn)化高度保守的多效性分子伴侶,對真核生物在生理和應(yīng)激條件下的生存至關(guān)重要[19]。HSP90異構(gòu)體在細(xì)胞總蛋白中占1%~2%,在不同類型的應(yīng)激下,這一比例可增加到4%~6%[20-21]。在植物中,HSP90直接或間接地參與了從植物生長發(fā)育到非生物和生物脅迫反應(yīng)以及激素信號傳遞[22-24]。本研究從橡膠樹膠乳中克隆HbHSP90.6基因,該基因含有PTZ00272的結(jié)構(gòu)域和包含高度保守的MEEVD基序,屬于HSP90家族[25]。進(jìn)化樹分析表明HbHSP90.6基因的氨基酸序列與已報道的擬南芥AtHSP90.1(NM_124642.4)和水稻OsHsp90-1(LOC_Os04g01740)具有較高的同源性,推測同源性較高的基因可能執(zhí)行相似的生物學(xué)功能。組織表達(dá)分析顯示HbHSP90.6基因主要在膠乳中表達(dá),推測HbHSP90.6基因可能參與乳管胞內(nèi)運輸和膠乳代謝調(diào)控。
膠乳開采是獲得天然橡膠的唯一途徑,采膠的方式割膠對橡膠樹是一種不可避免的機械傷害,機械傷害影響橡膠樹的乳管細(xì)胞的生長發(fā)育進(jìn)而影響膠乳的再生能力[26]。本研究結(jié)果顯示HbHSP90.6基因響應(yīng)機械傷害處理,推測HbHSP90.6基因參與機械傷害調(diào)控的橡膠樹生理與代謝活動反應(yīng)。植物激素在植物的生長發(fā)育過程中協(xié)調(diào)其他因子參與脅迫修復(fù)發(fā)揮重要作用。乙烯利和茉莉酸參與植物對病原菌攻擊的防御反應(yīng),并且其是系統(tǒng)性損傷反應(yīng)的主要因素[27-28]。本研究結(jié)果顯示,HbHSP90.6基因在ETH和JA處理下呈現(xiàn)先上升后下調(diào)的趨勢,與HSP90在擬南芥中調(diào)控激素信號通路研究結(jié)果一致[29]。推測HbHSP90.6基因可能受ETH和JA信號通路調(diào)控參與植物抗病反應(yīng)過程。有研究已表明ETH和JA的刺激會引起膠乳細(xì)胞的生理和代謝發(fā)生顯著變化。應(yīng)用乙烯利到橡膠樹的樹干樹皮上可以顯著提高橡膠樹膠乳產(chǎn)量,而茉莉酸則是誘導(dǎo)橡膠樹乳管細(xì)胞分化和橡膠生物合成的關(guān)鍵信號分子[30]。因此,推測HbHSP90.6基因在橡膠樹產(chǎn)膠過程中發(fā)揮重要作用。生長素在植物生命周期的幾乎所有方面都發(fā)揮重要作用,尤其是在植物組織和器官中呈極性分布,在植物發(fā)育過程中具有類似的形態(tài)發(fā)生活性[31]。本研究結(jié)果顯示吲哚-3-乙酸處理后顯著誘導(dǎo)HbHSP90.6基因上調(diào)表達(dá),表明HbHSP90.6基因參與生長素誘導(dǎo)的信號通路。油菜素內(nèi)酯是一種甾體植物激素,調(diào)節(jié)植物的各種發(fā)育過程以及生物和非生物脅迫反應(yīng)[32]。本研究結(jié)果顯示HbHSP90.6基因在BR處理下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢,這與前人在擬南芥中研究HSP90基因在BR信號傳導(dǎo)中的作用結(jié)果一致[33]。推測HbHSP90.6基因參與BR信號通路介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。BR信號是通過HSP90活性介導(dǎo)的,并且HSP90/BES1復(fù)合體在形成的亞細(xì)胞位點主動調(diào)節(jié)BR信號,結(jié)果顯示活性BR信號降低了細(xì)胞核中的BES1/ HSP90復(fù)合物,而在細(xì)胞質(zhì)中BES1/HSP90復(fù)合物明顯[34]。為了確定HbHSP90.6基因編碼蛋白的亞細(xì)胞室,通過構(gòu)建植物瞬時表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草,激光共聚焦觀察結(jié)果顯示綠色熒光信號在HbHSP90.6的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上均有分布,與亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果一致。
綜上所述,本研究完成了橡膠樹膠乳HbHSP90.6基因的克隆、生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析及亞細(xì)胞定位。此結(jié)果為深入研究橡膠樹HbHSP90.6基因在激素信號介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路中的功能奠定堅實基礎(chǔ)。