高 旺,田 欣,姬林娟,郭俊芳,陶艾彬,芮 濤,姚永偉

0 引言

白細胞介素-33(Interleukin-33,IL-33)是白介素-1家族成員,在組織受損時從壞死或凋亡的細胞中釋放出來[1],通過與其受體生長刺激表達因子2(Growth stimulation expressed gene 2,ST2)結合,抑制細胞凋亡[2]。既往研究表明,IL-33在許多心血管疾病中具有心臟保護作用。在壓力超負荷模型中,IL-33治療可明顯改善ST2野生型小鼠心肌肥厚和纖維化,并提高其存活率[3]。在大鼠心肌梗死模型中,IL-33通過誘導抗凋亡因子的表達,抑制心肌細胞凋亡,改善預后[4]。在阿霉素誘導的心肌損傷中,IL-33抑制活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的釋放,調節(jié)ASK1/JNK信號通路,減輕心肌細胞凋亡[5]。盡管近年來對IL-33進行了廣泛的研究,但其心臟保護作用的潛在機制尚不明確,尤其是IL-33對心肌缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)損傷的影響。本研究旨在探討IL-33在心肌細胞缺氧/復氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷中的作用,并進一步揭示其作用機制,為治療心肌I/R損傷開拓新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑 10% 胎牛血清購自美國Gibco公司。M199 培養(yǎng)基購自美國Sigma公司。Liberase、細胞凋亡ELISA檢測試劑盒和原位細胞凋亡染色檢測試劑盒購自美國 Roche公司。miR-19a-3p 模擬物(mimic)、miR-19a-3p 抑制劑(inhibitor),pc DNA-MAPK6質粒及其相應陰性對照(pcDNA) 購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司。Lipofectamine 2000 轉染試劑、TRIZOL 試劑購自美國Invitrogen公司。Prime ScriptTMRT 逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司。SYBR?Green Supermix 試劑盒購自美國Bio-Rad公司。miScript SYBR Green PCR試劑盒購自德國Qiagen公司。MAPK6和β-actin抗體均購自美國Abcam公司。雙熒光素酶報告基因測定試劑盒購自美國Promega公司。Caspase-3活性檢測試劑盒購自美國Enzo公司。

1.2 心肌細胞培養(yǎng)與轉染 取新生小鼠(1～3日齡)心臟切碎,Liberase (10 mg/ml) 消化心臟組織,反復輕柔吹打后收集懸浮細胞,150 g離心5 min。將沉淀細胞重新懸浮于含有10% 胎牛血清的M199培養(yǎng)基中。37 ℃預培養(yǎng)2 h后,去除非貼壁細胞,將貼壁細胞重懸于培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h,直至心肌細胞達到80%融合。按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書所示的轉染步驟,分別將miR-19a-3p mimic、miR-19a-3p inhibitor、miR-NC、pcDNA-MAPK6重組質?；騪cDNA質粒轉入心肌細胞內。首先使用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋擬轉染的miRNA,將其按1∶1的體積比加入到Lipofectamine 2000轉染試劑中。在室溫下孵育5 min,再將該(miRNA-脂質體)混合物加入到心肌細胞培養(yǎng)基中,37 ℃繼續(xù)孵育1～3 d。通過RT-qPCR法檢驗轉染效果。

MAPK6序列插入pcDNA載體,以構建 pcDNA-MAPK6質粒,并將空pcDNA質粒作為陰性對照。將 pcDNA-MAPK6和pcDNA質粒通過Lipofectamine 2000轉染心肌細胞。具體方法同上。37 ℃下繼續(xù)孵育1～3 d用于后續(xù)實驗。

1.3 缺氧復氧模型 心肌細胞在無血清DMEM和厭氧條件(95%N2和5%CO2)中孵育6 h以誘導缺氧。隨后,將細胞在常氧條件下培養(yǎng)24 h以誘導復氧,構建缺氧/復氧(H/R)模型。常氧條件下的細胞 (常氧/復氧,N/R)作為對照。

1.4 細胞處理及分組 (1)用不同濃度IL-33(0,1,5,10,20 ng/ml)預處理,每組各取樣本3例,樣本總量為15例。根據實驗結果選取適當IL-33預處理濃度進行后續(xù)實驗,然后根據是否進行H/R處理分為對照組(NC)、H/R組、IL-33+H/R組、IL-33組,每組各取樣本4例,樣本總量為16例;根據是否使用IL-33預處理和不同的復氧時間(0,30,60,120,240 min)將心肌細胞進行分組,每組各取樣本3例,樣本總量為30例;根據是否轉染miR-19a-3p mimic、IL-33預處理或H/R處理將心肌細胞分為miR-NC組、IL-33+miR-NC組、miR-19a-3p mimic組、IL-33+miR-19a-3p mimic組、H/R+miR-NC組、H/R+IL-33+miR-NC組、H/R+miR-19a-3p mimic組、H/R+IL-33+miR-19a-3p mimic組,每組各取樣本3例,樣本總量24例。

(2)用miR-19a-3p mimic、miR-19a-3p inhibitor及miR-NC分別轉染心肌細胞,將其分為miR-19a-3p mimic組、miR-19a-3p inhibitor組及miR-NC組,每組各取樣本3例,樣本總量為9例。

(3)經H/R處理后,根據是否使用IL-33預處理,將其分為N/R組、H/R組、H/R+IL-33及IL-33組,每組各取樣本3例,樣本總量為12例;用pcDNA-MAPK6或pcDNA轉染心肌細胞,將其分為對照組(NC)、pcDNA-MAPK6組及pcDNA組,每組各取樣本3例,樣本總量為9例;根據是否使用IL-33預處理、pcDNA-MAPK6轉染心肌細胞或者H/R處理,將其分為pcDNA組、IL-33+pcDNA組、pcDNA-MAPK6組、IL-33+pcDNA-MAPK6組、H/R+pcDNA組、H/R+IL-33+pcDNA組、H/R+pcDNA-MAPK6組、H/R+IL-33+pcDNA-MAPK6組,每組各取樣本3例,樣本總量為24例。

(4)根據是否使用miR-19a-3p mimic轉染心肌細胞或H/R處理,分為對照組、H/R組、H/R+miR-NC組、H/R+miR-19a-3p mimic組,每組各取樣本3例,樣本總量為12例;根據是否使用miR-19a-3p inhibitor轉染心肌細胞、IL-33預處理或H/R處理,將其分為對照組、H/R組、H/R+IL-33組、H/R+IL-33+miR-19a-3p inhibitor組、H/R+IL-33+miR-NC組,每組各取樣本3例,樣本總量為15例。

1.5 實時熒光定量PCR 用TRIZOL試劑處理,從心肌細胞中提取總RNA,使用Prime ScriptTMRT 試劑盒對 cDNA 進行逆轉錄,并通過 iTaqTM通用SYBR?Green Supermix測定 mRNA 水平。按照說明,用miScript SYBR Green PCR試劑盒對miR-19a-3p的表達進行定量。通過2-ΔΔCt法計算mRNAs和miR-19a-3p的相對表達水平,分別以GAPDH和U6作為內參。miR-19a-3p上游引物:5′-CTGGAGTGTGCAAATCTATGC-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;MAPK6 上游引物:5′-ACTTGGTGCTGAAGATAG-3′,下游引物:5′-TGAGAAGCTCCTGACGAT-3′;GAPDH上游引物:5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′,下游引物:5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCAGCACATATA-3′,下游引物:5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′。

1.6 雙熒光素酶基因報告檢測 將MAPK6 mRNA序列的3′UTR插入PMIRGLO雙熒光素酶miRNA靶向表達載體,構建野生型PMIRGLO-MAPK6 3′UTR (MAPK6-3′UTR-WT)。同時,通過定點突變MAPK6 3′UTR中的miR-19a-3p結合位點,構建PMIRGLO-MAPK6 3′UTR突變體(MAPK6-3′UTR-MUT)。在miRNA過表達實驗中,用miR-19a-3p mimic或miR-NC轉染心肌細胞;在miRNA抑制實驗中,用miR-19a-3p inhibitor或miR-NC共轉染心肌細胞。根據雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書所述步驟檢測熒光素酶活性。

1.7 蛋白表達檢測 從每個細胞培養(yǎng)孔中裂解并刮取心肌細胞,離心后獲得蛋白質樣品,并測定其濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。分別與MAPK6抗體 (1∶1 000)和β-actin抗體 (內參,1∶6 000)在4 ℃下孵育過夜。然后將膜與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。最終,通過ECL發(fā)光液,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光,獲得可視化特異條帶,通過Image-J系統(tǒng)分析條帶的灰度值。

1.8 細胞凋亡檢測 Caspase-3 活性試劑盒測定Caspase-3活性,待細胞裂解后,把5 μl 4 mM DEVD-p-NA底物、50 μl反應緩沖液和細胞上清液(50 μl/孔)在37 ℃下孵育2 h。借助微孔板讀取器測定405 nm處光密度值(OD)。Caspase-3活性(%)=(實驗組OD值/control組OD值)×100%。

通過細胞凋亡ELISA檢測試劑盒測定片段化DNA。用試劑盒內裂解液把細胞裂解充分,離心后轉移裂解液上清到鏈霉素包裹的96孔板,然后加入試劑盒內生物素標記抗組蛋白抗體、過氧化物酶標記的抗DNA單克隆抗體,放置室溫下孵育2 h,最后分光光度計檢測405 nm處的細胞凋亡狀態(tài)。

原位細胞凋亡染色實驗中,收集實驗組、對照組貼壁及漂浮的所有細胞,PBS清洗2次,之后加入PBS制作細胞懸液,涂在載玻片上自然晾干,然后放置于4%多聚甲醛中,室溫固定30 min,0.1% Triton X-100浸潤,使用原位細胞凋亡染色檢測試劑盒對凋亡DNA片段進行DAPI末端標記。熒光顯微鏡觀察DAPI標記的TUNEL陽性細胞并拍照,隨機選擇5個區(qū)域,計算凋亡細胞百分比。

2 結果

2.1 IL-33通過調節(jié)miR-19a-3p減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡 與對照組相比,H/R增加心肌細胞凋亡,IL-33單獨作用不影響心肌細胞的凋亡,但是以劑量依賴的方式減少了H/R誘導的細胞凋亡(P<0.05,圖1A、1B),并選擇IL-33濃度為10 ng/ml進行后續(xù)實驗。H/R后miR-19a-3p水平降低,然而與不同復氧時間的H/R組相比,IL-33預處理組中miR-19a-3p的降低消失 (P<0.05,圖1C)。與H/R組的心肌細胞相比,無論轉染miR-19a-3p mimic或IL-33預處理,都可以減輕H/R誘導的細胞凋亡 (P<0.05,圖1D)。

圖1 IL-33通過miR-19a-3p影響H/R誘導的心肌細胞凋亡

2.2 MAPK6是miR-19a-3p的靶基因 檢索TargetScan數據庫,發(fā)現(xiàn)MAPK6與miR-19a-3p存在潛在的結合位點(圖2A)。雙熒光素酶報告基因檢測顯示,miR-19a-3p mimic可抑制MAPK6-WT組的熒光素酶活性,而不影響MAPK6-MUT 組熒光素酶活性 (t=10.22,P<0.05) (圖2B)。miR-19a-3p mimic抑制了心肌細胞中MAPK6 mRNA(t=3.65,P<0.05)和蛋白表達(t=3.38,P<0.05)(圖2C)。miR-19a-3p inhibitor可增加MAPK6-WT組的熒光素酶活性,而不影響MAPK6-MUT組熒光素酶活性 (t=8.48,P<0.05) (圖2D)。且miR-19a-3p inhibitor促進了MAPK6 mRNA (t=4.29,P<0.05)和蛋白表達(t=3.74,P<0.05)(圖2E)。結果表明,miR-19a-3p可以負向調控 MAPK6。

圖2 miR-19a-3p對靶基因MAPK6的影響

2.3 IL-33通過MAPK6影響心肌細胞凋亡 與對照組相比,H/R組心肌細胞MAPK6的表達上調。此外,IL-33單獨作用并不影響MAPK6的表達,但逆轉了H/R誘導的MAPK6 mRNA (t=4.41,P<0.05,圖3A)和蛋白 (t=2.74,P<0.05,圖3B)的表達上調。經H/R處理后,與轉入空載pcDNA質粒的心肌細胞相比,轉入pcDNA-MAPK6重組質粒后,心肌細胞MAPK6蛋白表達上調 (t=9.70,P<0.05,圖3C)。IL-33能抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡,而轉入pcDNA-MAPK6的心肌細胞,由于MAPK6表達增加,減弱了IL-33對H/R的抗凋亡作用(P<0.05,圖3D)。結果表明,IL-33通過下調MAPK6表達,減弱H/R誘導的心肌細胞凋亡。

圖3 IL-33通過MAPK6減少心肌細胞凋亡

2.4 IL-33在H/R損傷中參與調控miR-19a-3p/MAPK6通路 與轉入miR-NC的心肌細胞相比,轉入miR-19a-3p mimic后,抑制了H/R誘導的MAPK6 mRNA (t=8.42,P<0.05,圖4A) 和蛋白(t=5.79,P<0.05,圖4B)表達上調。與單純H/R處理的心肌細胞相比,IL-33預處理可以抑制H/R誘導的MAPK6 mRNA和蛋白的表達上調 (P<0.05)。與IL-33預處理相比,IL-33預處理的心肌細胞轉入miR-NC后,MAPK6表達無明顯變化。而IL-33預處理的心肌細胞轉入miR-19a-3p inhibitor后,MAPK6 mRNA和蛋白的表達增加 (P<0.05,圖4C、4D),即敲低miR-19a-3p消除了IL-33對H/R誘導MAPK6表達上調的影響。

圖4 IL-33在H/R損傷中參與調控miR-19a-3p/MAPK6通路

3 討論

急性心肌梗死是導致我國居民死亡的主要原因之一,盡早達到有效的心肌再灌注是急性心肌梗死救治的核心。然而,血流的突然開通往往會引起惡性心律失常、無復流,從而導致心肌損傷進一步加重,即心肌缺血/再灌注損傷[6-7]。目前認為,缺血心肌在血流恢復后,由于能量代謝障礙、鈣離子超負荷和自由基大量生成等原因,導致心肌超微結構、功能、代謝及電生理等方面的進一步損害,這是導致心肌缺血/再灌注損傷的主要原因[8-9],但其機制尚不明確。

Micro RNAs(miRNAs)是一類非編碼的單鏈小分子RNA,通過與靶基因mRNAs的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結合來負性調控基因表達[10]。越來越多的證據表明,miRNAs在心肌I/R損傷中起關鍵作用[11]。Hinkel等[12]發(fā)現(xiàn),在豬I/R損傷模型中,抗miRNA-21治療可預防I/R損傷引起的心力衰竭。另有研究發(fā)現(xiàn),在經H/R誘導的H9c2細胞中,miR-374a-5p水平降低,而miR-374a-5p過表達可減少心肌H/R損傷[13]。作為miR-17-92基因簇的重要成員,miR-19a首先被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[14]。一系列研究證實了miR-19a在心力衰竭、心肌梗死、心肌纖維化和心肌肥厚等病理生理機制中起重要作用[15-18]。Sun等[19]研究表明,與陰性對照組相比,心肌H/R損傷后,miR-19a的表達明顯減少。本研究也顯示,在H/R損傷后,miR-19a-3p的表達水平降低。此外,miR-19a-3p mimic轉染能增加miR-19a-3p的表達,從而有效抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡。上述結果表明,H/R損傷可降低miR-19a-3p,而miR-19a-3p水平的升高可以減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡。已知H/R損傷可以誘導心肌細胞凋亡,而IL-33同時具有抗氧化和抗凋亡等心肌保護作用。在心肌I/R損傷模型中,Rui等[20]證明了外源性IL-33通過抑制PKCβ/JNK通路,減輕I/R誘導的氧化應激,最終減弱心肌細胞凋亡。Ruisong等[21]研究表明,IL-33通過調控p38 MAPK和HMGB1信號通路,抑制心肌細胞凋亡,減輕心肌I/R損傷。本研究結果表明,H/R損傷增加心肌細胞的凋亡,而IL-33以劑量依賴性的方式顯著逆轉了這一趨勢,這與之前發(fā)表的研究結論相一致[4]。此外,IL-33增加了心肌miR-19a-3p的表達,這是導致減少H/R損傷的重要原因。既往研究顯示,IL-33對多種miRNAs具有調節(jié)作用。Lopetuso等[22]發(fā)現(xiàn),IL-33能夠刺激miR-320的表達,從而促進急性結腸炎中結腸上皮細胞的修復。Zhou等[23]研究顯示,IL-33調節(jié)miR-128-3p的表達,從而促進非小細胞肺癌細胞的增殖。本研究中,IL-33增加了心肌miR-19a-3p的表達,但其發(fā)生機制尚不明確。有研究表明,IL-33可抑制I/R損傷中ROS的釋放,而ROS可通過轉錄因子p53和NF-κB來調控某些特定的miRNAs的表達[24-25]。據此,推測IL-33可能通過調控ROS的激活而影響miR-19a-3p的表達,或直接干預miR-19a-3p的轉錄過程。

MAPKs屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,能被細胞外多種炎癥因子刺激,進而調節(jié)基因表達、細胞存活和凋亡[26]。盡管MAPK6在多種細胞中均有表達,但由于其缺乏經典MAPKs通路中保守的Thr-x-Tyr基序,導致有關MAPK6激活的確切分子機制研究甚少[27]。研究表明,IL-33通過抑制p38 MAPK信號通路,減少心肌I/R損傷[21],而MAPK6作為非典型MAPK成員之一,其過表達可促進H/R損傷誘導的細胞凋亡[28]。本研究顯示,H/R損傷增加了MAPK6表達,而IL-33預處理可逆轉MAPK6的過表達。根據生物信息學分析,本研究,預測MAPK6為miR-19a-3p的靶基因,并通過雙熒光素酶報告基因實驗加以證實。此外,轉染miR-19a-3p mimic可顯著抑制MAPK6的表達,減輕心肌細胞凋亡,而轉染miR-19a-3p inhibitor結果相反。結果表明,miR-19a-3p通過抑制MAPK6的表達,減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡。

綜上所述,本研究證實了miR-19a-3p/MAPK6通路在IL-33抗H/R誘導的心肌細胞凋亡中的重要作用,為心肌H/R損傷提供了新的潛在治療靶點和理論依據。