喬 婷，戴 璐，張黎光，劉 愚，霍文嚴，賀雪蓮，祁 鵬，路鵬鵬，李峻志

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

花耳屬（Dacryomyces） 隸屬于花耳綱（Dacrymycetes） 花耳目（Dacrymycetales） 花耳科（Dacrymycetaceae），最早于1816 年由NEES 建立，當時只容納了1 個單一的物種[1]。隨著研究的深入，又發(fā)現(xiàn)了一些新種，其屬內物種逐漸增多[2-5]。目前，根據(jù)真菌分類索引（Index Fungorum） 已經(jīng)確定了114 個花耳屬分類群，廣泛分布于世界各地，主要集中于歐洲、美洲、亞洲和大洋洲[6-9]?；ǘ鷮僦械奈锓N相對混雜，其中包括了很多未分類于花耳科中其他屬的類群[10]。隨著分子生物學的發(fā)展，分類學家對花耳科物種的系統(tǒng)發(fā)育關系進行了重新評估，結果表明，花耳屬物種具有高度多樣性，但目前花耳屬的幾個類群和其他屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關系還未有很好的數(shù)據(jù)支持，而且用于區(qū)分不同分支的表型特征有較多重疊[11-12]。因此，在鑒定該屬物種時需謹慎，避免分類混亂。

截至目前，有7 個花耳屬真菌在中國被發(fā)現(xiàn)，包括Dacryomyces dendrocalami Oberw，Dacryomyces duii B.Liu & J.Z.Cao，Dacryomyces Cerebriformis F.Wu & Y.P.Lian，Dacryomyces pengii （B.Liu & L.Fan） A.Savchenko，Dacryomyces Sichuanensis B.Liu& L.Fan，Dacryomyces Sinostenosporus F.Wu & Y.P.Lian 和Dacryomyces Yunnanensis B.Liu & L.Fan。但部分物種僅以形態(tài)學特征作為分類依據(jù)，缺乏分子生物學相關數(shù)據(jù)[5-6，13]。吳峰等[14]于2022 年首次結合形態(tài)學與分子生物學，鑒定了我國境內的2 個花耳屬新種Dacryomyces Cerebriformis F.Wu & Y.P.Lian 和Dacryomyces Sinostenosporus F.Wu & Y.P.Lian，獲得了中國花耳屬樣品的分子生物學數(shù)據(jù)，豐富了花耳屬物種的多樣性。

花耳屬擔子果呈無柄的枕狀、角狀，有時具柄，具有較均勻的菌絲結構，有兩性膜或圓柱形中等分化的不育皮層，膨脹細胞比Heterotextus 少[15]。該屬物種通常生長于死樹、樹樁、倒下的樹干，或被子植物、裸子植物的樹枝上，在木材分解過程中起關鍵作用，同時可引發(fā)褐腐病[16]。目前對花耳屬物種的研究主要集中在分類學階段，對其次生代謝產(chǎn)物及應用所知甚少。MIERAUV 等[17]從花耳屬物種中分離獲得2 種新的抗生素代謝物dacrymenone（1）和VM 3298-2 （2）；其中倍半萜類化合物dacrymenone（1） 表現(xiàn)出較弱的抗菌和抗真菌活性，而VM 3298-2 （2） 表現(xiàn)出細胞毒性和抗真菌活性。BULAT[18]為了解花耳屬部分物種擔子果呈現(xiàn)黃色或橙色的原因進行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著光照強度的增加，色素產(chǎn)生的速度加快，相同光照強度條件下，擔子果顏色趨于一致。以上研究結果為后續(xù)開展花耳屬物種代謝產(chǎn)物的研究提供了思路。

秦嶺地區(qū)大型真菌資源豐富，但花耳屬物種報道較少，通過對采自秦嶺的1 份樣本進行了形態(tài)學和分子生物學鑒定，結果顯示該樣本為Dacrymyces dictyosporus。這是首次在中國境內發(fā)現(xiàn)D.dictyosporus，因此確定其為中國新記錄種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮Dacrymyces dictyosporus （中文名未定） 擔子果樣品，于2021 年11 月5 日采自陜西省寶雞市太白縣太洋公路 “K 14+500” 處的高山草甸（107°27′93.0″E，33°98′87.3″N，海拔2 089 m），編號為20210556。采集后置于硅膠中干燥，后將其保藏于陜西省微生物研究所秦嶺菌物標本館（SXIM） 中。

1.2 形態(tài)學觀察

于自然環(huán)境下對子實體樣本的宏觀形態(tài)和生境進行拍照記錄，并將其置于刻度板上，觀察和記錄擔子果的形態(tài)特征，表面是否具附屬物，受傷后是否變色。詳細描述菌肉顏色、氣味等特征。

1.3 顯微形態(tài)學觀察

將干燥的標本組織手動切片后，使用5%的KOH 復水，在光學顯微鏡下觀察其顯微特征。隨機選取20 個成熟的擔孢子、擔子、皮層菌絲、內部菌絲進行測量和拍照。

1.4 分子生物學分析

1.4.1 DNA 提取及PCR 擴增

采集的樣品帶回實驗室后立即取樣放入DNA 保存液中。進行分子生物學分析時，從DNA 保存液中取出20 mg 新鮮擔子果，在液氮中充分研磨，按照Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司） 提取DNA。使用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 對基因組DNA 進行PCR 擴增。20 μL PCR 反應體系為：2×Mix 10 μL，上游引物（10 μmol·L-1） 1.5 μL，下游引物（10 μmol·L-1） 1.5 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 5 μL。反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸1.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物。

1.4.2 DNA 純化及測序

使用快速瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（上海生工生物工程有限公司） 對PCR 產(chǎn)物進行純化回收，檢測合格后送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用DNASTAR 軟件對雙向測序結果進行質量檢測和拼接[19]。將獲取的ITS 序列在NCBI 中進行BLAST 比對，下載與之一致性較高的序列，以松乳牛肝菌（Suillus pictus） 作為外類群[20]，利用MEGA 5 軟件中的最大似然法，以Kimura-2parameter 模型構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 為1 000 次。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定結果

采集樣本20210556 的形態(tài)特征詳見圖1。

圖1 樣本擔子果形態(tài)Fig.1 The basidiocarp morphology of sample

如圖1 所示，該菌擔子果散生于樹干表面，直徑1～3 cm 不等。幼時膿包狀、角狀或枕狀，呈透明至淺黃色；隨著擔子果生長，逐漸呈扇形，表面腦狀，具柄。新鮮時多呈亮橙色至橙色，軟膠質，干燥時橙黃色至暗橙色。其菌絲、擔孢子顯微結構見圖2。

圖2 樣本顯微結構圖Fig.2 Microstructure diagram of sample

由圖2 可知，擔子果幼時皮層相對清晰，內部菌絲具細長的管腔，隔生，無明顯鎖狀聯(lián)合。擔子棍棒狀近圓柱形，大小為（31～58）μm ×（6～10） μm，成熟后出現(xiàn)分叉；擔孢子寬，呈鈍梭形、蠶蛹形、梨形；頂端通常有小突起，具1～7 個橫隔，經(jīng)5%的KOH 處理后呈黃色；大小為 [（15.2） 19 ～22（26.5）] μm × [（6）8～10 （11）] μm，平均長為20.2 μm，平均寬為8.6 μm，Q 值（擔孢子平均長度與寬度之比） 為2.35。擔孢子可通過胚管萌發(fā)，呈罕見的近球形至寬卵形，大小為（17.0 ～19.5） μm ×（11.5～13.0） μm。

根據(jù)形態(tài)學特征，初步將該物種鑒定為Dacrymyces dictyosporus。該種主要分布于美國、日本、新西蘭、中國等。常于秋季散生于針葉林裸子植物腐木上。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析結果

基于花耳屬12 條ITS 序列（其中11 條序列來自GenBank），以松乳牛肝菌1 條序列（序列編號為AY854069.1） 為外類群構建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 基于ITS 的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

如圖3 所示，試驗樣品20210556 與日本和美國報道的D.dictyosporus （AB712454.1，MK050629.1）序列聚為一支，且支持率高達98%；同時與該屬較相似物種D.chrysospermus 的5 個序列處于不同分支。因此在分子水平上能將Dacrymyces dictyosporus與相似物種D.chrysospermus 明顯區(qū)分開。系統(tǒng)發(fā)育分析結果與形態(tài)學鑒定結果一致。

3 結論與討論

對采自秦嶺的1 個真菌物種的形態(tài)學特征進行了詳細描述，并結合分子生物學手段進行綜合鑒定，顯示該樣本為Dacrymyces dictyosporus。通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，D.dictyosporus 是首次在中國境內被發(fā)現(xiàn)，因此確定其為中國新記錄種。

D.dictyosporus 是花耳屬一個獨特的物種，其擔子果大，厚壁盤孢子，無鎖狀聯(lián)合[8，20]。根據(jù)新鮮擔子果的宏觀形態(tài)特征，樣品與金耳、Tremella mesenterica 相比，其擔子果形狀、顏色、質地等方面較為相似，但擔子和擔孢子的形狀、大小、內部菌絲是否有鎖狀聯(lián)合等方面差異較大。如D.dictyosporus 是由單型菌絲組成，其擔孢子主要呈鈍梭形、梨形，大小為[（22.5）25～28 （30）] μm ×[（9）10～12（13.5）] μm[21]；而金耳和T.mesenterica均是由自身菌絲和寄主菌絲形成二型態(tài)菌絲結構。金耳的酵母狀分生孢子多呈亞球形、寬橢球形，大小為[8.3～9.5（9.7）] μm × [6.8～7.6（8.0）] μm；T.mesenterica 的擔孢子寬，呈橢球形，大小為[13～16（22）] μm ×[9.3～10.6（12.1）] μm[22-23]。

D.dictyosporus 與掌狀花耳（D.chrysospermus）形態(tài)特征十分相似，尤其是擔子果及擔孢子的結構，均會出現(xiàn)少數(shù)近球形擔孢子，但擔子果的形狀和大小及菌絲鎖狀聯(lián)合方式不同。