包卓聰,王慶慶,賈 輝,陸 瑤,時(shí) 娜,張 艷

0 引言

肝癌作為一種最為普遍的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)排名第五,而死亡率高居全球第三[1]。肝癌包括原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌,其中肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌,全世界每年約有50萬(wàn)新發(fā)病例[2-3]。手術(shù)切除腫瘤及肝臟移植為當(dāng)前主要治療手段,但其復(fù)發(fā)幾率大,手術(shù)難度大,肝源不足,預(yù)后差[4]。因此,通過(guò)非手術(shù)方法治療中晚期肝癌是重要的補(bǔ)充手段[5]。目前,中藥成為抗腫瘤新藥研發(fā)的新方向[6]。姜黃素(Curcumin,CUR)是從姜科屬植物姜黃的根莖中提取的主要活性成分。研究表明,姜黃素具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的活性,其對(duì)正常細(xì)胞的毒性較低,副作用較小,并且姜黃素還具有抑制HCC生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成及抑制肝星狀細(xì)胞活性、乙肝病毒表達(dá)復(fù)制的作用[7],因此,成為潛在的腫瘤干預(yù)藥物的選擇。

四氫姜黃素(Tetrahydrocurcumin,THC)是姜黃素在體內(nèi)主要的活性代謝產(chǎn)物,自然存在于姜黃中,其結(jié)構(gòu)上缺乏α,β-不飽和羰基部分[8]。四氫姜黃素的結(jié)構(gòu)決定了其獨(dú)特和特異性的分子機(jī)制,從而使其成為預(yù)防和治療癌癥的潛在候選藥物。研究表明,姜黃素可以抑制多種癌癥細(xì)胞。姜黃素在肝臟中被內(nèi)源性還原酶系統(tǒng)還原為四氫姜黃素和六氫姜黃素[9-11]。與姜黃素不同,四氫姜黃素在各種pH值的鹽水和磷酸鹽緩沖液中具有穩(wěn)定性[12]。與姜黃素相比,四氫姜黃素因其較好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度,以及與姜黃素的結(jié)構(gòu)高度相似,成為開(kāi)發(fā)癌癥預(yù)防和治療藥物的有價(jià)值的先導(dǎo)化合物[13]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)和多方面藥理學(xué)等跨學(xué)科理論,揭示了疾病、基因、靶標(biāo)和藥物之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[14-15],能夠更加準(zhǔn)確地找到藥物的治療靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)通過(guò)多途徑調(diào)控信號(hào)通路來(lái)改善藥物治療效果、減少毒副作用以提高新藥臨床試驗(yàn)成功率、節(jié)約藥物研發(fā)費(fèi)用等[16]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為一種篩選治療靶標(biāo)的快速、有效、經(jīng)濟(jì)的方法[14]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究手段,在系統(tǒng)層次上,以生物網(wǎng)絡(luò)為總體視角,解析四氫姜黃素與肝細(xì)胞癌之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律,分析預(yù)測(cè)藥物靶標(biāo)機(jī)制,分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證成分與靶點(diǎn)的相互作用,為其后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 收集和篩選與四氫姜黃素相關(guān)的靶點(diǎn) 本次實(shí)驗(yàn)利用小分子結(jié)構(gòu)的相似性來(lái)預(yù)測(cè)藥物分子的靶點(diǎn),并且以文獻(xiàn)檢索進(jìn)行補(bǔ)充,從而確定THC的作用機(jī)制。首先以“Tetrahydrocurcumin”為關(guān)鍵詞檢索并下載四氫姜黃素的3D化學(xué)結(jié)構(gòu),存儲(chǔ)為mol2格式并上傳至SwissTargetPrediction[17](http://www.swisstargetprediction.ch)中進(jìn)行成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè),下載預(yù)測(cè)結(jié)果,下載完成后,針對(duì)所得到的結(jié)果進(jìn)行篩選,以“概率”值大于0進(jìn)行篩選。此外,通過(guò)探索PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)中以“Tetrahydrocurcumin”為關(guān)鍵字的文獻(xiàn),補(bǔ)充了其他潛在的四氫姜黃素靶標(biāo)。最終,經(jīng)過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org)的處理,所有的靶標(biāo)名稱均已被轉(zhuǎn)化為基因符號(hào)。對(duì)所獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行綜合匯總,并進(jìn)行去重處理。檢索時(shí)間自建庫(kù)至2022年10月。

1.2 收集和篩選與肝細(xì)胞癌相關(guān)的靶點(diǎn) 利用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)[18](https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)[19](https://omim.org/),以關(guān)鍵詞“Hepatocellular carcinoma”進(jìn)行檢索,在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中,疾病靶點(diǎn)的篩選條件為相關(guān)性得分值≥2倍的中位數(shù),合并去重后,獲取肝細(xì)胞癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)。檢索時(shí)間自建庫(kù)至2022年12月。

1.3 四氫姜黃素與肝細(xì)胞癌共同靶點(diǎn)的篩選以及網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)[20]在線韋恩圖分析工具,將四氫姜黃素藥物靶點(diǎn)與肝細(xì)胞癌疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入,繪制韋恩圖,以獲取共同的治療靶標(biāo),將交集靶點(diǎn)作為四氫姜黃素治療肝細(xì)胞癌的潛在靶點(diǎn),并且采用Cytoscape 3.9.1軟件包,對(duì)整理獲得的四氫姜黃素、肝細(xì)胞癌等相關(guān)靶點(diǎn)信息建立網(wǎng)絡(luò)以及進(jìn)行可視化處理,得到“四氫姜黃素-靶點(diǎn)-肝細(xì)胞癌”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選 將四氫姜黃素與肝細(xì)胞癌共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)[21](https://www.string-db.org/),設(shè)置物種為Homo sapiens,其他參數(shù)保持默認(rèn),獲得其PPI網(wǎng)絡(luò)信息,將其導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件[22],使用Centiscape插件[23]對(duì)其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?以度值(Degree)、中介中心性(Betweenness)和接近中心性(Closeness)作為參考值,選出疾病的核心靶點(diǎn)。

1.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 將獲得的四氫姜黃素和肝細(xì)胞癌的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入到Metascape (https://metascape.org)[24]在線富集分析平臺(tái)中,并將該物種設(shè)置為“Homo sapiens”,然后進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,以獲得生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能和代謝途徑。對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行保存,并利用微生信在線可視化處理網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn)進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。檢索時(shí)間自建庫(kù)至2023年3月。

1.6 通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)活性成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接 將四氫姜黃素分子與篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行半柔性分子對(duì)接和結(jié)合構(gòu)象打分。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[25]和PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)[26]中,分別下載THC的2D結(jié)構(gòu)sdf格式的文件和度值(Degree)較高的核心靶點(diǎn)蛋白的PDB格式文件,然后使用ChemBio3D軟件將活性成分sdf格式文件轉(zhuǎn)化為mol2格式文件,并進(jìn)行能量最小化處理[27]。將以上文件一并導(dǎo)入Sybyl2.0軟件[28],以提取靶點(diǎn)蛋白中的配體小分子,并且進(jìn)行去除水分子和加氫等處理,隨后進(jìn)行分子對(duì)接,并利用打分函數(shù)進(jìn)行評(píng)估。制作分子對(duì)接示意圖時(shí),選擇高分結(jié)合構(gòu)象的對(duì)接結(jié)果繪制。

2 結(jié)果

2.1 四氫姜黃素與肝細(xì)胞癌靶點(diǎn)篩選與交集靶點(diǎn)的獲取及網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的構(gòu)建 經(jīng)過(guò)篩選,成功確定114個(gè)四氫姜黃素的作用靶點(diǎn),同時(shí)發(fā)現(xiàn)2 361個(gè)與肝細(xì)胞癌相關(guān)的靶點(diǎn)。共有77個(gè)靶點(diǎn)是重疊于藥物作用和疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和總結(jié),建立重疊靶點(diǎn)的韋恩圖(見(jiàn)圖1)。77個(gè)交集靶點(diǎn)作為四氫姜黃素治療肝細(xì)胞癌的潛在靶點(diǎn),對(duì)潛在靶點(diǎn)信息進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及可視化處理,其“四氫姜黃素-靶點(diǎn)-肝細(xì)胞癌”網(wǎng)絡(luò)如圖2所示。

圖1 四氫姜黃素和肝細(xì)胞癌靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 四氫姜黃素-靶點(diǎn)-肝細(xì)胞癌網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.2 靶蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)將77個(gè)靶點(diǎn)蛋白信息上傳至STRING平臺(tái)并進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,獲得靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用關(guān)系,并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1進(jìn)行可視化處理,以節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),以邊表示各靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。在去除2個(gè)孤立節(jié)點(diǎn)后,構(gòu)建一個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò),其中包含了77個(gè)節(jié)點(diǎn)和767條相互作用連線。PPI網(wǎng)絡(luò)如圖3所示。利用Centiscape插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析,以Degree、Betweenness和Closeness為篩選條件,篩選出16個(gè)核心靶點(diǎn),這些靶點(diǎn)的相關(guān)拓?fù)鋮?shù)見(jiàn)表1。隨著數(shù)值的增加,PPI網(wǎng)絡(luò)中該節(jié)點(diǎn)的重要性也增加,其在生物學(xué)功能方面的作用也可能隨之增強(qiáng)[29]。隨著面積的增大,Degree值也呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢(shì)(圖3)。

表1 四氫姜黃素與肝細(xì)胞癌核心靶點(diǎn)及拓?fù)鋮?shù)

圖3 四氫姜黃素與肝細(xì)胞癌交集靶點(diǎn)蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.3 GO功能富集分析 GO功能富集分析的結(jié)果包括495條生物學(xué)過(guò)程(BP),19條細(xì)胞組分(CC)和39條分子功能(MF)。根據(jù)P值排序,隨著P值的增大和顏色的變紅,所代表的富集程度也隨之增加。分別挑選出排名前10的富集結(jié)果作為氣泡圖,由圖4可見(jiàn),核心靶點(diǎn)所涉及到的與癌癥相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程主要有酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路(Enzyme-linked receptor protein signaling pathway)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路(Transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway)、細(xì)胞對(duì)氧水平降低的反應(yīng)(Cellular response to decreased oxygen levels)等,細(xì)胞組分主要涉及到膜閥(Membrane raft)、內(nèi)吞囊泡(Endocytic vesicle)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(RNA polymerase II transcription regulator complex)等,分子功能主要包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(Transcription factor binding)、核受體活性(Nuclear receptor activity)、蛋白激酶結(jié)合(Protein kinase binding)等。

圖4 四氫姜黃素與肝細(xì)胞癌核心靶點(diǎn)GO富集分析氣泡圖

2.4 KEGG通路富集分析 據(jù)KEGG通路富集分析結(jié)果所示,涉及核心靶點(diǎn)的通路數(shù)量高達(dá)97條。根據(jù)P值排序,隨著P值的增大和顏色的變紅,所代表的富集程度也增加,因此,需要對(duì)前30位進(jìn)行篩選并繪制氣泡圖(見(jiàn)圖5)。涉及的信號(hào)通路中,癌癥的通路(Pathways in cancer)、化學(xué)致癌受體激活(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、PI3K-AKT信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)等均與HCC相關(guān),并且四氫姜黃素可能對(duì)前列腺癌(Prostate cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer)、乳腺癌(Breastcancer)等具有治療作用。

圖5 四氫姜黃素與肝細(xì)胞癌核心靶點(diǎn)KEGG富集分析氣泡圖

2.5 分子對(duì)接 為了驗(yàn)證藥物和篩選的16個(gè)核心靶點(diǎn)的結(jié)合活性,我們通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)中藥成分和蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證。將經(jīng)過(guò)篩選的16個(gè)核心靶點(diǎn)與THC進(jìn)行分子對(duì)接,以Total Score≥5的打分函數(shù)為閾值,結(jié)合自由能越小,配體與受體的結(jié)合越穩(wěn)定,Total Score值越大,表明活性成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合效果較好,Total Score>7則表明結(jié)合活性極強(qiáng)[30]。表2中呈現(xiàn)了分子對(duì)接的結(jié)果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,四氫姜黃素成功地與16個(gè)核心靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)對(duì)接。四氫姜黃素與PIK3CA、KDR、EGFR、MMP9、HSP90AA1、STAT3、PPARG、MTOR、AR均有強(qiáng)烈的結(jié)合活性,并且與AKT1、TP53、CASP3、MDM2、ESR1、HIF1A結(jié)合活性較好,與SRC的結(jié)合活性一般。PIK3CA靶點(diǎn)蛋白與四氫姜黃素的對(duì)接反應(yīng)評(píng)分最高。分子對(duì)接示意圖見(jiàn)圖6。THC通過(guò)9個(gè)氫鍵嵌入在PIK3CA的TYR836、VAL851、SER854、ASP810等氨基酸殘基所形成的疏水性口袋中,結(jié)合活性強(qiáng)。

表2 四氫姜黃素與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接評(píng)分

圖6 四氫姜黃素與PIK3CA分子對(duì)接示意圖

3 討論

20世紀(jì)90年代以來(lái),中藥抗癌藥物逐漸成為抗腫瘤藥物研發(fā)的新方向[31]。2022年,Chen[32]等通過(guò)研究姜黃素治療HCC,證實(shí)了藥物通過(guò)AMPK/ULK1自噬通路對(duì)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生影響。肝臟是體內(nèi)能量代謝的主要場(chǎng)所,AMPK是能量代謝的主要傳感器。糖酵解是肝腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生能量的基本過(guò)程。AMPK可以通過(guò)抑制糖酵解來(lái)治療HCC。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,姜黃素可以通過(guò)p53途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并通過(guò)AMPK/ULK 1途徑促進(jìn)自噬,從而降低肝癌細(xì)胞HepG 2的存活率,達(dá)到治療肝癌的目的[32]。研究表明,姜黃素口服生物利用度低,經(jīng)歷廣泛的代謝后,血液中姜黃素濃度低,但其仍然具有抗癌作用,表明可能是姜黃素代謝物在體內(nèi)仍有藥理作用[33-34]。四氫姜黃素作為體內(nèi)主要的姜黃素代謝產(chǎn)物,具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度以及與姜黃素的高度結(jié)構(gòu)相似性。盡管四氫姜黃素缺乏α,β-不飽和羰基部分,但是其以不同的酮-烯醇形式和其他類似物方式存在[35],這些類似物可能是四氫姜黃素具有不同于姜黃素的功能和作用機(jī)制的原因之一。

本研究通過(guò)小分子結(jié)構(gòu)相似性進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),并結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行相關(guān)藥物靶點(diǎn)補(bǔ)充,找到16個(gè)四氫姜黃素治療肝細(xì)胞癌的潛在核心作用靶點(diǎn),包括AKT1、CASP3、MDM2、KDR、PIK3CA、STAT3、TP53、EGFR等。經(jīng)過(guò)GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析,結(jié)果表明,這些靶點(diǎn)主要分布于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、膜閥、內(nèi)吞囊泡等部位,并且具有與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合等功能,參與細(xì)胞對(duì)化學(xué)壓力的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)及細(xì)胞對(duì)氧含量降低的反應(yīng)等多種生理過(guò)程,參與調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路,參與在癌癥中PD-L1的表達(dá)以及PD-1檢查點(diǎn)信號(hào)通路、HIF-1等信號(hào)通路,這些均表明,THC可作用于多個(gè)靶點(diǎn)和通路,以達(dá)到抑制HCC的效果。THC與多個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接結(jié)果呈現(xiàn)出較高的結(jié)合力和結(jié)合活性,驗(yàn)證了此結(jié)論。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是介導(dǎo)腫瘤血管生成的主要物質(zhì)[36],KDR所編碼的蛋白是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(Vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)[37]。研究表明,在植入肝癌細(xì)胞系HepG2異種移植瘤的BALB/c-裸鼠中,每天口服3 000 mg/kg四氫姜黃素,可顯著降低腫瘤組織內(nèi)的毛細(xì)血管密度[38]。在分子水平上,四氫姜黃素觸發(fā)線粒體依賴性級(jí)聯(lián)反應(yīng),p53上調(diào)并降低MDM2以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[39]。分子對(duì)接結(jié)果也同樣顯示,四氫姜黃素能與KDR、TP53以及MDM2靶點(diǎn)蛋白穩(wěn)定結(jié)合。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對(duì)四氫姜黃素進(jìn)行了潛在的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和信號(hào)通路分析,從多角度探討其在預(yù)防和治療肝細(xì)胞癌方面的潛在作用機(jī)制。利用分子對(duì)接技術(shù),驗(yàn)證了藥物成分與各核心靶點(diǎn)的結(jié)合活性。目前,四氫姜黃素治療肝細(xì)胞癌的相關(guān)研究報(bào)道很少,本研究主要通過(guò)生物信息學(xué)分析方法對(duì)四氫姜黃素在肝細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)情況及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行深入預(yù)測(cè),為繼續(xù)研究四氫姜黃素抗肝細(xì)胞癌作用的潛在靶點(diǎn)提供了理論參考,同時(shí)為現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)驗(yàn)證四氫姜黃素對(duì)抗肝細(xì)胞癌的作用及分子機(jī)制提供了依據(jù),有助于深入了解四氫姜黃素抗肝細(xì)胞癌作用的分子機(jī)制,從而為臨床肝細(xì)胞癌治療提供參考。