高 旺,田 欣,姬林娟,郭俊芳,陶艾彬,芮 濤,姚永偉

0 引言

白細(xì)胞介素-33(Interleukin-33,IL-33)是白介素-1家族成員,在組織受損時(shí)從壞死或凋亡的細(xì)胞中釋放出來[1],通過與其受體生長(zhǎng)刺激表達(dá)因子2(Growth stimulation expressed gene 2,ST2)結(jié)合,抑制細(xì)胞凋亡[2]。既往研究表明,IL-33在許多心血管疾病中具有心臟保護(hù)作用。在壓力超負(fù)荷模型中,IL-33治療可明顯改善ST2野生型小鼠心肌肥厚和纖維化,并提高其存活率[3]。在大鼠心肌梗死模型中,IL-33通過誘導(dǎo)抗凋亡因子的表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡,改善預(yù)后[4]。在阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷中,IL-33抑制活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的釋放,調(diào)節(jié)ASK1/JNK信號(hào)通路,減輕心肌細(xì)胞凋亡[5]。盡管近年來對(duì)IL-33進(jìn)行了廣泛的研究,但其心臟保護(hù)作用的潛在機(jī)制尚不明確,尤其是IL-33對(duì)心肌缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)損傷的影響。本研究旨在探討IL-33在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷中的作用,并進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制,為治療心肌I/R損傷開拓新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 10% 胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。M199 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Liberase、細(xì)胞凋亡ELISA檢測(cè)試劑盒和原位細(xì)胞凋亡染色檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó) Roche公司。miR-19a-3p 模擬物(mimic)、miR-19a-3p 抑制劑(inhibitor),pc DNA-MAPK6質(zhì)粒及其相應(yīng)陰性對(duì)照(pcDNA) 購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司。Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、TRIZOL 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Prime ScriptTMRT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。SYBR?Green Supermix 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。miScript SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。MAPK6和β-actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Enzo公司。

1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 取新生小鼠(1～3日齡)心臟切碎,Liberase (10 mg/ml) 消化心臟組織,反復(fù)輕柔吹打后收集懸浮細(xì)胞,150 g離心5 min。將沉淀細(xì)胞重新懸浮于含有10% 胎牛血清的M199培養(yǎng)基中。37 ℃預(yù)培養(yǎng)2 h后,去除非貼壁細(xì)胞,將貼壁細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h,直至心肌細(xì)胞達(dá)到80%融合。按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書所示的轉(zhuǎn)染步驟,分別將miR-19a-3p mimic、miR-19a-3p inhibitor、miR-NC、pcDNA-MAPK6重組質(zhì)?；騪cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入心肌細(xì)胞內(nèi)。首先使用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋擬轉(zhuǎn)染的miRNA,將其按1∶1的體積比加入到Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑中。在室溫下孵育5 min,再將該(miRNA-脂質(zhì)體)混合物加入到心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中,37 ℃繼續(xù)孵育1～3 d。通過RT-qPCR法檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效果。

MAPK6序列插入pcDNA載體,以構(gòu)建 pcDNA-MAPK6質(zhì)粒,并將空pcDNA質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。將 pcDNA-MAPK6和pcDNA質(zhì)粒通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞。具體方法同上。37 ℃下繼續(xù)孵育1～3 d用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 缺氧復(fù)氧模型 心肌細(xì)胞在無(wú)血清DMEM和厭氧條件(95%N2和5%CO2)中孵育6 h以誘導(dǎo)缺氧。隨后,將細(xì)胞在常氧條件下培養(yǎng)24 h以誘導(dǎo)復(fù)氧,構(gòu)建缺氧/復(fù)氧(H/R)模型。常氧條件下的細(xì)胞 (常氧/復(fù)氧,N/R)作為對(duì)照。

1.4 細(xì)胞處理及分組 (1)用不同濃度IL-33(0,1,5,10,20 ng/ml)預(yù)處理,每組各取樣本3例,樣本總量為15例。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取適當(dāng)IL-33預(yù)處理濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),然后根據(jù)是否進(jìn)行H/R處理分為對(duì)照組(NC)、H/R組、IL-33+H/R組、IL-33組,每組各取樣本4例,樣本總量為16例;根據(jù)是否使用IL-33預(yù)處理和不同的復(fù)氧時(shí)間(0,30,60,120,240 min)將心肌細(xì)胞進(jìn)行分組,每組各取樣本3例,樣本總量為30例;根據(jù)是否轉(zhuǎn)染miR-19a-3p mimic、IL-33預(yù)處理或H/R處理將心肌細(xì)胞分為miR-NC組、IL-33+miR-NC組、miR-19a-3p mimic組、IL-33+miR-19a-3p mimic組、H/R+miR-NC組、H/R+IL-33+miR-NC組、H/R+miR-19a-3p mimic組、H/R+IL-33+miR-19a-3p mimic組,每組各取樣本3例,樣本總量24例。

(2)用miR-19a-3p mimic、miR-19a-3p inhibitor及miR-NC分別轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,將其分為miR-19a-3p mimic組、miR-19a-3p inhibitor組及miR-NC組,每組各取樣本3例,樣本總量為9例。

(3)經(jīng)H/R處理后,根據(jù)是否使用IL-33預(yù)處理,將其分為N/R組、H/R組、H/R+IL-33及IL-33組,每組各取樣本3例,樣本總量為12例;用pcDNA-MAPK6或pcDNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,將其分為對(duì)照組(NC)、pcDNA-MAPK6組及pcDNA組,每組各取樣本3例,樣本總量為9例;根據(jù)是否使用IL-33預(yù)處理、pcDNA-MAPK6轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞或者H/R處理,將其分為pcDNA組、IL-33+pcDNA組、pcDNA-MAPK6組、IL-33+pcDNA-MAPK6組、H/R+pcDNA組、H/R+IL-33+pcDNA組、H/R+pcDNA-MAPK6組、H/R+IL-33+pcDNA-MAPK6組,每組各取樣本3例,樣本總量為24例。

(4)根據(jù)是否使用miR-19a-3p mimic轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞或H/R處理,分為對(duì)照組、H/R組、H/R+miR-NC組、H/R+miR-19a-3p mimic組,每組各取樣本3例,樣本總量為12例;根據(jù)是否使用miR-19a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞、IL-33預(yù)處理或H/R處理,將其分為對(duì)照組、H/R組、H/R+IL-33組、H/R+IL-33+miR-19a-3p inhibitor組、H/R+IL-33+miR-NC組,每組各取樣本3例,樣本總量為15例。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用TRIZOL試劑處理,從心肌細(xì)胞中提取總RNA,使用Prime ScriptTMRT 試劑盒對(duì) cDNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,并通過 iTaqTM通用SYBR?Green Supermix測(cè)定 mRNA 水平。按照說明,用miScript SYBR Green PCR試劑盒對(duì)miR-19a-3p的表達(dá)進(jìn)行定量。通過2-ΔΔCt法計(jì)算mRNAs和miR-19a-3p的相對(duì)表達(dá)水平,分別以GAPDH和U6作為內(nèi)參。miR-19a-3p上游引物:5′-CTGGAGTGTGCAAATCTATGC-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;MAPK6 上游引物:5′-ACTTGGTGCTGAAGATAG-3′,下游引物:5′-TGAGAAGCTCCTGACGAT-3′;GAPDH上游引物:5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′,下游引物:5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCAGCACATATA-3′,下游引物:5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′。

1.6 雙熒光素酶基因報(bào)告檢測(cè) 將MAPK6 mRNA序列的3′UTR插入PMIRGLO雙熒光素酶miRNA靶向表達(dá)載體,構(gòu)建野生型PMIRGLO-MAPK6 3′UTR (MAPK6-3′UTR-WT)。同時(shí),通過定點(diǎn)突變MAPK6 3′UTR中的miR-19a-3p結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建PMIRGLO-MAPK6 3′UTR突變體(MAPK6-3′UTR-MUT)。在miRNA過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,用miR-19a-3p mimic或miR-NC轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞;在miRNA抑制實(shí)驗(yàn)中,用miR-19a-3p inhibitor或miR-NC共轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞。根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明書所述步驟檢測(cè)熒光素酶活性。

1.7 蛋白表達(dá)檢測(cè) 從每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中裂解并刮取心肌細(xì)胞,離心后獲得蛋白質(zhì)樣品,并測(cè)定其濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。分別與MAPK6抗體 (1∶1 000)和β-actin抗體 (內(nèi)參,1∶6 000)在4 ℃下孵育過夜。然后將膜與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。最終,通過ECL發(fā)光液,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光,獲得可視化特異條帶,通過Image-J系統(tǒng)分析條帶的灰度值。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè) Caspase-3 活性試劑盒測(cè)定Caspase-3活性,待細(xì)胞裂解后,把5 μl 4 mM DEVD-p-NA底物、50 μl反應(yīng)緩沖液和細(xì)胞上清液(50 μl/孔)在37 ℃下孵育2 h。借助微孔板讀取器測(cè)定405 nm處光密度值(OD)。Caspase-3活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/control組OD值)×100%。

通過細(xì)胞凋亡ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定片段化DNA。用試劑盒內(nèi)裂解液把細(xì)胞裂解充分,離心后轉(zhuǎn)移裂解液上清到鏈霉素包裹的96孔板,然后加入試劑盒內(nèi)生物素標(biāo)記抗組蛋白抗體、過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA單克隆抗體,放置室溫下孵育2 h,最后分光光度計(jì)檢測(cè)405 nm處的細(xì)胞凋亡狀態(tài)。

原位細(xì)胞凋亡染色實(shí)驗(yàn)中,收集實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組貼壁及漂浮的所有細(xì)胞,PBS清洗2次,之后加入PBS制作細(xì)胞懸液,涂在載玻片上自然晾干,然后放置于4%多聚甲醛中,室溫固定30 min,0.1% Triton X-100浸潤(rùn),使用原位細(xì)胞凋亡染色檢測(cè)試劑盒對(duì)凋亡DNA片段進(jìn)行DAPI末端標(biāo)記。熒光顯微鏡觀察DAPI標(biāo)記的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞并拍照,隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域,計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

2 結(jié)果

2.1 IL-33通過調(diào)節(jié)miR-19a-3p減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比,H/R增加心肌細(xì)胞凋亡,IL-33單獨(dú)作用不影響心肌細(xì)胞的凋亡,但是以劑量依賴的方式減少了H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.05,圖1A、1B),并選擇IL-33濃度為10 ng/ml進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。H/R后miR-19a-3p水平降低,然而與不同復(fù)氧時(shí)間的H/R組相比,IL-33預(yù)處理組中miR-19a-3p的降低消失 (P<0.05,圖1C)。與H/R組的心肌細(xì)胞相比,無(wú)論轉(zhuǎn)染miR-19a-3p mimic或IL-33預(yù)處理,都可以減輕H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 (P<0.05,圖1D)。

圖1 IL-33通過miR-19a-3p影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

2.2 MAPK6是miR-19a-3p的靶基因 檢索TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)MAPK6與miR-19a-3p存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示,miR-19a-3p mimic可抑制MAPK6-WT組的熒光素酶活性,而不影響MAPK6-MUT 組熒光素酶活性 (t=10.22,P<0.05) (圖2B)。miR-19a-3p mimic抑制了心肌細(xì)胞中MAPK6 mRNA(t=3.65,P<0.05)和蛋白表達(dá)(t=3.38,P<0.05)(圖2C)。miR-19a-3p inhibitor可增加MAPK6-WT組的熒光素酶活性,而不影響MAPK6-MUT組熒光素酶活性 (t=8.48,P<0.05) (圖2D)。且miR-19a-3p inhibitor促進(jìn)了MAPK6 mRNA (t=4.29,P<0.05)和蛋白表達(dá)(t=3.74,P<0.05)(圖2E)。結(jié)果表明,miR-19a-3p可以負(fù)向調(diào)控 MAPK6。

圖2 miR-19a-3p對(duì)靶基因MAPK6的影響

2.3 IL-33通過MAPK6影響心肌細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比,H/R組心肌細(xì)胞MAPK6的表達(dá)上調(diào)。此外,IL-33單獨(dú)作用并不影響MAPK6的表達(dá),但逆轉(zhuǎn)了H/R誘導(dǎo)的MAPK6 mRNA (t=4.41,P<0.05,圖3A)和蛋白 (t=2.74,P<0.05,圖3B)的表達(dá)上調(diào)。經(jīng)H/R處理后,與轉(zhuǎn)入空載pcDNA質(zhì)粒的心肌細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)入pcDNA-MAPK6重組質(zhì)粒后,心肌細(xì)胞MAPK6蛋白表達(dá)上調(diào) (t=9.70,P<0.05,圖3C)。IL-33能抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,而轉(zhuǎn)入pcDNA-MAPK6的心肌細(xì)胞,由于MAPK6表達(dá)增加,減弱了IL-33對(duì)H/R的抗凋亡作用(P<0.05,圖3D)。結(jié)果表明,IL-33通過下調(diào)MAPK6表達(dá),減弱H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

圖3 IL-33通過MAPK6減少心肌細(xì)胞凋亡

2.4 IL-33在H/R損傷中參與調(diào)控miR-19a-3p/MAPK6通路 與轉(zhuǎn)入miR-NC的心肌細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)入miR-19a-3p mimic后,抑制了H/R誘導(dǎo)的MAPK6 mRNA (t=8.42,P<0.05,圖4A) 和蛋白(t=5.79,P<0.05,圖4B)表達(dá)上調(diào)。與單純H/R處理的心肌細(xì)胞相比,IL-33預(yù)處理可以抑制H/R誘導(dǎo)的MAPK6 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào) (P<0.05)。與IL-33預(yù)處理相比,IL-33預(yù)處理的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)入miR-NC后,MAPK6表達(dá)無(wú)明顯變化。而IL-33預(yù)處理的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)入miR-19a-3p inhibitor后,MAPK6 mRNA和蛋白的表達(dá)增加 (P<0.05,圖4C、4D),即敲低miR-19a-3p消除了IL-33對(duì)H/R誘導(dǎo)MAPK6表達(dá)上調(diào)的影響。

圖4 IL-33在H/R損傷中參與調(diào)控miR-19a-3p/MAPK6通路

3 討論

急性心肌梗死是導(dǎo)致我國(guó)居民死亡的主要原因之一,盡早達(dá)到有效的心肌再灌注是急性心肌梗死救治的核心。然而,血流的突然開通往往會(huì)引起惡性心律失常、無(wú)復(fù)流,從而導(dǎo)致心肌損傷進(jìn)一步加重,即心肌缺血/再灌注損傷[6-7]。目前認(rèn)為,缺血心肌在血流恢復(fù)后,由于能量代謝障礙、鈣離子超負(fù)荷和自由基大量生成等原因,導(dǎo)致心肌超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理等方面的進(jìn)一步損害,這是導(dǎo)致心肌缺血/再灌注損傷的主要原因[8-9],但其機(jī)制尚不明確。

Micro RNAs(miRNAs)是一類非編碼的單鏈小分子RNA,通過與靶基因mRNAs的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合來負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)[10]。越來越多的證據(jù)表明,miRNAs在心肌I/R損傷中起關(guān)鍵作用[11]。Hinkel等[12]發(fā)現(xiàn),在豬I/R損傷模型中,抗miRNA-21治療可預(yù)防I/R損傷引起的心力衰竭。另有研究發(fā)現(xiàn),在經(jīng)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中,miR-374a-5p水平降低,而miR-374a-5p過表達(dá)可減少心肌H/R損傷[13]。作為miR-17-92基因簇的重要成員,miR-19a首先被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14]。一系列研究證實(shí)了miR-19a在心力衰竭、心肌梗死、心肌纖維化和心肌肥厚等病理生理機(jī)制中起重要作用[15-18]。Sun等[19]研究表明,與陰性對(duì)照組相比,心肌H/R損傷后,miR-19a的表達(dá)明顯減少。本研究也顯示,在H/R損傷后,miR-19a-3p的表達(dá)水平降低。此外,miR-19a-3p mimic轉(zhuǎn)染能增加miR-19a-3p的表達(dá),從而有效抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明,H/R損傷可降低miR-19a-3p,而miR-19a-3p水平的升高可以減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。已知H/R損傷可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,而IL-33同時(shí)具有抗氧化和抗凋亡等心肌保護(hù)作用。在心肌I/R損傷模型中,Rui等[20]證明了外源性IL-33通過抑制PKCβ/JNK通路,減輕I/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,最終減弱心肌細(xì)胞凋亡。Ruisong等[21]研究表明,IL-33通過調(diào)控p38 MAPK和HMGB1信號(hào)通路,抑制心肌細(xì)胞凋亡,減輕心肌I/R損傷。本研究結(jié)果表明,H/R損傷增加心肌細(xì)胞的凋亡,而IL-33以劑量依賴性的方式顯著逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì),這與之前發(fā)表的研究結(jié)論相一致[4]。此外,IL-33增加了心肌miR-19a-3p的表達(dá),這是導(dǎo)致減少H/R損傷的重要原因。既往研究顯示,IL-33對(duì)多種miRNAs具有調(diào)節(jié)作用。Lopetuso等[22]發(fā)現(xiàn),IL-33能夠刺激miR-320的表達(dá),從而促進(jìn)急性結(jié)腸炎中結(jié)腸上皮細(xì)胞的修復(fù)。Zhou等[23]研究顯示,IL-33調(diào)節(jié)miR-128-3p的表達(dá),從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。本研究中,IL-33增加了心肌miR-19a-3p的表達(dá),但其發(fā)生機(jī)制尚不明確。有研究表明,IL-33可抑制I/R損傷中ROS的釋放,而ROS可通過轉(zhuǎn)錄因子p53和NF-κB來調(diào)控某些特定的miRNAs的表達(dá)[24-25]。據(jù)此,推測(cè)IL-33可能通過調(diào)控ROS的激活而影響miR-19a-3p的表達(dá),或直接干預(yù)miR-19a-3p的轉(zhuǎn)錄過程。

MAPKs屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,能被細(xì)胞外多種炎癥因子刺激,進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞存活和凋亡[26]。盡管MAPK6在多種細(xì)胞中均有表達(dá),但由于其缺乏經(jīng)典MAPKs通路中保守的Thr-x-Tyr基序,導(dǎo)致有關(guān)MAPK6激活的確切分子機(jī)制研究甚少[27]。研究表明,IL-33通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路,減少心肌I/R損傷[21],而MAPK6作為非典型MAPK成員之一,其過表達(dá)可促進(jìn)H/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[28]。本研究顯示,H/R損傷增加了MAPK6表達(dá),而IL-33預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)MAPK6的過表達(dá)。根據(jù)生物信息學(xué)分析,本研究,預(yù)測(cè)MAPK6為miR-19a-3p的靶基因,并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)加以證實(shí)。此外,轉(zhuǎn)染miR-19a-3p mimic可顯著抑制MAPK6的表達(dá),減輕心肌細(xì)胞凋亡,而轉(zhuǎn)染miR-19a-3p inhibitor結(jié)果相反。結(jié)果表明,miR-19a-3p通過抑制MAPK6的表達(dá),減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述,本研究證實(shí)了miR-19a-3p/MAPK6通路在IL-33抗H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的重要作用,為心肌H/R損傷提供了新的潛在治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。